肖朝文，鄭小林，蔡常春，鄭建偉，申銘

（1. 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院 肝膽胰外科，湖北 武漢 430014；2. 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院 肝膽胰外科，湖北 武漢 430030）

mda-7/IL-24基因最初被命名為黑色素瘤分化相關(guān)基因7（melanoma differentiation associated gene 7，mda-7），又名IL-24，是Fisher教授利用亞減法技術(shù)從黑色素瘤細(xì)胞中經(jīng)人干擾素β（IFN-β）和PKC激活劑mezerin（MEZ）誘生而獲得的[1]。研究[2-5]發(fā)現(xiàn)該基因不僅能引起黑色素瘤細(xì)胞生長抑制和凋亡，而且能促進(jìn)其他多種癌細(xì)胞的生長抑制和凋亡，但是對(duì)正常細(xì)胞卻沒有發(fā)現(xiàn)明顯毒性作用，被譽(yù)為21世紀(jì)最令人激動(dòng)的可以攻克腫瘤的基因之一[6]。攜帶人mda-7/IL-24的溶瘤腺病毒，是一種復(fù)制非缺陷型病毒（溶瘤腺病毒），已經(jīng)顯示出了更高的轉(zhuǎn)染效率，因?yàn)橥庠椿蚰苓x擇性在腫瘤細(xì)胞DNA內(nèi)復(fù)制、增殖、裂解腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常細(xì)胞幾乎沒有影響。課題組前期研究[7-8]已經(jīng)從多個(gè)方面證實(shí)了攜帶人mda-7/IL-24溶瘤腺病毒SG600-IL24殺傷肝癌細(xì)胞株高選擇性，那么其選擇性殺傷肝癌細(xì)胞機(jī)理到底如何？為了進(jìn)一步探討這些問題，本課題組運(yùn)用溶瘤腺病毒SG600-IL24干預(yù)肝癌細(xì)胞株HepG2、HCCLM3和正常肝細(xì)胞株L02，檢測干預(yù)后肝癌細(xì)胞株HepG2、HCCLM3和正常肝細(xì)胞株L02內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)總STAT3以及信號(hào)通路下游信號(hào)分子c-myc、Bax、Bcl-2、Bcl-xl、cyclin D2、survivin、XIAP、OPN、MMP-2、MMP-9和VEGF基因和蛋白的表達(dá)變化，同時(shí)檢測各細(xì)胞株在溶瘤腺病毒SG600-IL24處理后，磷酸化STAT3的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

目的基因、載體和細(xì)胞：p Z D 55-I L 24、pClon9、pUC19-INS、SG502-ΔCR2及腺病毒骨架質(zhì)粒ppE3均購于上海新基因公司；HepG2、L02及高轉(zhuǎn)移性人肝癌細(xì)胞株HCCLM3購于上海復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所；氨芐青霉素抗性的大腸桿菌DH5a及HEK293細(xì)胞株為第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科研究所錢其軍教授惠贈(zèng)。引物：依據(jù)GeneBank（NM006850）hIL-24的cDNA序列，選其編碼序列（coding sequence，CDS）為目的片段，大小約640 bp，設(shè)計(jì)上、下游引物分別為VT371與VT372。序列分別為5'-GAC TCG AGA TGA ATT TTC AAC AGA-3'；5'-ATG GAT CCT CAG AGC TTG TAG AAT-3'，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。試劑：限制性內(nèi)切酶XbaI、BamHI、EcoRI、HindIII、ScaI，高保真pfu酶及快速連接試劑盒（DNA ligation kit）購于New England Biolabs（NEB）公司，質(zhì)粒小樣提取試劑盒、膠回收試劑盒購于QIAGEN公司，肝癌細(xì)胞株HepG2、HCCLM3細(xì)胞，用高糖DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 U/mL），正常肝細(xì)胞株L02細(xì)胞用1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 U/mL)。RT-PCR試劑盒（TAKARA公司），一抗mda-7/IL-24（英國Abcam公司)，兔抗人mda-7/IL-24為英國Abcam公司產(chǎn)品；兔抗人STAT3、p-STAT3、survivin、XIAP、OPN和MMP-2為美國SANTA CRUZ公司產(chǎn)品；鼠抗人c-myc、Bax、Bcl-2、Bcl-xl、cyclin D2和VEGF為均為美國SANTA CRUZ公司產(chǎn)品；引物的設(shè)計(jì)、合成由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 攜帶目的基因的溶瘤腺病毒載體的構(gòu)建

酶切質(zhì)粒Z D 55-I L 24得到I L 24連接到pClon9-INS-IL24，將pClon9-INS-IL24共酶切得到INS+IL24片段，裝入SG502-ΔCR2載體中，獲得重組質(zhì)粒pSG600-IL24，并將其送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與GeneBankNM006850的基因序列完全相符。將293細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中（1×106個(gè)/孔），當(dāng)細(xì)胞匯合率達(dá)90%左右時(shí)，取純化的穿梭質(zhì)粒SG600-IL24及腺病毒骨架質(zhì)粒ppE3，用Lipofectamine 2000試劑盒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，待9～14 d空斑出現(xiàn)后挑取空斑，經(jīng)過3次病毒空斑純化，提取病毒DNA，應(yīng)用PCR進(jìn)行鑒定，鑒定正確的腺病毒命名為SG600-IL24，即攜帶人mda-7/IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24，儲(chǔ)存于-80 ℃。

1.3 溶瘤腺病毒的擴(kuò)增、純化和滴度測定

293細(xì)胞在75 cm2的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長至80%～90%滿時(shí)，以10～20病毒顆粒/細(xì)胞接種腺病毒，2～3 d后當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)CPE反應(yīng)后收集細(xì)胞，反復(fù)凍融3次，取病毒上清液再感染293細(xì)胞進(jìn)行大量擴(kuò)增，2～3 d后收集細(xì)胞，PBS重懸，反復(fù)凍融，為了得到滴度更高的病毒，反復(fù)“感染-收集-凍融”3次，最后CsCl離心純化。滴度測定時(shí)將HEK293細(xì)胞接種于96孔板，然后用50%組織培養(yǎng)感染劑量法（TCID50）來測定病毒滴度。

1.4 病毒感染及實(shí)驗(yàn)分組

溶瘤腺病毒SG600-IL24和SG600-EGFP（攜帶對(duì)照基因EGFP）由本實(shí)驗(yàn)室在293細(xì)胞內(nèi)同源重組的方法構(gòu)建，構(gòu)建成功后在293細(xì)胞中擴(kuò)增，CsCl超速離心法純化，病毒滴度由TCID50法測定，溶瘤腺病毒按感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）=10感染上述細(xì)胞。將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞（HepG2、HCCLM3、正常肝細(xì)胞L02）各分為3組：空白對(duì)照組（無血清DMEM培養(yǎng)）、SG600-EGFP組（感染對(duì)照病毒載體SG600-EGFP）、SG600-IL24組（感染溶瘤腺病毒SG600-IL24）。

1.5 RT-PCR檢測多種基因mRNA的表達(dá)變化

取對(duì)數(shù)期的肝癌細(xì)胞HepG2、HCCLM3和正常肝細(xì)胞L02，按上述方法感染，分別于感染24、48、72 h后按TRIzol試劑盒說明提取各組細(xì)胞總mRNA，測定RNA的濃度和純度后，進(jìn)行半定量RT-PCR擴(kuò)增。目的基因的上、下游引物和擴(kuò)增片段長度分別如表1所示，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延長10 min。同反應(yīng)條件β-actin擴(kuò)增片段，長度為20l bp，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶（EB）染色，紫外燈下觀察結(jié)果并拍照保存，用相關(guān)軟件測量灰度值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以目的基因與β-actin的比值表示該目的基因的相對(duì)含量，對(duì)其進(jìn)行半定量分析。

1.6 Western bolt檢測多種蛋白的表達(dá)變化

取肝癌細(xì)胞和正常細(xì)胞鋪于6孔板中，按以上方法加入適量病毒，分別于感染24、48、72 h后，按不同時(shí)段收集細(xì)胞懸浮于裂解液并進(jìn)行Bradford法蛋白定量。配制8%～15%的SDS-PAGE凝膠電泳板，每孔加50 μg蛋白樣品，100 V電泳2 h，聚偏氟乙烯（PVDF）轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉后，再分別加入相應(yīng)的一抗，4 ℃孵育過夜，漂洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，漂洗后加入DAB顯色，凝膠成像測灰度值行數(shù)據(jù)分析。

表1 基因的引物序列Table1 The primer sequences

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。組間比較采用單向方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 溶瘤腺病毒病毒克隆的鑒定

光鏡觀察：可見感染后的HEK293細(xì)胞特征性CPE，細(xì)胞變大、變圓、漂浮，呈葡萄串聚集。PCR鑒定：取病毒DNA各2 μL為模板，通過PCR方法擴(kuò)增出約640 bp的特異性片段，其大小與陽性對(duì)照相符，而陰性對(duì)照則無片段擴(kuò)增，表明所得的腺病毒即為攜帶人mda-7/IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24（圖1）。

2.2 純化后病毒上清的滴度測定

溶瘤腺病毒S G 600-I L 24可在H E K 293細(xì)胞中大量擴(kuò)增，裂解細(xì)胞后收取病毒液，經(jīng)CsCl密度梯度離心，可獲高濃度、高純度的灰白色病毒帶，TCID50測定法測得純化后病毒滴度為2.25×1010PFU/mL，SG600-EGFP滴度為2.79×1010PFU/mL。

圖1 溶瘤腺病毒的PCR鑒定 M：100 bp DNA階梯；1：陽性對(duì)照（SG600-IL24質(zhì)粒）；2、3：SG600-IL24病毒；4：陰性對(duì)照Figure1 PCR identification of oncolyic adenovirus M:100 bp DNA Ladder; 1:Positive control (SG600-IL24 plasmid); 2, 3:SG600-IL24 adenovirus; 4:Negative control

2.3 RT-PCR檢測結(jié)果

RT-PCR檢測結(jié)果顯示，肝癌細(xì)胞HepG2、HCCLM3和正常肝細(xì)胞L02均有mda-7/IL-24基因的表達(dá)，而SG600-EGFP組和對(duì)照組沒有發(fā)現(xiàn)mda-7/IL-24基因的表達(dá)。肝癌細(xì)胞HepG2和HCCLM3在感染SG600-IL24后的不同時(shí)間點(diǎn)STAT3及其下游的信號(hào)通路基因survivin、c-myc、Bax、Bcl-2、Bcl-xl、cyclin D2、MMP-2、MMP-9和VEGF發(fā)生一系列的變化，除Bax隨時(shí)間的延長表達(dá)逐步增強(qiáng)外，其余STAT3及其下游的信號(hào)通路基因表達(dá)均下調(diào)，隨著感染時(shí)間的延長，基因表達(dá)逐步下降（部分P＜0.05），而正常肝細(xì)胞L02無上述的改變（均P＞0.05）（圖2）（表2）。

圖2 SG600-IL24感染后mda-7/IL-24、STAT3及下游信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)Figure2 Gene expressions of mda-7/IL-24, STAT3 and the its downstream signaling molecules after SG600-IL24 infection

表2 SG600-IL24感染后mda-7/IL-24、STAT3及下游信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量（±s）Table2 Relative mRNA expression levels of mda-7/IL-24, STAT3 and the its s downstream signaling molecules after SG600-IL24 infection (±s)

表2 SG600-IL24感染后mda-7/IL-24、STAT3及下游信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量（±s）Table2 Relative mRNA expression levels of mda-7/IL-24, STAT3 and the its s downstream signaling molecules after SG600-IL24 infection (±s)

注：1）與空白對(duì)照組比較，P＜0.05Note:1) P＜0.05 vs. blank control group

細(xì)胞 mda-7/IL-24 cyclin D2 c-myc Bcl-2 Bcl-xl Bax HepG2空白對(duì)照組 0.01±0.000.22±0.010.92±0.040.60±0.050.22±0.000.02±0.00 EGFP 組 0.01±0.000.30±0.020.88±0.030.58±0.020.20±0.020.22±0.02 SG600-IL24組24 h 0.88±0.001) 0.25±0.020.80±0.030.33±0.021) 0.20±0.020.36±0.031)48 h 0.92±0.041) 0.15±0.011) 0.72±0.0210.28±0.011) 0.18±0.010.45±0.031)72 h 0.94±0.031) 0.05±0.001) 0.10±0.0010.06±0.001) 0.14±0.001) 0.40±0.011 HCCLM3空白對(duì)照組 0.02±0.000.22±0.010.82±0.020.44±0.040.32±0.000.03±0.00 EGFP 組 0.02±0.000.18±0.010.80±0.050.38±0.030.34±0.010.04±0.00 SG600-IL24組24 h 0.76±0.011) 0.30±0.020.78±0.040.36±0.040.20±0.000.42±0.031)48 h 0.78±0.021) 0.06±0.001) 0.65±0.030.08±0.011) 0.08±0.011) 0.42±0.011)72 h 0.78±0.021) 0.04±0.001) 0.11±0.001) 0.07±0.001) 0.06±0.001) 0.44±0.021)L02空白對(duì)照組 0.00±0.000.24±0.010.22±0.000.22±0.010.32±0.020.02±0.00 EGFP 組 0.00±0.000.33±0.020.26±0.010.23±0.010.28±0.010.03±0.00 SG600-IL24組24 h 0.92±0.041) 0.24±0.020.30±0.020.22±0.010.32±0.020.44±0.021)48 h 0.95±0.031) 0.16±0.001) 0.25±0.010.20±0.020.26±0.010.42±0.011)72 h 0.96±0.031) 0.04±0.001) 0.12±0.000.20±0.000.22±0.000.42±0.021)

表2 SG600-IL24感染后mda-7/IL-24、STAT3及下游信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量（±s） （續(xù)）Table2 Relative mRNA expression levels of mda-7/IL-24, STAT3 and the its s downstream signaling molecules after SG600-IL24 infection (±s) (continued)

表2 SG600-IL24感染后mda-7/IL-24、STAT3及下游信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量（±s） （續(xù)）Table2 Relative mRNA expression levels of mda-7/IL-24, STAT3 and the its s downstream signaling molecules after SG600-IL24 infection (±s) (continued)

注：1）與空白對(duì)照組比較，P＜0.05Note:1) P＜0.05 vs. blank control group

細(xì)胞 survivin STAT3 MMP-2 MMP-9 VEGF HepG2空白對(duì)照組 0.38±0.030.61±0.020.26±0.010.42±0.020.22±0.01 EGFP 組 0.30±0.020.78±0.020.22±0.010.38±0.020.20±0.02 SG600-IL24組24 h 0.28±0.020.86±0.050.03±0.001) 0.10±0.001) 0.22±0.0248 h 0.28±0.010.65±0.020.03±0.001) 0.03±0.001) 0.18±0.0072 h 0.05±0.001) 0.16±0.001) 0.01±0.001) 0.02±0.001) 0.15±0.00 HCCLM3空白對(duì)照組 0.43±0.020.43±0.040.22±0.010.43±0.020.29±0.02 EGFP 組 0.41±0.010.38±0.040.20±0.010.46±0.020.30±0.03 SG600-IL24組24 h 0.42±0.020.32±0.030.04±0.001) 0.32±0.010.24±0.0148 h 0.06±0.001) 0.38±0.020.03±0.001) 0.07±0.001) 0.21±0.0072 h 0.04±0.001) 0.16±0.021) 0.02±0.001) 0.06±0.001) 0.05±0.001)L02空白對(duì)照組 0.72±0.040.82±0.020.18±0.010.01±0.000.32±0.01 EGFP 組 0.68±0.020.83±0.020.16±0.020.01±0.000.43±0.01 SG600-IL24組24 h 0.68±0.030.85±0.040.02±0.0010.01±0.000.35±0.0048 h 0.62±0.020.82±0.020.02±0.0010.03±0.000.33±0.0272 h 0.60±0.020.80±0.010.01±0.0010.01±0.000.31±0.00

2.4 Western blot檢測結(jié)果

在感染SG600-IL24的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，肝癌細(xì)胞HepG2、HCCLM3和正常肝細(xì)胞L02都有mda-7/IL-24蛋白的表達(dá)，而SG600-EGFP組和對(duì)照組細(xì)胞中，未發(fā)現(xiàn)mda-7/IL-24蛋白的表達(dá)。HepG2和HCCLM3在分別感染24、48、72 h后STAT3及其下游的信號(hào)通路蛋白survivin、c-myc、Bax、Bcl-2、Bcl-xl、cyclin D2、OPN、XIAP、MMP-2和VEGF發(fā)生一系列的變化，除Bax蛋白隨時(shí)間的延長表達(dá)逐步增強(qiáng)外，其余STAT3及其下游的信號(hào)通路蛋白表達(dá)均下調(diào)，隨著感染時(shí)間的延長，蛋白表達(dá)逐步下降（部分P＜0.05），而正常肝細(xì)胞L02無上述改變（均P＞0.05）（圖3）（表3）。

圖3 SG600-IL24感染后mda-7/IL-24、STAT3及下游信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)Figure3 Protein expressions of mda-7/IL-24, STAT3 and the its downstream signaling molecules after SG600-IL24 infection

表3 mda-7/IL-24、STAT3及下游信號(hào)通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量（±s）Table3 Relative protein expression levels of mda-7/IL-24, STAT3 and the its s downstream signaling molecules after SG600-IL24 infection (±s)

表3 mda-7/IL-24、STAT3及下游信號(hào)通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量（±s）Table3 Relative protein expression levels of mda-7/IL-24, STAT3 and the its s downstream signaling molecules after SG600-IL24 infection (±s)

注：1）與空白對(duì)照組比較，P＜0.05Note:1) P＜0.05 vs. blank control group

細(xì)胞 mda-7/IL-24 cyclin D2 STAT3 c-myc Bcl-2 Bcl-xl Bax HepG2空白對(duì)照組 0.01±0.000.89±0.000.52±0.010.96±0.030.54±0.020.56±0.020.01±0.00 EGFP 組 0.03±0.000.85±0.000.45±0.000.88±0.020.61±0.040.66±0.030.01±0.00 SG600-IL24組24 h 0.45±0.011) 0.75±0.000.32±0.001) 0.76±0.000.38±0.001) 0.52±0.010.26±0.011)48 h 0.75±0.021) 0.65±0.000.05±0.001) 0.65±0.000.22±0.001) 0.18±0.001) 0.35±0.011)72 h 0.86±0.031) 0.20±0.0110.06±0.001) 0.10±0.0010.08±0.001) 0.12±0.011) 0.40±0.011)HCCLM3空白對(duì)照組 0.02±0.000.42±0.000.42±0.000.95±0.030.82±0.040.80±0.020.03±0.00 EGFP 組 0.03±0.000.33±0.000.33±0.000.85±0.020.73±0.010.75±0.030.01±0.00 SG600-IL24組24 h 0.55±0.011) 0.30±0.000.30±0.000.82±0.010.60±0.000.68±0.000.42±0.01148 h 0.65±0.021) 0.25±0.010.25±0.010.60±0.000.22±0.0010.72±0.020.40±0.02172 h 0.80±0.031) 0.04±0.001) 0.04±0.001) 0.08±0.001) 0.34±0.0010.44±0.0210.66±0.031 L02空白對(duì)照組 0.02±0.000.02±0.000.42±0.000.03±0.000.08±0.000.05±0.010.02±0.00 EGFP 組 0.08±0.000.03±0.000.33±0.000.02±0.000.04±0.000.06±0.000.03±0.00 SG600-IL24組24 h 0.75±0.011) 0.02±0.000.30±0.000.02±0.000.05±0.000.28±0.000.05±0.0048 h 0.85±0.041) 0.01±0.000.25±0.010.01±0.000.06±0.010.32±0.000.02±0.0072 h 0.96±0.031) 0.01±0.000.04±0.000.01±0.000.06±0.000.48±0.020.01±0.00

表3 mda-7/IL-24、STAT3及下游信號(hào)通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量（±s）（續(xù)）Table3 Relative protein expression levels of mda-7/IL-24, STAT3 and the its s downstream signaling molecules after SG600-IL24 infection (±s) (continued)

表3 mda-7/IL-24、STAT3及下游信號(hào)通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量（±s）（續(xù)）Table3 Relative protein expression levels of mda-7/IL-24, STAT3 and the its s downstream signaling molecules after SG600-IL24 infection (±s) (continued)

注：1）與空白對(duì)照組比較，P＜0.05Note:1) P＜0.05 vs. blank control group

細(xì)胞 survivin MMP-2 XIAP OPN VEGF HepG2空白對(duì)照組 0.95±0.030.62±0.020.66±0.020.90±0.040.78±0.03 EGFP 組 0.90±0.030.48±0.050.52±0.020.60±0.020.55±0.02 SG600-IL24組24 h 0.82±0.020.40±0.000.42±0.000.24±0.001) 0.45±0.0048 h 0.35±0.001) 0.20±0.001) 0.32±0.021) 0.12±0.001) 0.40±0.021)72 h 0.20±0.011) 0.08±0.011) 0.22±0.001) 0.02±0.001) 0.30±0.001)HCCLM3空白對(duì)照組 0.56±0.020.46±0.010.40±0.020.80±0.030.72±0.04 EGFP 組 0.62±0.010.38±0.000.38±0.000.83±0.030.68±0.03 SG600-IL24組24 h 0.32±0.0010.06±0.0010.32±0.000.55±0.021) 0.55±0.0048 h 0.26±0.0010.06±0.0010.20±0.011) 0.88±0.040.48±0.0272 h 0.04±0.0010.04±0.0010.16±0.001) 0.35±0.021) 0.32±0.001)L02空白對(duì)照組 0.45±0.010.42±0.020.07±0.000.02±0.000.02±0.00 EGFP 組 0.40±0.000.40±0.010.06±0.000.04±0.000.01±0.00 SG600-IL24組24 h 0.15±0.001) 0.30±0.000.08±0.010.12±0.010.01±0.0048 h 0.06±0.001) 0.25±0.001) 0.06±0.000.11±0.000.03±0.0072 h 0.01±0.001) 0.20±0.001) 0.04±0.000.04±0.000.01±0.00

2.5 STAT3蛋白磷酸化檢測結(jié)果

p-STAT3在SG600-IL24分別感染0、5、30、60、120、240 min后，表達(dá)水平先上升后下降，在感染2 h達(dá)到峰值，HepG2、HCCLM3蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.35±0.12、0.88±0.06，而STAT3在此時(shí)間段卻變化不明顯。正常肝細(xì)胞STAT3及p-STAT3蛋白變化均不明顯（圖4）。

圖4 SG600-IL24干預(yù)后STAT3及p-STAT3蛋白的表達(dá)Figure4 Expressions of STAT 3 and p-STAT3 protein after SG600-IL24 infection

3 討 論

目前肝癌的基因治療方法較多，但多數(shù)方法在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也殺傷正常細(xì)胞，即不具腫瘤特異性，因而限制了其臨床應(yīng)用。因此，探尋既可選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞同時(shí)又不影響正常細(xì)胞的治療性基因已成為腫瘤基因治療的研究熱點(diǎn)。溶瘤病毒和基因治療研究的不斷深入促進(jìn)了基因病毒療法的發(fā)展，這種療法利用攜帶抗癌基因的溶瘤腺病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的特異性增殖及復(fù)制的特性，使抗癌基因的拷貝數(shù)大量增加，從而數(shù)百倍乃至上萬倍地提高抗癌基因的表達(dá)水平，最終殺滅腫瘤細(xì)胞，達(dá)到治療的目的[9]。本研究采用端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因啟動(dòng)子（TERTp）和缺氧基因啟動(dòng)子HRE來分別調(diào)控病毒復(fù)制必須基因E1A和E1B的表達(dá)，同時(shí)去除了E1A區(qū)與Rb蛋白結(jié)合的區(qū)域，使病毒只能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，比非溶瘤型的腺病毒Ad.mda-7效果要好，同時(shí)具備腫瘤特異性，課題組前期的研究[10]工作做過證實(shí)。我們構(gòu)建的SG600-IL24腺病毒正是應(yīng)用以上的策略來達(dá)到在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性復(fù)制的目的，對(duì)正常細(xì)胞影響很小，從而提高其有效性和安全性[11]。

酪氨酸激酶（JAK）家族和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子家族（STAT家族）在不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路方面發(fā)揮了重要的作用，參與了細(xì)胞增值，分化，生存和凋亡等[12]。大量的研究結(jié)果證明STAT家族，尤其是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子STAT3，被認(rèn)為是原癌基因，STAT3在很多人類腫瘤中被異常激活，包括肝癌，淋巴瘤，多種骨髓瘤，前列腺癌，乳腺癌，肺癌，頭頸部腫瘤，卵巢癌，胃癌等，STAT3信號(hào)通路已經(jīng)成了研究抗腫瘤基因治療的靶點(diǎn)[13-17]?；虮磉_(dá)的變化包括STAT3的持續(xù)激活代表著關(guān)鍵的分子事件，導(dǎo)致了細(xì)胞周期調(diào)控和凋亡的失衡，于是促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增生并大量繁殖，大量異型細(xì)胞的形成，最后導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。影響STAT3持續(xù)激活的基因很多，其中包括細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，如cyclin D1[18]和cyclin D2[19]等。STAT3基因的持續(xù)激活也會(huì)上調(diào)生存相關(guān)因子，Bcl-2、Bcl-xl和Mcl-1，凋亡抑制家族成員，survivin[20]和XIAP[21]等，另外還有誘導(dǎo)腫瘤血管生成的因子，如VEGF[22-24]等。STAT3在STAT家族7個(gè)成員中特別引起人們關(guān)注，因?yàn)镾TAT3被看作是惡性腫瘤治療的有效靶點(diǎn)。在惡性腫瘤細(xì)胞中抑制STAT3的持續(xù)激活已經(jīng)顯示出了能抑制腫瘤細(xì)胞的生長并誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。另外，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白也被認(rèn)為是調(diào)節(jié)STAT3活性的信號(hào)轉(zhuǎn)錄子，基于上述的理論基礎(chǔ)，我們觀察溶瘤腺病毒SG600-IL24在STAT3信號(hào)傳導(dǎo)方面所發(fā)揮的重要作用，探討其下游的信號(hào)通路抗凋亡的機(jī)理。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用溶瘤腺病毒SG600-IL24干預(yù)肝癌細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明溶瘤腺病毒SG600-IL24能抑制STAT3以及信號(hào)通路下游信號(hào)分子的基因和蛋白表達(dá)水平，SG600-IL24能抑制腫瘤細(xì)胞的生長，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，并且對(duì)正常肝細(xì)胞沒有明顯的影響。研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)異常的STAT3在促進(jìn)肝癌細(xì)胞生存，促進(jìn)其異型性方面發(fā)揮了重要的作用，結(jié)果提示STAT3以及信號(hào)通路下游信號(hào)分子c-myc、Bcl-xl、Bcl-2、cyclin D2、survivin、MMP-2、MMP-9、XIAP、OPN和VEGF基因和蛋白的表達(dá)水平均下調(diào)，隨著感染時(shí)間的延長，基因和蛋白表達(dá)水平逐步下降，而Bax隨時(shí)間的延長基因和蛋白表達(dá)逐步增強(qiáng)，磷酸化STAT3蛋白在感染后先上升后下降，在感染2 h達(dá)到峰值，而正常肝細(xì)胞L02卻沒有上述的變化。以前有研究[25]提示mda-7/IL-24選擇性殺傷黑色素瘤細(xì)胞是通過IL-20受體依賴途徑介導(dǎo)而不依賴于STAT3信號(hào)通路，然而，本研究利用溶瘤腺病毒SG600-IL24干預(yù)治療肝癌細(xì)胞卻發(fā)現(xiàn)SG600-IL24抗腫瘤的活性是通過抑制STAT3的活性來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，并抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。研究結(jié)果表明內(nèi)源性的STAT3下降的非常明顯，提示溶瘤腺病毒SG600-IL24很可能通過抑制肝癌細(xì)胞STAT3信號(hào)通路，最終導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，本研究揭示了溶瘤腺病毒SG600-IL24選擇性殺傷肝癌細(xì)胞的機(jī)制，結(jié)果表明異常的STAT3和其在促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長和異型性方面發(fā)揮了重要的作用。溶瘤腺病毒SG600-IL24可能通過抑制STAT3及下游的信號(hào)通路的基因和蛋白來達(dá)到抑癌的作用，而正常肝細(xì)胞幾乎不受此影響，使得溶瘤腺病毒SG600-IL24具有顯著的選擇性抗腫瘤效應(yīng)。所以可以預(yù)見，溶瘤腺病毒SG600-IL24將會(huì)是一種有效的抗腫瘤治療的手段，未來的病毒基因治療將在臨床上將發(fā)揮越來越關(guān)鍵的作用。