朱 寧，于 寧，朱 月，韋玉龍，張嘉穎，孫愛(ài)東*

（北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083）

畢赤酵母是引起酸性果汁腐敗變質(zhì)的主要微生物之一[1]，對(duì)果汁產(chǎn)業(yè)的發(fā)展極為不利。高壓脈沖電場(chǎng)（pulsed electric field，PEF）技術(shù)作為一種新型非熱加工技術(shù)，在保證食品安全的同時(shí)，能最大程度地保持其原有的色、香、味及營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)[2-3]。PEF是通過(guò)高電壓獲得高場(chǎng)強(qiáng)，高壓脈沖發(fā)生器成本較高，長(zhǎng)期使用易產(chǎn)生氧化性物質(zhì)等[4]，這些問(wèn)題限制了PEF在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用，因此，實(shí)現(xiàn)低電壓下的脈沖電場(chǎng)殺菌成為當(dāng)前PEF研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

隨著微機(jī)電技術(shù)的成熟和發(fā)展，生物芯片和微芯片在脈沖電場(chǎng)領(lǐng)域的應(yīng)用得到了廣泛關(guān)注。目前，基于微芯片的脈沖電場(chǎng)技術(shù)（microchip pulsed electric field，MPEF）已被應(yīng)用于細(xì)胞融合、細(xì)胞捕獲[5]、裂解和電轉(zhuǎn)染[6]等生物學(xué)領(lǐng)域。因?yàn)槲⑿酒哂形⒚准?jí)的電極間距，較傳統(tǒng)PEF處理室的間距減少幾十倍至上百倍，達(dá)到相同的殺菌效果所需電壓大幅降低[7]；微芯片的高表面體積比有利于散熱。因此，借助微芯片研究脈沖電場(chǎng)殺菌有十分理想的發(fā)展空間。近年來(lái)，已有研究者將目光投入到MPEF殺菌技術(shù)研究中[8]，但仍處于初期平臺(tái)優(yōu)化階段，在前人研究基礎(chǔ)上，本課題組研發(fā)了一種新型MPEF技術(shù)，實(shí)現(xiàn)低電壓下對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和釀酒酵母較好的殺滅效果[9]。

細(xì)胞膜不可逆破損和細(xì)胞內(nèi)化合物的泄漏是PEF導(dǎo)致微生物死亡的關(guān)鍵因素[10-11]，此外，脈沖電場(chǎng)引起細(xì)胞膜成分的變化也被廣泛關(guān)注[12-13]。但是，目前關(guān)于PEF的致死機(jī)理尚沒(méi)有統(tǒng)一定論，微生物整體基因調(diào)控的研究較少。MPEF技術(shù)由于微芯片的加入極大地降低了殺菌電壓，盡管同屬于脈沖電場(chǎng)殺菌，但微處理室是否對(duì)微生物有不同的影響仍有待驗(yàn)證。為更好地利用MPEF技術(shù)，充分了解其殺菌機(jī)理是十分必要的。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq）根據(jù)基因組的測(cè)序信息和注釋情況，從整個(gè)轉(zhuǎn)錄水平上反映細(xì)胞中基因表達(dá)情況及其調(diào)控機(jī)制，可用來(lái)研究特定生物過(guò)程中基因表達(dá)的差異[14]。借助該技術(shù)，前人已經(jīng)成功闡明小檗堿對(duì)禽源大腸桿菌的抑菌作用[15]、黃芩水煎劑對(duì)尿道致病性大腸埃希氏菌的作用機(jī)理[16]、釀酒酵母乙酸耐性的分子機(jī)制[17]等，但在脈沖電場(chǎng)殺菌方面類似研究較少。

本研究分析MPEF技術(shù)對(duì)畢赤酵母的致死效果和處理前后基因表達(dá)的變化，結(jié)合生物信息學(xué)方法對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行注釋、分類和相關(guān)功能分析，探究該技術(shù)的殺菌機(jī)理，為MPEF技術(shù)應(yīng)用于果汁殺菌提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

畢赤酵母（Pichia）為本實(shí)驗(yàn)室從藍(lán)莓汁中分離純化的1 株腐敗菌。

YPD肉湯培養(yǎng)基、YPD瓊脂培養(yǎng)基 北京奧博星生物科技有限公司；總RNA提取試劑盒、DNase I、TIANScript cDNA試劑盒、Real Master Mix（SYBR Green）試劑盒 天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-30KBS蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；TS-100B恒溫?fù)u床 上海捷呈實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；3H16RI冷凍離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司；HiSeq2000測(cè)序平臺(tái) 美國(guó)Illumina公司；ABI 7500 Fast實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time fluorescence quantification-polymerase chain reaction，q-PCR）儀美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；方波脈沖電源 上海索宜電子科技有限公司。

實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的連續(xù)MPEF處理系統(tǒng)主要由定制的方波脈沖電源和自行設(shè)計(jì)的微芯片（圖1）組成[9]。脈沖寬度設(shè)定為0.20 ms，每次處理前后，用75%乙醇溶液清洗通道，然后用無(wú)菌水沖洗。

圖1 微芯片示意圖Fig. 1 Schematic of the microchip

1.3 方法

1.3.1 畢赤酵母的培養(yǎng)

YPD肉湯和瓊脂培養(yǎng)基于121 ℃滅菌20 min，將從腐敗藍(lán)莓汁中分離出的畢赤酵母菌株接種到50 mL無(wú)菌YPD肉湯培養(yǎng)基中，32 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)12 h至對(duì)數(shù)中后期，重復(fù)活化2 代待用，菌液濃度為106～107CFU/mL。對(duì)數(shù)中后期細(xì)胞分裂迅速、生長(zhǎng)旺盛，因此該時(shí)期細(xì)胞對(duì)電場(chǎng)的變化更為敏感[9]，選擇培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中后期的畢赤酵母細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究更具代表性。

1.3.2 致死和亞致死損傷的測(cè)定

通過(guò)平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)MPEF處理后畢赤酵母死亡和亞致死情況。非選擇性培養(yǎng)基為YPD瓊脂培養(yǎng)基，向該培養(yǎng)基中添加4.5% NaCl溶液作為選擇性培養(yǎng)基[18]。通過(guò)比較不同電壓（100～500 V）和脈沖個(gè)數(shù)（20～100）下細(xì)胞的對(duì)數(shù)下降值，研究MPEF技術(shù)對(duì)畢赤酵母的鈍化效果。對(duì)數(shù)下降值（lgS）[19]計(jì)算見(jiàn)式（1）：

式中：N0為處理前非選擇性或選擇性培養(yǎng)基中存活的微生物數(shù)/（CFU/mL）；N1為處理后在相同培養(yǎng)基中存活的微生物數(shù)/（CFU/mL）。

1.3.3 畢赤酵母總RNA的提取和測(cè)序

提取樣品總RNA并使用DNase I消化DNA后，用Oligo d（T）磁珠純化總RNA中的mRNA，向得到的mRNA中加入適量打斷試劑高溫條件下使其片段化，再以片段后的RNA為模板，合成cDNA，經(jīng)過(guò)磁珠純化、末端修復(fù)、3’末端加堿基A、加測(cè)序接頭后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而完成整個(gè)文庫(kù)制備工作，文庫(kù)質(zhì)控合格后進(jìn)行測(cè)序、分析。

1.3.4 q-PCR驗(yàn)證

選擇6 個(gè)顯著表達(dá)的差異基因進(jìn)行q-PCR分析，引物序列見(jiàn)表1，根據(jù)TIANScript cDNA試劑盒說(shuō)明合成cDNA第1鏈，采用Real Master Mix（SYBR Green）試劑盒，ABI 7500 FAST q-PCR系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

表1 q-PCR引物Table 1 Primers used for real-time quantitative PCR

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 基因定量

借助RSEM工具進(jìn)行基因表達(dá)定量，通過(guò)Paired-end關(guān)系、reads長(zhǎng)度、質(zhì)量值等，基于最大期望算法建立最大似然的豐富度模型，結(jié)果以Fragment PerKilo Million（FPKM）表示，計(jì)算見(jiàn)式（2）：

式中：FPKM為基因A表達(dá)量；C為比對(duì)到基因A的reads數(shù)；L為fragment長(zhǎng)度；N為比對(duì)到參考基因的總reads數(shù)。

1.4.2 差異表達(dá)基因

采用edgeR軟件包進(jìn)行差異表達(dá)基因的分析，當(dāng)基因表達(dá)量在不同樣品間具有差異且統(tǒng)計(jì)分析中假陽(yáng)性率小于0.05，同時(shí)差異倍數(shù)在2 倍以上時(shí)，認(rèn)為其在2 個(gè)不同樣品中具有顯著差異表達(dá)。

1.4.3 差異基因深入挖掘

把所有差異表達(dá)基因在基因本體（gene ontology，GO）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行各個(gè)term映射，計(jì)算每個(gè)term基因數(shù)目，然后應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個(gè)基因組背景相比，在差異表達(dá)基因中顯著富集的GO條目，以校正后的P不大于0.05為閾值。通過(guò)GO功能顯著性富集分析可確定差異表達(dá)基因行使的主要生物學(xué)功能。京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）[20]是有關(guān)Pathway的主要公共數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)Pathway顯著性富集能確定差異表達(dá)基因參與的主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

1.4.4 q-PCR結(jié)果計(jì)算

根據(jù)q-PCR原始檢測(cè)結(jié)果，按照2－ΔΔCt法計(jì)算各樣品目的基因相對(duì)定量結(jié)果，見(jiàn)式（3）：

式中：F為目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

上述所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，借助Origin 9.0軟件對(duì)致死和亞致死損傷結(jié)果進(jìn)行作圖，采用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MPEF對(duì)畢赤酵母的致死與亞致死效果

圖2 電壓（a）和脈沖個(gè)數(shù)（b）對(duì)畢赤酵母鈍化效果的影響Fig. 2 Logarithmic decline of P. rhodanensis with respect to voltage (a)and pulse number (b)

由圖2可知，畢赤酵母在選擇性培養(yǎng)基中對(duì)數(shù)下降值更高，特別是在200 V電壓、80 個(gè)脈沖條件下，畢赤酵母在選擇性培養(yǎng)基中下降了（3.56±0.09）個(gè)對(duì)數(shù)值，而在非選擇性培養(yǎng)基中僅下降了（2.81±0.11）個(gè)對(duì)數(shù)值，兩者的差值證明了亞致死細(xì)胞的存在[21]。Wang Mansheng等[22]研究PEF技術(shù)對(duì)釀酒酵母的影響，結(jié)果表明PEF處理可以導(dǎo)致細(xì)胞死亡、亞致死或者無(wú)明顯損傷。如圖2a所示，隨著電壓的增加，MPEF對(duì)微生物的致死效果顯著增強(qiáng)（P＜0.05），這與Zhao Wei等[23]的研究結(jié)果一致。當(dāng)電壓達(dá)到400 V時(shí)，畢赤酵母在2 種培養(yǎng)基中的對(duì)數(shù)下降值無(wú)明顯差異，說(shuō)明400 V電壓對(duì)畢赤酵母有很好的致死效果。此外，畢赤酵母的致死效果隨著脈沖個(gè)數(shù)的增加呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，如圖2b所示，當(dāng)脈沖個(gè)數(shù)為80時(shí)，亞致死細(xì)胞數(shù)接近0，此后，持續(xù)增加脈沖個(gè)數(shù)，致死效果沒(méi)有顯著變化。因此，MPEF在400 V電壓、80 個(gè)脈沖條件下，可以很好地殺滅畢赤酵母。

2.2 畢赤酵母差異表達(dá)基因的一般分析

通過(guò)對(duì)MPEF處理前后畢赤酵母轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，對(duì)所有基因的表達(dá)量繪制散點(diǎn)圖，結(jié)果如圖3所示，縱坐標(biāo)為差異顯著性，橫坐標(biāo)為在不同條件下基因表達(dá)變化倍數(shù)，灰色為差異變化不顯著基因，共計(jì)16 610 個(gè)，紅色和藍(lán)色為差異變化顯著基因，共計(jì)794 個(gè)，其中上調(diào)基因361 個(gè)，下調(diào)基因433 個(gè)。對(duì)差異基因的表達(dá)量進(jìn)行l(wèi)og2處理，然后根據(jù)處理后的表達(dá)量進(jìn)行樣品間的聚類分析（圖4）。

圖4 差異基因的聚類圖Fig. 4 Cluster diagram of differentially expressed genes

由表2可知，差異基因的GO功能富集主要集中在細(xì)胞成分（6 706 條）、分子功能（4 854 條）和生物過(guò)程（15 860 條）3 個(gè)方面。參與三羧酸循環(huán)和小亞甲基RNA、丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)、核仁、大亞基前體、膜的完整性、異檸檬酸脫氫酶活性、ATP酶活性、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、核酸酶活性等多種功能的基因進(jìn)行極顯著差異表達(dá)。對(duì)MPEF處理前后畢赤酵母差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG顯著性富集分析（表2），由于電場(chǎng)對(duì)微生物的作用，導(dǎo)致三羧酸循環(huán)、代謝和生物合成等發(fā)生顯著性變化。

表2 顯著富集的9 條代謝通路Table 2 9 Metabolic pathways significantly enriching differentially expressed genes

2.3 q-PCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)上述GO和KEEG富集分析，選取各條目和代謝通路中顯著變化，且表達(dá)量較多的6 個(gè)差異基因，它們主要參與糖代謝、RNA代謝和氨基酸代謝，利用q-PCR對(duì)MPEF處理前后的基因差異表達(dá)倍數(shù)（MPEF組/對(duì)照組）進(jìn)行分析，結(jié)果如表3所示，雖然轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果和q-PCR分析結(jié)果表達(dá)倍數(shù)有差異，但差異表達(dá)的變化趨勢(shì)基本一致，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的可靠性，表達(dá)倍數(shù)的差異可能是由于儀器、算法等不同造成的。

表3 差異表達(dá)基因q-PCR驗(yàn)證結(jié)果Table 3 q-PCR Validation of differentially expressed genes

2.4 基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的MPEF致死畢赤酵母機(jī)制分析

2.4.1 MPEF對(duì)參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的影響

如表4所示，通過(guò)分析MPEF處理前后畢赤酵母的基因差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)參與生物膜的形成和成分等基因出現(xiàn)顯著差異?？刂粕锬ば纬傻幕蝻@著下調(diào)，說(shuō)明膜的完整性遭到破壞[24]。MPEF處理組中編碼質(zhì)膜成分的基因中出現(xiàn)2 個(gè)顯著上調(diào)，8 個(gè)顯著下調(diào)；編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜成分的基因中出現(xiàn)了2 個(gè)顯著下調(diào)。生物膜成分的改變可能造成膜流動(dòng)性和通透性的變化[25]，Liu Zhiwei等[26]的研究結(jié)果表明PEF處理引起大腸桿菌細(xì)胞膜成分的改變，進(jìn)而對(duì)膜的流動(dòng)性造成影響，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Ferrario等[27]利用流式細(xì)胞儀結(jié)合PI染色技術(shù)驗(yàn)證了PEF對(duì)微生物的致死效果與細(xì)胞膜的損傷有關(guān)。此外，調(diào)節(jié)細(xì)胞壁形成及功能等基因出現(xiàn)顯著變化，說(shuō)明MPEF處理對(duì)細(xì)胞壁產(chǎn)生了影響；由MPEF處理后畢赤酵母細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成與功能的下降，推測(cè)糖類、脂質(zhì)的合成及蛋白質(zhì)的運(yùn)輸受到了影響[28]；MPEF處理后，細(xì)胞器裂變加劇，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等形成和功能有關(guān)的基因均發(fā)生顯著變化，2 個(gè)調(diào)控細(xì)胞骨架的差異基因顯著下調(diào)。因此，MPEF處理導(dǎo)致細(xì)胞膜等生物膜受損，細(xì)胞壁、細(xì)胞器等形成和功能發(fā)生變化，細(xì)胞成分改變，上述變化是MPEF致死細(xì)胞的主要原因之一。

表4 部分與細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)的差異基因轉(zhuǎn)錄水平Table 4 Transcription levels of differentially expression genes related to cell structure

2.4.2 MPEF對(duì)參與DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成代謝基因表達(dá)的影響

由表5可知，與對(duì)照組相比，MPEF組中核苷酸的合成、調(diào)節(jié)均顯著下調(diào)，與核糖核苷結(jié)合相關(guān)基因出現(xiàn)顯著變化，DNA復(fù)制和代謝相關(guān)基因均不同程度地下調(diào)，推測(cè)DNA的復(fù)制減緩或部分被抑制；DNA損傷上調(diào)，且重組修復(fù)、雙鏈斷裂修復(fù)等均顯著下調(diào)，DNA修復(fù)出現(xiàn)1 個(gè)上調(diào)基因，4 個(gè)下調(diào)基因，說(shuō)明電場(chǎng)造成DNA損傷，破壞其自身修復(fù)能力。與核仁相關(guān)基因、控制核糖體生物合成的基因顯著下調(diào)，控制rRNA、mRNA、tRNA的生物過(guò)程、結(jié)合過(guò)程和代謝過(guò)程的基因均不同程度地下調(diào)；大亞基和小亞基的生物合成顯著下調(diào)；RNA和蛋白質(zhì)代謝紊亂；調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)定位至細(xì)胞核和細(xì)胞器，控制基因表達(dá)和蛋白質(zhì)翻譯、修飾、運(yùn)輸?shù)然蝻@著下調(diào)。上述變化表明MPEF處理造成畢赤酵母基因損傷[29]，同時(shí)對(duì)RNA和蛋白質(zhì)的生物合成和代謝造成顯著影響，核苷酸水平的降低，蛋白質(zhì)合成[30]和功能受限[31]是電場(chǎng)造成畢赤酵母死亡的原因之一。

表5 部分與DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成代謝相關(guān)的差異基因轉(zhuǎn)錄水平Table 5 Transcription levels of differentially expressed genes related to synthesis and metabolism of DNA, RNA and protein

2.4.3 MPEF處理對(duì)酶活性相關(guān)基因表達(dá)的影響

表6 部分與酶活性相關(guān)的差異基因轉(zhuǎn)錄水平Table 6 Transcription levels of differentially expressed gene related to enzymatic activities

通過(guò)比較對(duì)照組和MPEF組酶活性的變化，發(fā)現(xiàn)MPEF處理對(duì)畢赤酵母體內(nèi)酶活性產(chǎn)生顯著影響，部分酶活性相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平變化如表6所示。MPEF處理導(dǎo)致半胱天冬蛋白酶被激活，該酶可以直接破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)蛋白喪失功能，比如阻斷DNA復(fù)制、造成DNA和核結(jié)構(gòu)的損傷、拆散細(xì)胞骨架[32]等，這與2.4.2節(jié)結(jié)果一致。蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性調(diào)節(jié)的下降意味著蛋白質(zhì)功能受損[33]，核糖核酸酶、RNA聚合酶活性均下調(diào)；此外，輔酶、ATP合成酶、丙酮酸脫羧酶等參與細(xì)胞代謝的酶均出現(xiàn)顯著變化，說(shuō)明相應(yīng)代謝反應(yīng)也受到了影響；控制氧化還原酶活性的基因出現(xiàn)1 個(gè)顯著上調(diào)，3 個(gè)顯著下調(diào)；酶的催化活性也受到顯著影響。因此，MPEF處理對(duì)酶產(chǎn)生顯著影響，酶活性的變化直接或間接影響了生物大分子的功能、代謝反應(yīng)的發(fā)生[34]等，說(shuō)明相應(yīng)細(xì)胞進(jìn)程改變，這也是引起細(xì)胞死亡的原因。

2.4.4 MPEF處理對(duì)生物合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

表7 部分與生物合成相關(guān)的差異基因轉(zhuǎn)錄水平Table 7 Transcription levels of differentially expressed genes related to biosynthesis

從表7可以看出，MPEF處理破壞正常的生物合成調(diào)控和細(xì)胞體內(nèi)平衡。谷氨酸生物合成的變化表明蛋白代謝受到影響[35]，控制肌動(dòng)蛋白絲、核黃素、ATP、脂質(zhì)、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸合成的基因顯著下調(diào)，肌動(dòng)蛋白絲在細(xì)胞體內(nèi)具有支撐和信息傳導(dǎo)作用[36]，MPEF處理使其合成受阻，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損；MPEF組中的血紅素、脂蛋白以及卵磷脂等生物合成也發(fā)生了顯著變化。此外，核堿基的生物合成中出現(xiàn)1 個(gè)顯著上調(diào)基因，3 個(gè)顯著下調(diào)基因，說(shuō)明堿基配對(duì)出現(xiàn)異常，可能引起蛋白翻譯錯(cuò)誤[37]，影響畢赤酵母的正常生長(zhǎng)。MPEF處理對(duì)細(xì)胞體內(nèi)大分子物質(zhì)的生物合成有一定的影響，破壞體內(nèi)平衡過(guò)程，這也是引起細(xì)胞死亡的原因。

2.4.5 MPEF處理對(duì)跨膜運(yùn)輸能力基因表達(dá)的影響

由表8可知，離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性受電場(chǎng)影響較大，而控制ATP偶聯(lián)離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的4 個(gè)基因中有3 個(gè)顯著下調(diào)，導(dǎo)致離子跨膜運(yùn)輸能力發(fā)生變化。鈉離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的下調(diào)說(shuō)明MPEF影響鈉離子的正常轉(zhuǎn)運(yùn)；銅離子作為胞內(nèi)酶所必需的組分，其轉(zhuǎn)運(yùn)能力的下降對(duì)細(xì)胞正常生命活動(dòng)有顯著影響[38]。此外，MPEF處理對(duì)氨基酸、多胺、有機(jī)酸、丙酮酸、糖等的轉(zhuǎn)運(yùn)具有顯著影響，這些有機(jī)化合物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力的變化說(shuō)明酵母細(xì)胞體內(nèi)代謝反應(yīng)、生命活動(dòng)發(fā)生改變，電場(chǎng)顯著抑制了核酸的運(yùn)輸和跨膜運(yùn)輸調(diào)節(jié)，使畢赤酵母體內(nèi)跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)紊亂，進(jìn)一步影響細(xì)胞的正常生理功能，導(dǎo)致酵母細(xì)胞死亡。

表8 部分與運(yùn)輸能力相關(guān)的差異基因轉(zhuǎn)錄水平Table 8 Transcription levels of differentially expressed genes related to transport capacity

2.4.6 MPEF處理對(duì)代謝過(guò)程相關(guān)基因表達(dá)的影響

表9 部分與代謝過(guò)程相關(guān)的差異基因轉(zhuǎn)錄水平Table 9 Transcription levels of differentially expressed genes related to metabolic processes

如表9所示，MPEF作用于畢赤酵母，細(xì)胞碳水化合物代謝過(guò)程出現(xiàn)29 個(gè)上調(diào)基因，12 個(gè)下調(diào)基因；電場(chǎng)對(duì)氨基酸的代謝也有顯著影響，谷氨酸合成代謝出現(xiàn)2 個(gè)顯著上調(diào)基因，4 個(gè)顯著下調(diào)基因。此外，MPEF處理對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)、有機(jī)酸、核苷酸、核黃素、芳香化合物、維生素等代謝均有顯著影響，說(shuō)明MPEF處理不僅影響生命活動(dòng)所必需的初級(jí)代謝過(guò)程，對(duì)次級(jí)代謝過(guò)程也有一定影響。電場(chǎng)作用于酵母細(xì)胞后，調(diào)節(jié)其碳水化合物代謝、糖酵解等過(guò)程的差異基因顯著變化，控制ATP代謝過(guò)程的2 個(gè)差異基因全部顯著下調(diào)。代謝調(diào)節(jié)水平的下降與酶量和酶活性的降低緊密聯(lián)系[39]，上述結(jié)果也說(shuō)明了MPEF處理影響mRNA和蛋白的翻譯以及酶活性。代謝調(diào)節(jié)的減弱增加了細(xì)胞新陳代謝活動(dòng)的能耗[40]。

分解代謝是釋放能量的過(guò)程，MPEF組與對(duì)照組相比，控制碳水化合物分解過(guò)程的差異基因中10 個(gè)顯著上調(diào)，5 個(gè)顯著下調(diào)；參與乙醛酸分解代謝、核苷酸分解代謝的差異基因全部下調(diào)，參與芳香化合物和氮化合物分解代謝過(guò)程的差異基因中分別有4 個(gè)顯著上調(diào)，8 個(gè)顯著下調(diào)；參與三羧酸循環(huán)的所有差異基因全部顯著上調(diào)，說(shuō)明MPEF處理對(duì)畢赤酵母細(xì)胞的分解代謝能力有顯著影響，對(duì)部分分解代謝有抑制作用，對(duì)部分分解代謝有激活作用，激活可能是細(xì)胞為了抵御電場(chǎng)不利影響而出現(xiàn)的應(yīng)激反應(yīng)。因此，MPEF處理使得畢赤酵母細(xì)胞內(nèi)代謝機(jī)制紊亂[41]，破壞其自動(dòng)調(diào)節(jié)能力，無(wú)法適應(yīng)電場(chǎng)環(huán)境，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

3 結(jié) 論

MPEF技術(shù)對(duì)畢赤酵母有很好的致死效果，在400 V電壓、80 個(gè)脈沖條件下，畢赤酵母下降了（6.39±0.17）個(gè)對(duì)數(shù)值。MPEF處理對(duì)細(xì)胞的損傷較為嚴(yán)重，包括細(xì)胞膜在內(nèi)的生物膜是其作用的一個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)，膜完整性遭到破壞；細(xì)胞壁的保護(hù)作用減弱；細(xì)胞器和細(xì)胞骨架受損。細(xì)胞組分的改變導(dǎo)致相應(yīng)功能的變化，最為明顯的是核仁、核糖體的生物合成和功能被顯著抑制，這是引起細(xì)胞死亡的主要原因。此外，MPEF處理造成基因損傷、堿基配對(duì)異常、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯受阻；蛋白功能被部分抑制，酶活性、生物合成及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力發(fā)生改變，最終造成畢赤酵母體內(nèi)代謝紊亂；自由基增多，而抗氧化酶系下調(diào)表達(dá)導(dǎo)致自由基清除系統(tǒng)被減弱，最終引起畢赤酵母死亡。電場(chǎng)對(duì)線粒體產(chǎn)生十分顯著的影響，線粒體受損可能導(dǎo)致細(xì)胞色素C的釋放，同時(shí)半胱天冬蛋白酶顯著上調(diào)，形成酵母細(xì)胞凋亡小體，從而誘導(dǎo)畢赤酵母凋亡的發(fā)生，該過(guò)程是MPEF導(dǎo)致基因調(diào)控變化引起的。

MPEF處理使得控制畢赤酵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖、呼吸和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因發(fā)生顯著變化，多生物過(guò)程調(diào)控、細(xì)胞內(nèi)分子定位及調(diào)節(jié)等顯著下降。MPEF對(duì)微生物的鈍化機(jī)制是十分復(fù)雜的，基因損傷和調(diào)控的變化，細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，酶活性的改變是減弱生物合成能力和引發(fā)代謝紊亂的前提，是導(dǎo)致細(xì)胞死亡的主要原因。