王媛媛 吳旭萍 林勝友*

放射性肺損傷主要包括放射性肺炎和放射性肺纖維化兩個(gè)階段。肌成纖維細(xì)胞在放射性肺纖維化過程中起重要作用，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程為組織纖維形成過程中的中介過程［1-2］。其特征在于上皮蛋白如E-鈣粘蛋白（E-cadherin）和蛋白質(zhì)的缺失，從而獲得新的間質(zhì)標(biāo)志物，包括波形蛋白（Vimentin）和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA），而下調(diào)E-鈣粘蛋白表達(dá)可通過轉(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)抑制，包括snail蛋白［3］。ERK/GSK3β/snail通路是新近發(fā)現(xiàn)的放射性肺纖維化相關(guān)EMT的重要信號(hào)調(diào)控通路［4］，而GSK3β/snail復(fù)合體能被上游磷酸化的ERK解離，snail被釋放，恢復(fù)活性。沉默大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞ERK基因，能夠減弱GSK3β復(fù)合物的解離，從而減少有活性的snail，調(diào)控EMT過程。本文探討EMT過程中加味麻杏石甘湯對(duì)ERK/GSK3β/snail信號(hào)通路的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞 清潔級(jí)SD大鼠18只，體重約200～250g，雌雄各半，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（瀘）2013-0016。小鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞由上海中科院提供。

1.2 中藥含藥血清的制備 加味麻杏石甘湯水煎劑組方：炙麻黃9g、石膏18g、杏仁12g、銀花9g、甘草6g 等組成，委托浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院采購并制備，濃縮為含生藥2.44g/ml的中藥藥液。分裝于等量真空中藥袋中，4℃保存，備用。含藥血清的制備：將18只清潔級(jí)大鼠隨機(jī)分為2組，正常對(duì)照組6只，中藥組12只。正常對(duì)照組給予生理鹽水灌胃，中藥組給予中藥制劑灌胃。中藥組大鼠按19.5g/d（4ml）中藥給予灌胃（相當(dāng)于成人劑量的15倍），用于制備含藥血清。2次/d，連續(xù)給藥3d，末次給藥2h后采血。3d后以10%水合氯醛腹腔麻醉，在腹主動(dòng)脈取血，分別制備血清，滅活、過濾除菌、分管，同組血清混合，分裝至1ml離心管中，-20℃凍存，4周使用，避免反復(fù)凍融。

1.3 試劑及儀器 主要試劑：ERK抑制劑：U0126（S1102，Selleck）；P-GSK3β（Ab75745，abcam 公司）；E-cadherin（#14472）、Vimentin（#5741）、α-SMA（#19245）、ERK（#9102）、P-ERK（#9101）、Snail（#3879）、GSK3β（#12456）、GAPDH（#5174） 均購自CST公司。主要儀器：細(xì)胞培養(yǎng)耗材（TR4001、TR4002、TR5000，TRUELINE）；透射電子顯微鏡（1230，JEM）；激光共聚焦顯微鏡（fv1000，奧林巴斯）。

1.4 細(xì)胞模型的建立 采用總劑量5Gy，3.64Gy/min將小鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞進(jìn)行放射線照射，建立模型［5］。

1.5 分組 實(shí)驗(yàn)分為5組：正常大鼠血清組（使用含6%正常大鼠血清配置的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞；模型+正常大鼠血清組（細(xì)胞照射后使用含6%正常大鼠血清配置的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞）；模型+正常大鼠血清+ERK抑制劑組（細(xì)胞照射后使用含6%正常大鼠血清配置的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，并加入10μM U0126處理細(xì)胞24h）；模型+含藥大鼠血清組（細(xì)胞照射后使用含6%含藥大鼠血清清配置的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)）；模型+含藥大鼠血清+ERK抑制劑組（細(xì)胞照射后使用含6%含藥大鼠血清配置的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，并加入10μM U0126處理細(xì)胞24h）。

1.6 觀察指標(biāo) Western blot檢測(cè)細(xì)胞表型蛋白及信號(hào)通路主要蛋白；激光共聚焦顯微鏡觀測(cè)snail轉(zhuǎn)核。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用（±s）表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Western blot檢測(cè)細(xì)胞表型蛋白及信號(hào)通路主要蛋白比較 （1）小鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞snail水平：與正常血清組比較，模型+大鼠血清組snail上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型+正常大鼠血清組比較，模型+正常大鼠血清+siNC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），模型+含藥血清組、模型+正常大鼠血清+ERK抑制劑組、模型+含藥血清+ERK抑制劑組，snail濃度明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型+正常大鼠血清+ERK抑制劑組比較，模型+含藥血清+ERK抑制劑組snail濃度下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（2）小鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞E-cadherin水平：與正常血清組比較，模型+大鼠血清組E-cadherin濃度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型+正常大鼠血清組比較，模型+正常大鼠血清+siNC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型+正常大鼠血清+ERK抑制劑組比較，模型+含藥血清+ERK抑制劑組E-cadherin濃度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（3）小鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞p-GSK-3β水平：與正常血清組比較，模型+大鼠血清組p-GSK-3β上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型+正常大鼠血清組比較，模型+正常大鼠血清+siNC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），模型+含藥血清組、模型+正常大鼠血清+ERK抑制劑組、模型+含藥血清+ERK抑制劑組，p-GSK-3β濃度下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型+正常大鼠血清+ERK抑制劑組比較，模型+含藥血清+ERK抑制劑組p-GSK-3β下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（4）小鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞p-ERK水平：與正常血清組比較，模型+大鼠血清組p-ERK上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型+正常大鼠血清組比較，模型+正常大鼠血清+siNC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），模型+含藥血清組、模型+正常大鼠血清+ERK抑制劑組、模型+含藥血清+ERK抑制劑組，p-ERK濃度明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型+正常大鼠血清+ERK抑制劑組比較，模型+含藥血清+ERK抑制劑組ERK濃度稍降低，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1、表1。

圖1 Western blot檢測(cè)細(xì)胞表型蛋白及信號(hào)通路主要蛋白

表1 Western blot檢測(cè)細(xì)胞表型蛋白及信號(hào)通路主要蛋白灰度值（±s）

表1 Western blot檢測(cè)細(xì)胞表型蛋白及信號(hào)通路主要蛋白灰度值（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

snail E-cadherin p-GSK-3β p-ERK空白對(duì)照組 1.00±0.38 1.00±0.02 1.00±0.13 1.00±0.23模型對(duì)照組 3.22±0.27* 0.28±0.12* 2.65±0.22* 2.78±0.29*模型+正常血清+ERK抑制劑組 2.56±0.38△ 0.54±0.08△ 2.08±0.16△△ 2.14±0.21△△模型+含藥血清組 1.16±0.16△ 0.38±0.06△ 1.22±0.20△△ 1.69±0.14△△模型+含藥血清+ERK抑制劑組 1.83±0.20△△ 0.76±0.10△△ 1.98±0.10△△ 2.02±0.18△△

2.2 激光共聚焦顯微鏡觀測(cè)snail轉(zhuǎn)核 激光共聚焦觀察snail轉(zhuǎn)核結(jié)果顯示，模型組與空白對(duì)照組比較，snail明顯增加。含藥血清組與模型組比較，snail減少，加入ERK抑制劑及沉默TGF-β基因后，snail表達(dá)減少。

3 討論

放射性肺損傷的發(fā)生發(fā)展過程復(fù)雜，包含一系列細(xì)胞和分子的變化，其機(jī)制包括肺泡上皮細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞損傷，肺組織分泌大量的炎性細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子，吸引更多的炎性細(xì)胞聚集，而炎性損傷部位周圍有促纖維細(xì)胞因子表達(dá)和成纖維細(xì)胞增殖分化，形成肺纖維化［6-8］。

中醫(yī)認(rèn)為，放射線屬于熱邪，首犯肺臟，肺為嬌臟，感受火邪，耗氣傷陰，煉液成痰，灼血成瘀，致肺燥陰傷、瘀血內(nèi)阻，結(jié)合研究放射性肺纖維化熱毒壅盛-氣陰虧虛-痰瘀互結(jié)的病機(jī)演變過程，放射性肺纖維化治療多以清熱解毒、養(yǎng)陰生津、化痰祛瘀法為指導(dǎo)思想［9］。麻杏石甘湯出自《傷寒論》，方中用麻黃宣肺，石膏清肺，杏仁降利肺氣，甘草益氣和中，以達(dá)辛涼解表、清肺平喘功效，前期有研究采用麻杏石甘湯為基礎(chǔ)，加桑白皮、金銀花等組成加味麻杏石甘湯能夠明顯減輕放射性炎性損傷［10］。

在EMT過程中，上皮細(xì)胞逐漸失去極性并獲得間充質(zhì)，具有增強(qiáng)遷移潛力的特征，α-SMA、間質(zhì)蛋白被釋放對(duì)肌成纖維細(xì)胞活化的反應(yīng)并給予強(qiáng)烈的反應(yīng)收縮性能［11］。E-cadherin是一種上皮標(biāo)記物，主要參與細(xì)胞間相互作用的維持，保持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整性［12］。Snail是一個(gè)E-cadherin的調(diào)節(jié)劑，幫助上皮細(xì)胞發(fā)育，進(jìn)入成纖維細(xì)胞樣遷移間充質(zhì)細(xì)胞［13］。糖原合成酶激酶 3β（GSK-3β）可以通過與snail形成復(fù)合體，維持上皮細(xì)胞形態(tài)，促進(jìn)其蛋白酶的降解來抑制 Snail的表達(dá)水平［14］。GSK3β 可被包括 PI3K/AKT［15］和 ERK1/2 MAPK［16］在內(nèi)的多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路滅活，從而上調(diào)Snail的表達(dá)水平，誘導(dǎo) EMT。有研究顯示ERK可磷酸化滅活GSK3β（Ser9 位點(diǎn)）［17］，snail被釋放，恢復(fù)活性。在本實(shí)驗(yàn)中，為了確定ERK軸信號(hào)是否影響GSK3β磷酸化，從而選擇ERK抑制劑U0126。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光分析顯示輻射增加GSK3β（S9）的磷酸化并被刺激細(xì)胞中的snail核移位。數(shù)據(jù)表明輻射增強(qiáng)GSK3β磷酸化絲氨酸9活性部位，導(dǎo)致其與snail分離，從而促進(jìn)snail的核移植。

加味麻杏石甘湯減弱輻射誘導(dǎo)的磷酸化GSK3β和改變細(xì)胞中Snail，α-SMA和E-鈣粘蛋白的蛋白水平（P＜0.05），EMT抑制劑作用于模型+正常血清組后GSK-3β、snail濃度明顯下降（P＜0.05），加入ERK抑制劑的含藥血清作用后，GSK-3β、snail仍較加入抑制劑的正常血清組有所下降（P＜0.05），且ERK濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與中藥多靶點(diǎn)調(diào)控多種信號(hào)通路有關(guān)，即加味麻杏石甘湯也有可能通過其他途徑調(diào)控GSK-3β/snail通路，需要進(jìn)一步研究。