周文玉，湯娉婷，楊榮華2,，鄭 晶*

(1.邵陽市環(huán)境保護(hù)監(jiān)測站，湖南 邵陽 422000；2.長沙理工大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 長沙 410076；3.湖南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，湖南 長沙 410012)

細(xì)胞外pH值(Extracellular pH，pHe)在各種人體生理過程和化學(xué)反應(yīng)中扮演著重要角色[1-2]，因此，對pHe進(jìn)行檢測具有重要的生理與病理意義，發(fā)展一種能夠在缺氧環(huán)境下對細(xì)胞外pH值進(jìn)行原位成像分析的方法尤為重要。目前缺氧環(huán)境下細(xì)胞外微環(huán)境pH值的檢測鮮有報道。近年來，細(xì)胞膜表面固定化探針在再生醫(yī)學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)方面引起了人們的極大關(guān)注，但是這些固定化探針的構(gòu)建經(jīng)常涉及繁瑣的固定修飾過程[3]、復(fù)雜的基因調(diào)控[4],或需要特定的親和位點(diǎn)[5]，極大地限制了其實(shí)際應(yīng)用范圍和有效性?；诖?，Tan課題組第一次合成了二?；|(zhì)體-DNA共軛物(DNA-lipid)[6-7]。二酰基脂質(zhì)體(Lipid)是由兩條分別含有18個碳的疏水烷烴組成的磷脂鏈，研究表明該共軛物可以二酰基脂質(zhì)體為“尾巴”與細(xì)胞膜的磷脂雙分子層之間發(fā)生強(qiáng)烈的疏水作用從而自發(fā)地組裝到細(xì)胞膜表面[8-9]。此外，該共軛物還具有簡單易行、生物相容性好以及細(xì)胞通用性等優(yōu)點(diǎn)。i-motif結(jié)構(gòu)是指胞嘧啶寡核苷酸鏈上的C∶C+堿基對在酸性環(huán)境下交替排列及互相嵌入而形成的四聚體結(jié)構(gòu)[10]。

本文利用lipid可與細(xì)胞膜發(fā)生疏水相互作用，并結(jié)合i-motif結(jié)構(gòu)在酸性環(huán)境下可對pH值產(chǎn)生快速、可逆響應(yīng)的良好性質(zhì)[11-13]，將兩端標(biāo)記Cy3和 Cy5的具有i-motif結(jié)構(gòu)的DNA鏈作為一種比例型探針插入細(xì)胞膜表面，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞外pH值的檢測。在常氧環(huán)境中，細(xì)胞膜外pH值處于中性，具有i-motif結(jié)構(gòu)的DNA鏈兩端的熒光基團(tuán)處于分離狀態(tài)，Cy3和 Cy5之間不發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)效應(yīng)。缺氧時，由于細(xì)胞內(nèi)的糖酵解產(chǎn)生的大量乳酸改變了pH值的動態(tài)平衡，缺氧細(xì)胞上調(diào)細(xì)胞質(zhì)膜的鈉氫交換蛋白-1(NHE-1)等H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將H+排出細(xì)胞外，造成細(xì)胞外環(huán)境pH值降低。此時酸性的環(huán)境使i-motif結(jié)構(gòu)發(fā)生變化形成四鏈體，序列兩端的兩個熒光基團(tuán)相互靠近，Cy3(熒光供體)和 Cy5(熒光受體)之間發(fā)生強(qiáng)的FRET效應(yīng)，可通過測定序列兩端兩種熒光基團(tuán)熒光強(qiáng)度的比值實(shí)現(xiàn)常氧和缺氧環(huán)境中細(xì)胞膜外pH值的原位成像分析。

1 實(shí)驗部分

1.1 儀器與試劑

流式細(xì)胞儀(貝克曼庫爾特有限公司，美國)、激光共聚焦顯微鏡(奧林巴斯，日本)、熒光分光光度計(株式會社日立制作所，日本)；實(shí)驗用水為Milli-Q(18.2 MΩ·cm)超純水；所有試劑除特別說明外均為分析純。所用DNA序列見表1。

表1 所用的DNA序列Table 1 DNA sequences used in this paper

1.2 溶液的配制

0.2 mol/L的磷酸(PB)緩沖液：分別配制0.2 mol/L Na2HPO4和0.2 mol/L NaH2PO4母液，高溫滅菌后再將兩者按不同比例混合，并調(diào)至所需pH值。

0.01 mol/L的磷酸鹽(PBS)緩沖液(pH 7.4)：分別稱取0.8 g NaCl，0.02 g KCl，0.362 g Na2HPO4·12H2O，0.024 g KH2PO4溶于80 mL水中，調(diào)節(jié)pH值為7.4，定容至100 mL，搖勻，靜置，高溫滅菌，冷卻至室溫，在4 ℃環(huán)境中保存。

1.3 探針的制備與表征

1.3.1探針的制備所用寡核苷酸序列均按照 1.0 μmol的規(guī)格在ABI 3 400 DNA合成儀上合成，合成的序列信息見表1。采用兩步合成法[6]合成lipid，并利用DNA 合成儀將其自動偶聯(lián)到寡核苷酸鏈的5’末端。序列合成后再按照指定程序?qū)ζ溥M(jìn)行脫保護(hù)處理，然后加入冷乙醇(相對DNA 2.5倍體積)和3 mol/L氯化鈉(相對DNA 1/10 體積)進(jìn)行沉淀，離心并收集DNA的沉淀物，再加入0.2 mol/L三乙基銨乙酸鹽溶液將其溶解，以乙腈和0.2 mol/L三乙基銨乙酸鹽溶液作為流動相，利用高效液相色譜儀進(jìn)行分離純化。分別用C4柱(200 mm×4.6 mm)和 C18柱(250 mm×4.6 mm)對常規(guī)寡核苷酸和標(biāo)記了lipid的寡核苷酸進(jìn)行純化。通過紫外-可見分光光度計對純化后的寡核苷酸產(chǎn)物進(jìn)行測量并定量。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞膜修飾實(shí)驗用人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)來源于楊榮華課題組細(xì)胞中心，細(xì)胞實(shí)驗中所涉及的物品均經(jīng)過濾除菌或高壓滅菌處理。

在DMEM培養(yǎng)基中添加10%經(jīng)熱失活的胎牛血清和 0.5 mg/mL 青霉素-鏈霉素，并以此為細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行HeLa細(xì)胞培養(yǎng)。在修飾細(xì)胞膜之前，先用4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液(50 mmol/L HEPES,pH 7.3,270 mmol/L 氯化鈉)將細(xì)胞(2.5×105個)沖洗3次，然后加入DNA-lipid探針(1 μmol/L)置于室溫(25 ℃)下孵育30 min。再把細(xì)胞清洗3次以除去未結(jié)合的探針，最后將細(xì)胞重新分散在180 μL HEPES 緩沖液中。

圖1 DNA-lipid探針用于細(xì)胞外pH值檢測的原理圖

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測原理

基于“FRET”效應(yīng)的DNA-lipid探針對缺氧環(huán)境下細(xì)胞膜外pH值的傳感檢測原理如圖1所示。首先在一條具有i-motif結(jié)構(gòu)的DNA鏈兩端分別標(biāo)記Cy3和Cy5,再將這條序列的5’端連接疏水的lipid構(gòu)成核酸探針DNA-lipid。在pH>7.0的環(huán)境下，該探針處于剛性狀態(tài)，兩端的熒光基團(tuán)分離，未發(fā)生FRET；在pH<7.0的環(huán)境下，探針形成四聚體結(jié)構(gòu)，Cy3(供體)和Cy5(受體)彼此靠近，熒光從供體轉(zhuǎn)移至受體，發(fā)生FRET。利用lipid的性質(zhì)將探針修飾在細(xì)胞膜表面，可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜外pH值的監(jiān)測。常氧環(huán)境下，細(xì)胞外的pH值處于中性，i-motif結(jié)構(gòu)不會發(fā)生彎曲；處于缺氧環(huán)境時，腫瘤細(xì)胞會通過上調(diào)細(xì)胞質(zhì)膜上的H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將H+排出細(xì)胞外，從而造成細(xì)胞外環(huán)境呈酸性。酸性環(huán)境可使i-motif結(jié)構(gòu)發(fā)生變化形成四鏈體，兩個熒光基團(tuán)相互靠近，發(fā)生FRET，Cy3的熒光減弱，Cy5的熒光增強(qiáng)，通過測定兩者的熒光比值，可實(shí)現(xiàn)缺氧環(huán)境pH值的傳感監(jiān)測，從而促進(jìn)腫瘤的早期診斷。

2.2 探針序列體外篩選及表征

本實(shí)驗設(shè)計了如表1所示的5種不同的探針序列，并對其進(jìn)行優(yōu)化和表征。

2.2.1序列優(yōu)化將S1～S5序列分別置于pH 5.0和pH 7.0的PB緩沖液中，在548 nm激發(fā)波長下，收集565 nm和666 nm處的熒光，并計算出每種序列在兩種pH值環(huán)境下供體和受體的熒光比值，即RFA/FD(pH 7.0)/RFA/FD(pH 5.0)。結(jié)果顯示S3序列對pH值的響應(yīng)最好。因此，選定S3序列進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。

2.2.2序列表征用圓二色譜儀對S3序列的i-motif結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。結(jié)果顯示：pH 7.0時，DNA鏈的正峰在270 nm左右，負(fù)峰在250 nm左右；當(dāng)pH值降至5.0時，正峰紅移至285 nm左右，而負(fù)峰紅移至260 nm左右，該結(jié)果和文獻(xiàn)報道一致[14-15]，進(jìn)一步證實(shí)S3序列在酸性環(huán)境下生成了i-motif結(jié)構(gòu)。

圖2 DNA-lipid細(xì)胞表面固定前后流式細(xì)胞分析圖

2.3 細(xì)胞膜表面?zhèn)鞲衅鞯臉?gòu)建及表征

本文以Tan等[8]報道的修飾方法將探針固定到細(xì)胞表面，并考察了DNA-lipid在細(xì)胞膜上的組裝固定能力。以人的宮頸癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)為模型細(xì)胞，在其上修飾lipid-S3-TAMAR(在S3的兩端標(biāo)記lipid和TAMAR)，孵育1 h后用細(xì)胞溶酶體tracker染料LysoTracker Green進(jìn)行染色，然后用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行成像。結(jié)果顯示，LysoTracker Green的綠色熒光集中在溶酶體上，而羧基四甲基羅丹明(TAMAR)的紅色熒光均集中在細(xì)胞的輪廓周圍，表明探針已經(jīng)成功地固定至細(xì)胞表面。為了進(jìn)一步驗證細(xì)胞表面的固定化，使用流式細(xì)胞儀對修飾后的細(xì)胞進(jìn)行分析。結(jié)果如圖2所示，細(xì)胞未經(jīng)上述探針處理，只顯示微弱的TAMAR熒光，探針處理1 h 后，細(xì)胞熒光信號明顯增強(qiáng)，表明探針已經(jīng)被很好地修飾到細(xì)胞膜表面。

2.4 體外標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制

本實(shí)驗將探針溶于不同pH值的PB緩沖液中(pH 5.0～7.0)并測定其熒光變化，以考察探針在不同pH值環(huán)境下的工作情況，結(jié)果如圖3所示。圖3A為探針在不同的pH值下的FRET熒光光譜，并由此得到該探針的體外標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(圖3B)。從圖3B可以看出，在pH值從7.5變化到5.0的過程中，F(xiàn)RET效應(yīng)慢慢增強(qiáng)，F(xiàn)A/FD值擴(kuò)大了近6倍(從0.3到1.8)。這一pH值檢測區(qū)間與生理范圍正好接近，由此說明該探針適用于細(xì)胞周圍環(huán)境pH值的檢測。pH值從5.0變化到7.0的過程中，F(xiàn)RET效應(yīng)逐漸減弱，多次循環(huán)重復(fù)該實(shí)驗，結(jié)果如圖3B內(nèi)插圖所示，表明該實(shí)驗重現(xiàn)性及可逆性好，可用于連續(xù)監(jiān)測。

圖4 不同pH值環(huán)境下HeLa細(xì)胞的共聚焦成像圖

圖5 不同氧氣濃度程度下HeLa細(xì)胞的共聚焦成像圖

2.5 細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

為了考察該探針在細(xì)胞膜表面對pH值的響應(yīng)情況，本實(shí)驗將修飾了探針的細(xì)胞先用PBS緩沖液清洗3次，除去游離的探針，然后置于不同的pHe環(huán)境中進(jìn)行成像，并繪制了該探針在細(xì)胞表面的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果如圖4所示，在pH值從7.0變化到5.0的過程中，隨著pH值的降低，細(xì)胞表面紅色熒光的強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，而綠色熒光的強(qiáng)度逐漸降低，表明該探針對細(xì)胞外的pH值有著很好的響應(yīng)。同時，熒光比率成像的結(jié)果顯示，該探針對pH值具有明顯的依賴性。上述結(jié)果說明，本實(shí)驗設(shè)計的這種基于“FRET”效應(yīng)的比率型探針能有效地監(jiān)測細(xì)胞外pH值的變化，有望進(jìn)一步應(yīng)用于缺氧環(huán)境下細(xì)胞膜外微環(huán)境的pH值成像分析。

2.6 不同氧氣濃度環(huán)境下的細(xì)胞膜外pH值原位成像分析

將HeLa細(xì)胞和探針置于不同氧氣濃度環(huán)境，用PBS緩沖液孵育1 h后放入培養(yǎng)再孵育1 h，用激光共聚焦顯微鏡分別對其成像，結(jié)果如圖5所示。隨著氧氣濃度由20%(常氧)降至1%(全缺氧)，Cy3的熒光降低，而Cy5的熒光升高，并且FA/FD的比值呈規(guī)律性變化，結(jié)合細(xì)胞外pH值的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到在氧氣濃度由20%將至1%時，細(xì)胞膜外的pH值由6.9降至6.2。

3 結(jié) 論

本研究首次發(fā)展了一種基于二?；|(zhì)的i-motif核酸探針用于原位成像分析不同氧氣濃度下的細(xì)胞外pH值。該探針用FRET作為比率信號模式，能夠降低復(fù)雜生物因素的影響，使細(xì)胞外pH值檢測更精確。此外利用i-motif結(jié)構(gòu)作為H+的識別單元，對pH值的響應(yīng)靈敏度高且具有可逆性。該探針合成、操作簡單，通用性良好。