沈先敏，劉 恒

0 引言

帕金森綜合征(Parkinson′s disease，PD)屬于一種中樞神經系統(tǒng)退行性病變，患者主要集中于老年人群，然而其發(fā)病機制仍未得到完全闡明[1]。早期有研究提出帕金森綜合征患者腦脊液中炎性因子水平顯著升高，會進一步反饋誘導小神經膠質細胞的過度活化而聚集成團[2-3]。研究證實，脂多糖、淀粉樣蛋白(Aβ)及細胞因子均能夠過度激活小神經膠質細胞[4-5]，活化的小膠質細胞會進一步發(fā)生形態(tài)營養(yǎng)不良及凋亡，導致多種退行性疾病的發(fā)生發(fā)展[6]。有報道，慢性神經炎癥是導致帕金森綜合征發(fā)生與發(fā)展的重要病因，并且激活的小膠質細胞會產生多種炎性因子，損傷周圍的神經元細胞[7]。槲皮素(Quercetin)主要存在于中草藥及蔬果中，屬于天然黃酮類活性物質，在抗炎、抗氧化、抗癌等方面效果顯著，對神經元還發(fā)揮著類似神經營養(yǎng)因子的作用[8]。近期研究發(fā)現，槲皮素對急性缺血性卒中大鼠具有保護作用，其機制可能與抑制TRAF6/IKKβ/NF-κB信號通路有關[9]。有報道，槲皮素對原代皮層神經元細胞氧糖剝奪損傷具有較好的保護作用，其作用機制可能與抑制Traf6/TAK1信號通路活化有關[10]。因此，筆者研究了槲皮素對BV-2細胞炎癥反應的影響，并探討槲皮素對介導炎癥反應TRAF6/TAK1信號通路活化的影響，以期為神經退行性疾病的治療奠定理論基礎。

1 材料及方法

1.1 材料及試劑 槲皮素(成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號：1257-08-5，純度≥98%)；小鼠小膠質瘤BV-2細胞由武漢巴菲爾生物有限公司提供(來源于美國ATCC細胞庫)；DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清均購自美國Gibco公司；胰蛋白酶購自美國Thermo scientific公司(批號：R001100)；CCK8試劑盒購自北京智杰方遠科技有限公司(批號：CK04)；LPS(批號：L2880，Sigma公司)；IL-6、IL-1β及TNF-α ELISA試劑盒購自武漢華美生物有限公司(批號分別為WK15204、WK25540、WK36640)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自武漢谷歌生物有限公司(批號：P57460)；兔抗鼠β-actin(貨號：ab108267)、iNOS(貨號：ab152104)、COX-2(貨號：ab105217)、TRAF6(貨號:ab1214527)、TAK1(貨號:ab115200)及p-TAK1(貨號:ab1652540)一抗均購自英國Abcam公司；HRP標記山羊抗兔IgG二抗購自武漢谷歌生物有限公司。

1.2 儀器 BIORAD-550型酶標儀(美國伯樂公司)；BBS-V800型單人超凈臺(山東鑫貝西公司)；SPX-250型細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；GE-100型凝膠電泳儀(北京六一儀器廠)；雙色紅外激光成像系統(tǒng)(BIO-RAD，美國)。

1.3 BV-2細胞培養(yǎng) 采用DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件為37 ℃、5%CO2濃度，待細胞長滿至95%左右時，用PBS清洗后加入胰酶消化，顯微鏡下觀察，待細胞變圓后加入培養(yǎng)基終止消化，分裝于3個培養(yǎng)瓶進行傳代培養(yǎng)。

1.4 槲皮素對BV-2細胞增殖的影響 取對數生長期細胞消化、離心、重懸后，以1×105個/ml的細胞濃度接種于96孔板，每孔加入200 μl的細胞懸液，每組設置5個復孔。細胞培養(yǎng)過夜后用于后續(xù)實驗，實驗分為5組：正常對照組、LPS(1 mg/L)誘導組、LPS+低劑量(75 μmol/L)槲皮素組、LPS+中劑量(150 μmol/L)槲皮素組、LPS+高劑量(300 μmol/L)槲皮素組，首先在藥物組中加入相應濃度槲皮素溶液，2 h后再加入LPS溶液。培養(yǎng)24 h，吸去舊培養(yǎng)液，每孔加入10 μl CCK8試劑，孵育1 h后采用酶標儀450 nm波長下OD值。實驗重復3次，計算細胞相對存活率。

1.5 ELISA實驗 將對數生長期細胞進行消化重懸接種于6孔板，待細胞貼壁后吸去舊培養(yǎng)基，按“1.4”項分組及藥物處理24 h后收集細胞及細胞上清，細胞上清用于炎性因子IL-6、IL-1β及TNF-α水平檢測，其操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.6 Western blot 將“1.5”項收集的細胞裂解制備成勻漿，離心收集上清提取細胞蛋白，BCA法測定細胞總蛋白濃度。各孔取50 μg的蛋白上樣，用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白分離，將分離后的蛋白電轉移至NC膜。加入5%脫脂奶粉封閉液于搖床上室溫封閉1 h后，分別加入iNOS、COX-2、TRAF6、TAK1、p-TAK1抗體(體積稀釋比例均為1∶1 000)4 ℃反應過夜。次日以TBST洗膜3次后，加入HRP標記的山羊抗兔IgG(體積稀釋比例為1∶3 000)，室溫反應1 h。再用TBST洗膜3次，每次10 min，以ECL試劑顯影后進行蛋白條帶灰度值分析。

2 結果

2.1 不同組間細胞相對存活率比較 槲皮素對BV-2細胞增殖的影響見圖1。與正常對照組比較，LPS誘導組中細胞增殖受到明顯抑制(P<0.05)；與LPS誘導組比較，各劑量槲皮素組細胞相對存活率明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，并且隨著槲皮素劑量的增加，細胞相對存活率增高，呈現出濃度依賴性。

圖1 槲皮素對BV-2細胞相對存活率的影響

注：與正常對照組比較，*P<0.05;與LPS誘導組比較，#P<0.05。1.正常對照組；2.LPS誘導組；3.LPS+低劑量槲皮素組；4.LPS+中劑量槲皮素組；5.LPS+高劑量槲皮素組

2.2 槲皮素對BV-2細胞分泌炎性因子IL-6、IL-1β及TNF-α水平的影響 與正常對照組比較，LPS誘導組中細胞上清炎性因子IL-6、IL-1β及TNF-α水平明顯升高(P<0.05)；與LPS誘導組比較，各劑量槲皮素組細胞上清炎性因子IL-6、IL-1β及TNF-α水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，并且隨著槲皮素劑量的增加，細胞上清炎性因子IL-6、IL-1β及TNF-α水平降低，表現出濃度依賴性。見表1。

表1 槲皮素對BV-2細胞上清炎性因子水平的影響

注：與正常對照組比較，*P<0.05;與LPS誘導組比較，#P<0.05

2.3 槲皮素對BV-2細胞中iNOS和COX-2蛋白表達水平的影響 與正常對照組比較，LPS誘導組中iNOS和COX-2蛋白的表達水平明顯升高(P<0.05)；與LPS誘導組比較，各劑量槲皮素組細胞iNOS和COX-2蛋白的表達水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，并且隨著槲皮素劑量的增加，細胞iNOS和COX-2蛋白的表達水平降低，表現出濃度依賴性。見圖2。

2.4 槲皮素對BV-2細胞中TRAF6/TAK1信號通路的影響 與正常對照組比較，LPS誘導組細胞中TRAF6及p-TAK1表達水平明顯增高(P<0.05)；與LPS誘導組比較，各劑量槲皮素組細胞中TRAF6及p-TAK1表達水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，并且隨著槲皮素劑量的增加，細胞中TRAF6及p-TAK1表達水平降低，表現出濃度依賴性。見圖3。

3 結論

帕金森綜合征的病原學仍處于探索階段，前期學者們提出Aβ及TAU蛋白過度磷酸化與該病的發(fā)生發(fā)展密切相關，還提出神經炎性反應也是導致該疾病發(fā)生的最主要原因之一[11]。小神經膠質細胞表現出免疫調節(jié)作用，當其被活化時便具有正負雙向調節(jié)作用，包括吞噬Aβ、降低斑塊的沉積，激活炎性通路、誘導炎性因子釋放[12]。因此，降低神經系統(tǒng)炎性反應是預防帕金森綜合征發(fā)生的主要措施之一。槲皮素屬于一種天然黃酮類活性物質，并且黃酮類化合物能夠改善炎癥因子引起的神經元細胞的炎性損傷，提示其在預防及治療神經退行性疾病中有著較好的藥理作用[13]。國內外關于槲皮素在神經退行性疾病中保護作用的研究較少，有關研究證實槲皮素通過抑制Aβ分泌酶及誘導Aβ消化酶表達起到保護Aβ誘導的BV-2細胞損傷的作用[14]。該研究探討了槲皮素對LPS誘導BV-2細胞炎性損傷的保護作用，初步研究了槲皮素保護BV-2細胞免受炎性損傷的效果與機制。San等[15]研究槲皮素作用BV-2細胞的藥物濃度，采用CCK8預實驗，篩選出本研究中低、中、高3種劑量的藥物濃度。實驗結果發(fā)現，槲皮素能夠降低LPS誘導的BV-2細胞炎性因子IL-6、IL-1β及TNF-α的釋放，還能抑制炎性蛋白iNOS和COX-2的表達，改善炎性損傷，進一步誘導細胞增殖。

圖2 不同組間炎性蛋白表達比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05;與LPS誘導組比較，#P<0.05。1.正常對照組；2.LPS誘導組；3.LPS+低劑量槲皮素組；4.LPS+中劑量槲皮素組；5.LPS+高劑量槲皮素組

圖3 不同組間TRAF6及p-TAK1蛋白表達比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05;與LPS誘導組比較，#P<0.05。1.正常對照組；2.LPS誘導組；3.LPS+低劑量槲皮素組；4.LPS+中劑量槲皮素組；5.LPS+高劑量槲皮素組

腫瘤壞死因子相關受體因子6(TRAF6)屬于一種銜接蛋白，在胞外各種因素刺激下，膜受體激活啟動TRAF6的活化，后者將會激活轉錄生長因子-β活化激酶1(TAK1)的磷酸化，將胞外信號傳導至胞內誘導炎性通路的活化[16]。動物學實驗發(fā)現，在小鼠體內過表達TARF6基因，會引起TAK1磷酸化水平的增高，繼而活化NF-κB信號通路，導致細胞炎癥反應、氧化損傷及細胞凋亡的發(fā)生[17]。體外采用LPS誘導BV-2細胞炎性損傷模型，發(fā)現五味子甲素能夠通過抑制TRAF6-IKK8-NF-κB信號通路的活化，誘導神經炎性相關蛋白iNOS及COX-2蛋白的表達，從而降低BV-2細胞的炎性損傷[18]。本實驗證實，LPS能夠引起TRAF6/TAK1信號通路的活化，進一步誘導相關蛋白iNOS及COX-2的表達，導致BV-2細胞炎性損傷的出現。對細胞進行不同劑量槲皮素處理后，能夠明顯抑制TRAF6及p-TAK1蛋白的表達，降低TRAF6/TAK1信號通路的活化程度，進一步抑制iNOS及COX-2的表達。不僅如此，LPS還能誘導BV-2細胞存活率的降低，而槲皮素能夠誘導BV-2的增殖，還能降低炎性因子IL-6、IL-1β及TNF-α的產生?？傊狙芯拷Y果表明，槲皮素能顯著降低LPS引發(fā)的BV-2細胞炎性損傷，降低炎性相關蛋白的表達，其作用機制可能與抑制TRAF6/TAK1信號通路活化有關。