雷春妮 周小平 高黎紅 金 鳳 解迎雙 馬 鑫 齊安安 宋亞娟 王慧珺

初榨橄欖油(virgin olive oil)是由新鮮的油橄欖果實(shí)直接冷榨而成，不經(jīng)加熱和化學(xué)處理，完好地保存了最初的化學(xué)結(jié)構(gòu)、天然營養(yǎng)成分以及原果實(shí)的口味和香氣，幾乎是世界上唯一的天然狀態(tài)冷餐植物油[1]。由于橄欖油具有極佳的天然保健功效、美容功效和理想的烹調(diào)用途而被公認(rèn)為綠色保健食用油,素有“液體黃金”的美譽(yù)[2,3]。橄欖油特有的風(fēng)味與其質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)效益呈正相關(guān)，其含有的揮發(fā)物的種類、含量及相互間協(xié)調(diào)和抑制作用反映出的橄欖油風(fēng)味在很大程度上決定其感官品質(zhì)，并影響不同人群的消費(fèi)行為，也能體現(xiàn)其在加工、儲藏等過程中的品質(zhì)變化，可見研究橄欖油揮發(fā)性風(fēng)味成分具有重要價(jià)值。

如何對風(fēng)味成分進(jìn)行提取是橄欖油香味分析的關(guān)鍵步驟，選擇適宜的提取方法關(guān)系到橄欖油風(fēng)味成分定性及定量分析的準(zhǔn)確性。目前，對于食用油風(fēng)味成分的提取方法常見的有液萃取法(Liquid-liquid extraction，LLE)、頂空法(Headspace,HS)和固相微萃取法(solid phase microextraction， SPME)[4-12]。此外，熱脫附法(thermal desorption，TD)作為一種新型的揮發(fā)性成分分析預(yù)處理方法，具備操作簡單，靈敏度高，綠色環(huán)保，檢測限可達(dá)到10-9級等優(yōu)點(diǎn)，常見于環(huán)境、卷煙和植物揮發(fā)性物質(zhì)的提取分析，以及少量應(yīng)用于食品風(fēng)味測定[13-17]，而至今尚無熱脫附法分析食用油揮發(fā)性風(fēng)味成分的報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)分別采用液液萃取法、頂空法、頂空固相微萃取法及熱脫附法對橄欖油的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行提取，采用MassworksTM質(zhì)譜軟件結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法(gas chromatograph-mass spectrometry，GC-MS)對結(jié)果進(jìn)行定性分析，彌補(bǔ)了常規(guī)GC-MS譜庫檢索定性的不足，并針對最佳提取方法進(jìn)行了參數(shù)優(yōu)選，旨在確定適宜橄欖油風(fēng)味成分分析的最佳提取方法，為橄欖油風(fēng)味的有效評價(jià)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與設(shè)備

樣品：選取瓦耶霍特級初榨橄欖油為1號(西班牙)、伯爵特級初榨橄欖油為2號(西班牙)、太平之選特級初榨橄欖油為3號(西班牙)、帆船牌特級初榨橄欖油為4號(西班牙)、得科特級初榨橄欖油為5號(意大利)、卡拉佩利混合橄欖油為6號(意大利)、卡拉佩利特級初榨橄欖油為7號(意大利)、巴基斯坦特級初榨橄欖油為8號(巴基斯坦)、PATEROMIIICHELAKIS特級初榨橄欖油為9號(希臘)、敘利亞特級初榨橄欖油為10號(敘利亞)、祥宇特級初榨橄欖油為11號(中國)。本實(shí)驗(yàn)的橄欖油樣品均有甘肅隴南祥宇有限公司提供。

Agilent 7890A/5975C氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀；Clarus 600氣相色譜儀；AutoTD自動熱脫附解吸儀、AutoHS 自動頂空進(jìn)樣器、集熱式恒溫加熱器、90 mm×6.4 mm不銹鋼采樣管(內(nèi)裝150 mg Tenax-TA吸附劑)；手動固相微萃取裝置、萃取纖維頭(2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS、85 μmPA、100 μmPDMS)；SHC型純凈空氣泵。

1.2 分析方法

1.2.1 風(fēng)味物質(zhì)的提取方法

表1 風(fēng)味物質(zhì)的提取方法

注：“—”表示沒有采用進(jìn)樣儀器。

1.2.2 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析條件

色譜條件：色譜柱：HP-INNOWAX(60 m×0.250 mm×0.5 μm)；程序升溫：初始溫度60 ℃，保持1 min，以2 ℃/min的速率升至255 ℃，保持20 min；載氣：高純氦氣(純度≥99.999%)；進(jìn)樣口溫度：260 ℃；恒壓模式：10 psi；分流比：5∶1。

質(zhì)譜條件：電子電離(EI)源；電子能量：70 eV；接口溫度250 ℃；離子源溫度：230 ℃；溶劑延遲：8 min；質(zhì)量掃描范圍：m/z25～550 u。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法的選擇

以祥宇特級初榨橄欖油為原料，選擇橄欖油揮發(fā)性成分的總峰面積、總峰個數(shù)作為分析依據(jù)，對提取方法進(jìn)行優(yōu)選。同一橄欖油樣品在不同的提取方式下獲得揮發(fā)性組分，儀器進(jìn)樣參數(shù)一致，色譜圖在同一積分事件下獲得色譜圖峰面積和峰個數(shù)的數(shù)據(jù)，液液萃取法、頂空法、固相微萃取法、熱脫附法提取橄欖油揮發(fā)性組分對比結(jié)果見表2。如表2所示，頂空法對輕組分有所提取，對重組分幾乎沒有提取效果，色譜圖在12 min以后，基本沒有出峰，而峰面積和峰個數(shù)在四種提取方法中最低；液液萃取獲得的色譜圖在四種提取方法中響應(yīng)最低，最高峰響應(yīng)小于105 μV，不利于組分的鑒定分析，而所得峰面積和峰個數(shù)也顯著小于固相微萃取法和熱脫附法；固相微萃取法對輕組分的萃取效果較好，而對重組分萃取效果較差，色譜圖在30 min以后基本沒有出峰，且固相微萃取法由于其纖維萃取頭對揮發(fā)性組分的吸附具有特異選擇性，并不能全面反映樣品的揮發(fā)性成分組成；而熱脫附法在總峰面積和總峰個數(shù)上的提取效果均優(yōu)于其他三種方法，并操作簡單，重復(fù)性好，提取所得的微量易揮發(fā)組分較多，能夠真實(shí)地反映樣品揮發(fā)性成分的構(gòu)成。因而，選擇熱脫附法作為橄欖油風(fēng)味成分的提取方法。

表2 不同提取方法對萃取效果的影響

2.2 熱脫附參數(shù)優(yōu)化

對熱脫附參數(shù)的優(yōu)化主要采用經(jīng)氣相色譜分析得到的總峰面積及總峰面積與峰數(shù)的比值?？偡迕娣e是由一些主要峰決定的,可以反映不同條件下主要峰的變化情況?？偡迕娣e與峰數(shù)的比值能反映出萃取條件對所檢測到的峰數(shù)的影響,使優(yōu)化過程能對那些量少的成分負(fù)責(zé)[18]。

2.2.1 吸附溫度

吸附溫度優(yōu)化結(jié)果顯示(見圖1)，吸附溫度對樣品的吸附效率有很大影響，吸附溫度較低不利于香氣物質(zhì)的釋放，但高的吸附溫度會造成香氣物質(zhì)變化。吸附溫度為40 ℃與30 ℃相比較，總峰面積及總峰面積與峰數(shù)的比值有所提高，但各化合物間的相對比例和主要香氣物質(zhì)基本一致。吸附溫度為 90 ℃與40 ℃相比較：總峰面積和總峰面積與峰數(shù)的比值顯著增高，但低分子量的醛類、醇類物質(zhì)的相對含量有所降低，如正己醛在40 ℃時相對含量為19.022%，90 ℃時相對含量降低為1.693%；酯類、烯烴類、不飽和醛類物質(zhì)的相對含量極速升高，如乙酸葉醇酯在40 ℃時相對含量為5.986%，90 ℃時相對含量升至12.400%；各化合物間的相對比例發(fā)生了改變，使主要香氣成分也發(fā)生了改變，可能過高的吸附溫度使揮發(fā)性組分發(fā)生了酯化反應(yīng)和羥醛縮合反應(yīng)，有待進(jìn)一步確定。從檢測的效率以及檢測結(jié)果的全面性上考慮,宜采用40 ℃作為較佳的吸附溫度。此外，40 ℃接近人體體溫,測定的橄欖油樣品中揮發(fā)性組分的表現(xiàn)與其在人體感官系統(tǒng)中的表現(xiàn)有一致性。

圖1 吸附溫度對測定結(jié)果的影響

2.2.2 吸附時間

為了考察吸附時間對樣品揮發(fā)性組分富集的影響，本實(shí)驗(yàn)選擇吸附時間0.5 h、1 h、2 h、3 h進(jìn)行優(yōu)化。從圖2可看出,隨著吸附時間的延長,吸附效果明顯提高。在0.5～2 h之間,總峰面積和總峰面積與峰數(shù)比值變化極顯著(P<0.01)。但在2～3 h,總峰面積及總峰面積與峰數(shù)比值基本持平,二者均在2h時達(dá)到最大值,之后保持不變,說明吸附劑在2 h便能吸附飽和。通過對色譜圖的分析,發(fā)現(xiàn)增加的峰大部分出現(xiàn)于保留時間24 min后,可能是由于這些物質(zhì)具有較高的沸點(diǎn),如果萃取時間太短,它們將來不及揮發(fā)而不被吸附,因此一定長的吸附時間對于它們顯得更為重要。大部分主要揮發(fā)物峰面積隨吸附時間的變化規(guī)律與總峰面積的變化規(guī)律一致,但有的比總峰面積達(dá)到穩(wěn)定所需的時間短,如正己醛。綜合考慮,選擇吸附時間2 h為宜。

圖2 吸附時間對測定結(jié)果的影響

2.2.3 解吸溫度和解吸時間

解吸溫度及時間的選擇直接關(guān)系著被吸附物質(zhì)從樣品管和冷阱管解析的程度。解吸溫度如果過低可導(dǎo)致目標(biāo)化合物的解析不完全，不僅會影響方法的靈敏性,而且會污染后續(xù)樣品；如果溫度過高可導(dǎo)致吸附劑變性，減少使用壽命，影響吸附效果。在解吸溫度確定的條件下，解吸時間的長短決定了樣品解析是否完全、分析的準(zhǔn)確度和靈敏度。本實(shí)驗(yàn)對解吸溫度和解吸時間的考察方法為：在其他參數(shù)不變的情況下，改變解吸溫度或解吸時間參數(shù)進(jìn)樣時，樣品管(樣品)后緊接已老化的空白采樣管(空白)，以公式：解析效率=樣品峰面積/(樣品峰面積+空白峰面積)×100%計(jì)算解析效率。綜合考慮檢測效率和檢測成本，確定較佳的參數(shù)為一級解吸溫度180 ℃；一級解吸時間5 min；二級解吸溫度280 ℃；二級解吸時間8 min。冷阱溫度是熱脫附冷阱聚焦功能的一個關(guān)鍵參數(shù)，冷阱低溫吸附并瞬間升溫解吸，降低了系統(tǒng)誤差，提高了分析的靈敏度，改善了譜帶展寬問題，在儀器條件允許范圍內(nèi)，采用-30 ℃的冷阱溫度進(jìn)行分析。

注：圖中峰號與表3的一致。

2.3不同品種油橄欖的初榨橄欖油中揮發(fā)性風(fēng)味成分分析

按照優(yōu)化后的熱脫附條件對初榨橄欖油揮發(fā)性成分進(jìn)行GC-MS分離鑒定，得到初榨橄欖油香氣成分的總離子流圖(見圖3)。GC-MS譜圖利用NIST 11

表3 初榨橄欖油的揮發(fā)性風(fēng)味成分鑒定結(jié)果及相對含量

標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索對揮發(fā)性組分進(jìn)行初步定性，然后用MassworksTM質(zhì)譜解析軟件對GC- MS譜圖進(jìn)行校正，測定各組分的模擬精準(zhǔn)分子量，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，對橄欖油揮發(fā)性組分進(jìn)一步鑒定，最終得到橄欖油揮發(fā)性組分的定性結(jié)果，見表3。在11個初榨橄欖油樣品的香氣中共分離鑒定出22種化合物，按官能團(tuán)的不同可以分為5大類物質(zhì)，分別為：醇類(4.903%～32.424%)、醛類(20.476%～75.902%)、酯類(0.947%～13.769%)、酮類(1.905%～7.166%)、烯烴類(0.989%～11.981%),見圖4。

由表3可知，1號瓦耶霍特級初榨橄欖油分離鑒定出23種揮發(fā)性化合物，其中相對含量較高的組分

圖4 初榨橄欖油的揮發(fā)性風(fēng)味成分分析

有乙酸葉醇酯(12.174%)、葉醇(12.095%)、反-2-己烯醛(10.012%)、1-十三烯(8.751%)；2號伯爵特級初榨橄欖油分離出24種，其中相對含量較高的組分有反-2-己烯醛(20.87%)、乙酸葉醇酯(10.849%)、葉醇(10.040%)、正己醛(7.936%)；3號太平之選特級初榨橄欖油分離出22種，其中相對含量較高的組分有反-2-己烯醛(17.114%)、葉醇(12.411%)、正己醇(10.325%)、反-2-己稀-1-醇(7.164%)；4號帆船牌特級初榨橄欖油分離出18種，其中相對含量較高的組分有反-2-己烯醛(38.862%)、正己醛(13.453%)、3-戊酮(5.381%)、正己醇(5.067%)；5號得科特級初榨橄欖油分離出20種，其中相對含量較高的組分有反-2-己烯醛(44.335%)、反-2-己稀-1-醇(8.303%)、葉醇(6.777%)、乙酸葉醇酯(6.620%)；6號卡拉佩利混合橄欖油分離出14種，其中相對含量較高的組分有正己醛(25.560%)、反-2-己烯醛(17.181%)、正己醇(7.101%)、反-2-己稀-1-醇(5.792%)；7號卡拉佩利特級初榨橄欖油分離出22種，其中相對含量較高的組分有反-2-己烯醛(29.107%)、乙酸葉醇酯(10.938%)、正己醛(10.596%)、葉醇(7.976%)；8號巴基斯坦特級初榨橄欖油分離出21種，其中相對含量較高的組分有反-2-己烯醛(23.737%)、正己醇(11.035%)、反-2-己稀-1-醇(7.021%)、檸檬烯(6.399%)；9號PATEROMIIICHELAKIS特級初榨橄欖油分離出23種，其中相對含量較高的組分有反-2-己烯醛(35.052%)、正己醛(19.022%)、乙酸葉醇酯(5.986%)、反-2-己稀-1-醇(4.881%)、；10號敘利亞特級初榨橄欖油分離出21種，其中相對含量較高的組分有正己醛(38.341%)、反-2-己烯醛(27.830%)、壬醛(3.087%)；11號祥宇特級初榨橄欖油分離出21種，其中相對含量較高的組分有反-2-己烯醛(53.772%)、正己醛(8.575%)、葉醇(4.648%)、正己醇(4.047%)。

2.3.1 醇類化合物及風(fēng)味

有8種醇類物質(zhì)被識別出來，主要為C5和C6的化合物，這些化合物對初榨橄欖油的氣味特征有積極的貢獻(xiàn)[19]。在11種初榨橄欖油中相對含量較高的有葉醇(0.875%～12.411%)呈新鮮草葉的清香和蘋果青香、正己醇(0.425%～11.035%)有水果香氣及芬芳的風(fēng)味、反-2-己烯-1-醇(1.474%～8.303%)呈清香型；此外，除1號瓦耶霍特級初榨橄欖油、4號帆船牌特級初榨橄欖油、6號卡拉佩利混合橄欖油、8號巴基斯坦特級初榨橄欖油外，其他7種初榨橄欖油中相對含量較高的還有1-戊烯-3-醇(1.246%～2.168%)呈水果香；1號瓦耶霍特級初榨橄欖油和6號卡拉佩利混合橄欖油中相對含量較高的有2-乙基己醇(2.791%～3.298%)，具有甜味和淡淡的花香，其他各醇類物質(zhì)的含量相對較低。從文獻(xiàn)中得知，這些醇類化合物主要通過脂氧合酶途徑合成，包括酶的氧化、裂解(過氧化氫酶)；又通過醇脫氫的作用減少(醇脫氫酶)，由于葉醇需要較低的的脂肪氧合酶的活性，故其相對含量較高[20]。

2.3.2 醛類化合物及風(fēng)味

8種醛類物質(zhì)被鑒定出來，主要為C6、C7～C9的醛，而C6的醛則是對初榨橄欖油的氣味特征貢獻(xiàn)最大的物質(zhì)[21]。C6的醛中反-2-己烯醛(10.012%～53.772%)、正己醛(5.323%～38.340%)在11種初榨橄欖油中相對含量較高，是初榨橄欖油水果香、青草香的主要貢獻(xiàn)者。其中，反-2-己烯醛則是相對含量最高的物質(zhì)，應(yīng)是初榨橄欖油中的主體香氣成分。反-2-己烯醛除通過脂氧合酶途徑產(chǎn)生外，還可經(jīng)不穩(wěn)定的反-3-己烯醛快速異構(gòu)化為較穩(wěn)定的反-2-己烯醛[20]。除4號、5號、7號、11號橄欖油外，其他7種初榨橄欖油中相對含量較高的還有壬醛(1.100%～3.349%)具有脂肪和柑橘的風(fēng)味；4號相對含量較高的有Z-2-庚烯醛(1.993%)。6號相對含量較高的有辛醛(2.267%)、Z-2-庚烯醛(2.118%)，而同樣是意大利橄欖油的5號和7號中相對較低，甚至未檢出；此外6號橄欖油中未檢出2-己烯醛，其他10種橄欖油中均有檢出。辛醛在5號和11號橄欖油中未檢出，其他9種橄欖油中均有檢出；(E,E)-2,4-己二烯醛在1號、2號及6號橄欖油中未檢出，其他8種均有檢出。由上述分析可知：4個西班牙品牌(1～4號)中，4號主香氣成分反-2-己烯醛相對含量明顯高于其他三種；3個意大利品牌(5～7號)中，6號卡拉佩利混合橄欖油與5號、7號特級初榨橄欖油的醛類物質(zhì)相對含量明顯有差異。醛的形成可以通過影響醇脫氫酶的活性進(jìn)而進(jìn)一步加快醇的分解，因此，醛在一定程度上可抑制醇的生成[22]。長鏈醛在所分析的樣品中的含量較低，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道這些化合物可被視為氧化標(biāo)志物及樣品品質(zhì)良好的表征[23]。

2.3.3 酮類、酯類和烯烴類各化合物及風(fēng)味

酮類、酯類和烯烴類各化合物也是初榨橄欖油揮發(fā)性組分中的重要組成成分。酮類主要為C5的酮，有3-戊酮(1.119%～5.381%)和1-戊烯-3-酮(nd～0.786%)，一般對橄欖油的氣味具有積極的貢獻(xiàn)，3號、4號、6號、8號、9號橄欖油中未鑒定出1-戊烯-3-酮。酮存在于初榨橄欖油的香氣中其可能的原因是與果實(shí)中內(nèi)源酶的活性相關(guān)[23]。酯類物質(zhì)有乙酸己酯(nd～2.495%)和乙酸葉醇酯(0.681%～12.174%)兩種，其含量相對較低，這可能是由油橄欖果的成熟度所引起的；雖然酯類物質(zhì)含量低檢測出的化合物少，但對初榨橄欖油的氣味特征能夠產(chǎn)生積極的影響，尤其對果香味這一屬性有積極的影響。除了以上來自脂氧合酶途徑的物質(zhì)外，還有一些含量較低的烯烴類化合物，主要有檸檬烯(0.098%～1.678%)、Z-羅勒烯(0.560%～1.704%)和紫蘇烯(nd～1.214%)，現(xiàn)有文獻(xiàn)對這類物質(zhì)的來源鮮有報(bào)道，故其來源需待進(jìn)一步研究確定。

綜合分析可知，不同國家(西班牙、意大利、巴基斯坦、希臘、敘利亞、中國)的初榨橄欖油揮發(fā)性組分存在差異；同一國家(西班牙1～4號)的初榨橄欖油揮發(fā)性組分存在差異；同一國家不同等級橄欖油(意大利5號、6號)揮發(fā)性組分存在差異。初榨橄欖油揮發(fā)性組分很大程度上取決于油橄欖品種和產(chǎn)地，此外加工工藝不同也可能是造成揮發(fā)性組分差異的原因，有待進(jìn)一步確定分析。

3 結(jié)論

3.1 熱脫附法相較于液液萃取法、頂空法及固相微萃取法，因其提取效果好，操作簡單，重復(fù)性好，對橄欖油中小分子、易揮發(fā)的微量成分不會造成破壞等優(yōu)點(diǎn)，能夠更真實(shí)地反映樣品揮發(fā)性成分的構(gòu)成，更適用于橄欖油揮發(fā)性風(fēng)味成分的提取分析。

3.2 優(yōu)化后橄欖油風(fēng)味成分分析的熱脫附參數(shù)為：吸附溫度40 ℃；吸附時間2 h；一級解吸溫度180 ℃；一級解吸時間5 min；二級解吸溫度280 ℃；二級解吸時間8 min；冷阱溫度-30 ℃。熱脫附技術(shù)用于橄欖油香氣成分分析操作簡單，濃縮富集效率高，重現(xiàn)性好，其特有的冷阱聚焦功能，有效的改善了譜帶展寬的問題，提高了檢測的靈敏度，并通過兩級解吸充分釋放香氣成分，真實(shí)全面地反映了橄欖油香氣成分的構(gòu)成。

3.3 TD-GC/MS法結(jié)合MassworksTM質(zhì)譜解析軟件共鑒定出橄欖油揮發(fā)性成分26種，有醇類、醛類、酯類、酮類、烴類，協(xié)同作用共同體現(xiàn)出橄欖油特征性風(fēng)味。經(jīng)過分析得知，不同國家的初榨橄欖油揮發(fā)性組分存在差異；同一國家的初榨橄欖油揮發(fā)性組分存在差異；同一國家不同等級橄欖油揮發(fā)性組分存在差異。