金劍虹 劉國(guó)新 楊成 任興昌 洪郁芝*

自身免疫性甲狀腺炎（AIT）屬于一種器官特異性疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚無(wú)統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)，其以血清中大量甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體（TPOAb）伴或不伴甲狀腺球蛋白抗體（TgAb）升高為主要表現(xiàn)，病理學(xué)?？梢?jiàn)甲狀腺組織中以淋巴細(xì)胞為主的細(xì)胞浸潤(rùn)［1］。近年來(lái)其發(fā)病率逐年上升，全世界發(fā)病率已接近1‰［2］。常用治療方法有甲狀腺激素替代治療、糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑治療。研究發(fā)現(xiàn)，AIT發(fā)病機(jī)制可能與T細(xì)胞主導(dǎo)的Th1/Th2免疫失衡密切相關(guān)［3］。本文探討復(fù)方夏枯草對(duì)EAT大鼠的療效及對(duì)Th1/Th2相關(guān)因子的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)SD雌性大鼠40只，4～5周齡，體重90～110g，購(gòu)于上海BK公司，動(dòng)物合格證：SCXK（滬）2013-0116。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SYXK（浙）2013-0184。

1.2 藥物及試劑 豬甲狀腺球蛋（PTg）、完全弗氏佐劑（CFA）、不完全弗氏佐劑（IFA）、碘化鈉（NaI），以上試劑均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。大鼠TPOAb、大鼠TgAb、大鼠IL-2、大鼠IL-10ELISA試劑盒，以上試劑均為美國(guó)ASSAY 公司產(chǎn)品。磷酸緩沖鹽溶液（PBS）。YJ-857型凈化工作臺(tái)、Bio-Tek ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)儀、電子秤、37℃電熱恒溫箱、低溫冰箱（-20℃、-80℃）、微量移液器，及小試管、離心管、玻璃器皿、吸水紙等。

1.3 動(dòng)物模型建立 大鼠購(gòu)入后適應(yīng)性喂養(yǎng)7d，按參考文獻(xiàn)［4-5］造模方法，對(duì)模型組大鼠飲用配制的0.064%高碘飲水（注意避光保存），食用普通飼料；每只大鼠予以0.2ml完全乳化制劑配制的（合PTg100μg）合劑，分別對(duì)其四肢內(nèi)側(cè)、頸部背部、足蹠等多處進(jìn)行皮下注射，1次/周，共2次，此為初次免疫。第3周開(kāi)始使用不完全乳化制劑配制的合劑0.2ml，繼續(xù)按上述方法對(duì)大鼠進(jìn)行多點(diǎn)皮下注射乳化抗原，1次/周，直至第8周結(jié)束，共8次，每次皮下注射注意更換至臨近位置，整個(gè)免疫過(guò)程密切觀察大鼠生命體征變化，及時(shí)做出調(diào)整。第8次加強(qiáng)免疫末，稱取大鼠體重，按照隨機(jī)數(shù)字表法，隨機(jī)抽取3只造模大鼠，麻醉后行腹主動(dòng)脈取血，離心采取血清進(jìn)行TPOAb、TgAb指標(biāo)檢測(cè)。未干預(yù)大鼠（對(duì)照組）予以相同劑量的脂肪乳多點(diǎn)皮下注射，飲用蒸餾水及普通大鼠飼料。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 造模成功后將造模組27只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法均分為模型組、中藥低劑量組、中藥高劑量組三組，中藥各組大鼠使用配制好相對(duì)應(yīng)濃度的中藥，按體重?fù)Q算進(jìn)行灌胃治療（中藥低劑量組予復(fù)方夏枯草4.675g/kg，中藥高劑組予復(fù)方夏枯草9.35g/kg），模型組及對(duì)照組均使用按體重?fù)Q算的蒸餾水灌胃治療，注意大鼠的抓定及灌胃方法，同時(shí)密切注意大鼠一般情況變化，及時(shí)做出必要的調(diào)整。

1.5 觀察指標(biāo) 大鼠中藥治療8周后，戊巴比妥麻醉后進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血，靜置30min后3500r/min離心15min，獲取血清，采用酶聯(lián)免疫（ELISA）法檢測(cè)大鼠血清TPOAb、TgAb、IL-2、IL-10水平。各指標(biāo)檢測(cè)方法大致相同，先后順序?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)品加樣、加樣、加酶、溫育、配液、洗滌、顯色、終止、測(cè)定9個(gè)步驟，后在回歸方程中計(jì)算出待測(cè)血清指標(biāo)濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用IBM SPSS Statistics 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布各組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

干預(yù)過(guò)程中先后有4只大鼠因灌胃時(shí)食管破裂感染死亡，退出實(shí)驗(yàn)，其余大鼠持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

2.1 各階段大鼠TPOAb、TgAb比較 （1）造模結(jié)束時(shí)，利用隨機(jī)數(shù)字表法，從模型組30只大鼠中隨機(jī)選取10只大鼠，與對(duì)照組比較，顯示模型組兩抗體水平均明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.01），提示本次實(shí)驗(yàn)造模成功。見(jiàn)表1。（2）中藥干預(yù)4周時(shí)，中藥低劑量組與模型組比較，TPOAb、TgAb顯著降低（P＜0.01）；中藥高劑量組與模型組比較，TPOAb、TgAb降低（P＜0.05）。（3）中藥干預(yù)8周時(shí)，中藥低劑量組、中藥高劑量組與模型組比較，TPOAb、TgAb顯著降低（P＜0.01）。見(jiàn)表2、3。

表1 模型組與正常對(duì)照組TPOAb、TgAb比較（±s）

表1 模型組與正常對(duì)照組TPOAb、TgAb比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05

組別 大鼠數(shù)（只） 血清TPOAb（IU/ml） 血清TgAb（IU/ml）模型組 10 11.28±1.79* 31.49±2.68*對(duì)照組 10 4.27±1.52 16.21±2.26

表2 中藥干預(yù)4周時(shí)各組TPOAb、TgAb變化比較（±s）

表2 中藥干預(yù)4周時(shí)各組TPOAb、TgAb變化比較（±s）

注：與模型組比較*P＜0.01，#P＜0.05

組別 大鼠數(shù)（只） TPOAb（IU/ml） TgAb（IU/ml）模型組 8 11.91±2.51 29.56±2.49中藥低劑量組 8 8.90±1.33* 23.83±1.63*中藥高劑量組 8 9.79±1.33# 24.12±1.49#

表3 中藥干預(yù)8周時(shí)各組TPOAb、TgAb變化比較（±s）

表3 中藥干預(yù)8周時(shí)各組TPOAb、TgAb變化比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.01

組別 大鼠數(shù)（只） TPOAb（IU/ml） TgAb（IU/ml）模型組 8 11.70±2.31 30.16±2.47中藥低劑量組 8 7.10±1.38* 22.16±2.42*中藥高劑量組 8 8.14±1.17* 21.58±2.03*

2.2 各階段大鼠IL-2、IL-10比較 干預(yù)4周和8周時(shí)IL-2治療組較模型組均有所緩解（P＜0.01）。而IL-10治療組較模型組均有所升高（P＜0.01）。

表4 中藥干預(yù)4周時(shí)各組IL-2、IL-10變化比較（±s）

表4 中藥干預(yù)4周時(shí)各組IL-2、IL-10變化比較（±s）

注：與對(duì)照組，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01；▲P＜0.05

組別 大鼠數(shù)（只） IL-2（ng/L） IL-10（ng/L）模型組 8 269.50±26.70* 19.23±2.02*中藥低劑量組 8 209.60±22.20# 24.06±2.51▲中藥高劑量組 8 206.87±23.20# 22.97±3.43▲對(duì)照組 8 127.71±17.92 36.40±3.70

表5 中藥干預(yù)8周時(shí)IL-2、IL-10變化比較（±s）

表5 中藥干預(yù)8周時(shí)IL-2、IL-10變化比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01

組別 大鼠數(shù)（只） IL-2（ng/L） IL-10（ng/L）模型組 8 275.94±16.89* 19.28±1.38*中藥低劑量組 8 181.19±20.89# 26.88±1.90#中藥高劑量組 8 193.15±14.27# 26.80±2.46#對(duì)照組 8 137.30±9.64 35.17±1.45

3 討論

自身免疫性甲狀腺炎（AIT）是一種器官特異性疾病，發(fā)病率逐年增加，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚無(wú)明確病因，推測(cè)其可能原因與基因、環(huán)境、生活飲食、工作壓力增加等相關(guān)。通過(guò)經(jīng)典的造模方法［4-5］多次定量皮下注射豬甲狀腺球蛋白和持續(xù)高碘飲水作用于模型大鼠，檢測(cè)大鼠血清TPOAb、TgAb水平，造模大鼠出現(xiàn)雙抗體較對(duì)照組明顯升高，提示EAT模型建立成功。

多數(shù)學(xué)者［6-7］認(rèn)為T(mén)h1/Th2失衡是AIT發(fā)病的主要原因，若能在Th細(xì)胞亞群選擇性分化前后進(jìn)行干預(yù)，就有可能預(yù)防甚至終止AIT的發(fā)生和發(fā)展。已經(jīng)證實(shí)存在多種細(xì)胞因子：IL-1α、IL-1b、IL-2、IL-4，IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、TNF-α和IFN-γ在炎癥細(xì)胞和甲狀腺濾泡細(xì)胞內(nèi)，其中以表達(dá)IL-2和IFN-γ為主的Th1細(xì)胞可激發(fā)遲發(fā)型超敏反應(yīng)，介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答；以表達(dá)IL-4、IL-10、IL-13為主的Th2細(xì)胞可促進(jìn)抗體產(chǎn)生，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。研究認(rèn)為AIT患者的Th1/Th2細(xì)胞失衡往Th1方向偏離，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血清中白細(xì)胞介素IL-2、IL-10的變化，IL-2在造模結(jié)束時(shí)顯示其較正常對(duì)照組明顯升高（P＜0.01），在治療干預(yù)4周和8周時(shí)治療組較模型組均有所緩解（P＜0.01）。而IL-10有類(lèi)似相反表現(xiàn)，在造模結(jié)束時(shí)顯示其較正常對(duì)照組明顯降低（P＜0.01），在治療干預(yù)4周和8周時(shí)治療組較模型組均有所升高（P＜0.01）。

在我國(guó)，中醫(yī)有多種方劑用于AIT治療［8］。其中夏枯草是比較重要的藥物之一，夏枯草性寒，味甘、辛、微苦，富含苯丙素和三環(huán)萜類(lèi)、黃酮、酚酸、多糖等，具有抗炎、抗菌、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗細(xì)胞毒、降血糖、抗病毒以及抗腫瘤等作用，其中免疫調(diào)節(jié)、抗炎抑菌作用比較突出，療效較好［9-11］。黃芪主要成分是黃芪苷、黃芪多糖、氨基酸等，其中前兩者占主要成分，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)黃芪苷具有抗感染、抗氧化、調(diào)節(jié)血糖、調(diào)節(jié)人體免疫力等作用。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其主要活性成分黃芪甲苷可以明顯降低患者血液中IFN-γ和IL-10的水平，通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體激素作用和免疫抑制劑的抑制作用，降低細(xì)胞凋亡的水平，調(diào)節(jié)T 細(xì)胞亞群，使Th1/Th2 細(xì)胞比例失衡趨于正常［12-14］。另外本方劑中牛蒡子、黨參亦有一定程度的抗氧化、免疫調(diào)節(jié)的作用［15-17］。結(jié)合當(dāng)前AIT發(fā)病機(jī)制的主流理論免疫失衡學(xué)說(shuō)，以及各藥的現(xiàn)代研究、本實(shí)驗(yàn)的治療效果，推斷夏枯草、黃芪、黨參可能是從免疫調(diào)節(jié)方面達(dá)到治療AIT目的，相關(guān)文獻(xiàn)［12，16，18］也支持該觀點(diǎn)。

綜上所述，TPOAb、TgAb造模后的升高，干預(yù)后的降低，提示該復(fù)方制劑確實(shí)可以緩解AIT大鼠的免疫損傷，有一定的治療效果。IL-2、IL-10的變化與文獻(xiàn)［3］中提示的Th1/Th2失衡相符合，進(jìn)一步論證AIT的Th1/Th2免疫失衡學(xué)說(shuō)，亦證實(shí)復(fù)方夏枯草可以改善AIT大鼠的免疫失衡，達(dá)到治療效果。而干預(yù)8周時(shí)較干預(yù)4周時(shí)各指標(biāo)改善進(jìn)度緩解，推測(cè)該復(fù)方制劑可能在早期干預(yù)療效較佳，在之后一段時(shí)間呈現(xiàn)一定程度的平臺(tái)期，繼續(xù)干預(yù)可能會(huì)出現(xiàn)進(jìn)一步的改善，其原因考慮AIT本身為易忽視的慢性疾病，早期較長(zhǎng)一段時(shí)間可能呈現(xiàn)血清學(xué)改變，而病理學(xué)改變滯后，且可能滯后較長(zhǎng)時(shí)間。