徐 華 楊德孟 樓喬明 張進(jìn)杰 楊文鴿 徐大倫

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211)

竹柏(Podocarpusnagi)，又名羅漢柴、山杉、鐵甲樹、椰樹等，為羅漢松科(Podocarpaceae)竹柏屬(Nageia)的一種常綠裸子植物，廣泛分布于我國浙江、福建和廣東等長江以南地區(qū)。竹柏是我國重要的藥原植物，其有著悠久的藥用歷史，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤及抗病毒等藥理作用[1-2]。竹柏種子種粒大，單株產(chǎn)量高，且富含油脂，是優(yōu)良的油料能源樹種，具有很高油脂開發(fā)潛力。

目前，國內(nèi)外對竹柏的研究主要集中在育苗種植和藥理作用等方面，而對其種仁油脂提取、油脂成分和抗氧化活性等方面的研究鮮見報道。因此，本研究以竹柏種仁為原料，采用5種方法對其油脂進(jìn)行提取，并通過核磁共振(NMR)和氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)技術(shù)分別對竹柏種仁油脂成分和脂肪酸組成進(jìn)行分析，同時結(jié)合DPPH自由基清除法和羥基自由基清除法對其油脂的抗氧化活性進(jìn)行研究，以期為竹柏資源的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

竹柏(Podocarpusnagi)種籽；氘代氯仿(CDCl3，氘代度99.8%+0.03%TMS)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)；三氯甲烷、甲醇、正己烷、乙醇、甲基叔丁基醚和硫酸鈉等分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A型氣相色譜儀；M7-80EI型質(zhì)譜儀；AVANCE Ⅲ 400 MHz超導(dǎo)核磁共振譜儀；SpectraMax i3型多功能酶標(biāo)儀；RV-10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.3 試驗方法

1.3.1 種籽預(yù)處理

將竹柏種籽于50 ℃干燥至恒重，去殼后粉碎，并經(jīng)40目過篩備用。

1.3.2 油脂提取

Folch法[3]：取2 g樣品， 加入40 mL三氯甲烷-甲醇混合液(2∶1)超聲30 min；過濾后，加入8 mL 0.9%氯化鈉溶液，振蕩后經(jīng)靜置分層，取三氯甲烷層，用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮后，于105 ℃干燥至恒重。

Bligh-Dyer法[4]：取2 g樣品，依次加入20 mL甲醇、10 mL三氯甲烷和8 mL蒸餾水，混合液超聲30 min，再依次加入10 mL三氯甲烷和10 mL蒸餾水；過濾后，經(jīng)靜置分層，取三氯甲烷層，用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮后，于105 ℃干燥至恒重。

甲基叔丁基醚法[5]：取2 g樣品，依次加入9 mL甲醇和30 mL甲基叔丁基醚，混合超聲30 min，再加入37.5 mL蒸餾水，經(jīng)靜置分層，收集甲基叔丁基醚層，減壓濃縮后，于105 ℃干燥至恒重。

正己烷-異丙醇法[6]：稱取2 g樣品，加入40 mL正己烷-異丙醇混合液(3∶2)，混合超聲30 min，經(jīng)抽濾除雜，加入16 mL 10 g/L Na2SO4溶液，經(jīng)靜置分層，收集正己烷層，減壓濃縮后，于105 ℃干燥至恒重。

索氏提取法[7]：取2 g樣品，裝入濾紙筒中，取50 mL石油醚(30～60 ℃)，于80 ℃提取3 h，收集石油醚，減壓濃縮后，于105 ℃干燥至恒重。

1.3.3 核磁共振分析

取50 mg樣品，加入0.6 mL氘代氯仿溶解，轉(zhuǎn)移至核磁管中用于核磁共振分析。氫譜參數(shù)：脈沖序列zg30，檢測溫度為293.4 K，90°脈沖寬度P1為10.00 s，譜寬SWH為8 012.82 Hz，脈沖延遲時間D1為1 s，采樣點數(shù)TD為6 5536，掃描次數(shù)NS為16，空掃DS為2；碳譜參數(shù)：脈沖序列zgpg30，檢測溫度294.1 K，90°脈沖寬度P1為9.50 s，譜寬SWH為24 038.46 Hz，脈沖延遲時間D1為2 s，采樣點數(shù)TD為6 5536，掃描次數(shù)NS為50，空掃DS為4。氫譜和碳譜的化學(xué)位移均以四甲基硅烷(TMS)為標(biāo)準(zhǔn)校正，并利用MestReNova軟件對圖譜進(jìn)行分析。

1.3.4 甲酯化衍生

取50 mg竹柏種仁油脂，加入2 mL不同濃度的KOH-甲醇溶液(0、0.5、1.0、1.5、2.0 mol/L)，室溫反應(yīng)3 min；依次加入1 mL飽和氯化鈉溶液和1 mL正己烷，振蕩后5 000 r/min離心2 min，取正己烷層，用于1H-NMR和GC-MS分析。

1.3.5 脂肪酸組成分析

色譜條件：DB-WAX 毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度250 ℃，檢測器溫度250 ℃；升溫程序：初始溫度150 ℃，保持3.5 min，以20℃/min升至200 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min升至280 ℃，保持20 min；進(jìn)樣量1.0 μL，分流比50∶1；以氦氣為載氣，載氣流量1 mL/min，溶劑延遲時間：3 min。

質(zhì)譜條件：GC-MS接口溫度250 ℃，EI離子源，離子源溫度200 ℃，電離能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍：m/z 50～650 u。

1.3.6 抗氧化活性測定

DPPH自由基和羥基自由基清除率實驗參照文獻(xiàn)[8-9]方法進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

除核磁共振和氣相色譜-質(zhì)譜外，其他指標(biāo)均平行測定3次，并利用 SPSS18.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示；同時采用單因素方差分析法(ANOVA，Tukey 檢驗)進(jìn)行顯著性檢驗，并采用 Duncan’s 法進(jìn)行單因子多重比較分析，P<0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹柏種仁油脂提取

通過5種方法對竹柏種仁的油脂進(jìn)行提取，油脂提取結(jié)果列于表1。從表1可知，不同方法對竹柏種仁油脂提取率具有顯著差異(P<0.05)，其中 Folch法的提取率最高(53.81%)，Bligh-Dyer法(52.00%)、甲基叔丁基醚法(50.74%)和正己烷-異丙醇法(49.93%)次之，而索氏提取法(46.83%)最低。綜合比較5種方法發(fā)現(xiàn)有機溶劑的極性和溶解性是影響竹柏種仁油脂提取率的重要因素。有機溶劑提取法主要基于相似相溶原理，F(xiàn)olch法、Bligh-Dyer法、甲基叔丁基醚法和正己烷-異丙醇法均為雙溶劑提取體系，其中極性溶劑與竹柏種仁細(xì)胞膜的極性脂結(jié)合，進(jìn)而破壞脂質(zhì)與蛋白質(zhì)分子間的氫鍵和靜電作用，使非極性溶劑進(jìn)入細(xì)胞并溶解胞內(nèi)疏水的油脂成分，從而提高油脂提取率，因此上述4種方法的油脂提取率顯著高于索氏提取法(P<0.05)[10-11]。同時，三氯甲烷對油脂的溶解性優(yōu)于甲基叔丁基醚和正己烷，這也導(dǎo)致Folch法和Bligh-Dyer法的提取率高于甲基叔丁基醚法和正己烷-異丙醇法。綜合考慮油脂提取率，F(xiàn)olch法對竹柏種仁油脂的提取效果最好，是理想的提取方法。因此采用Folch法對竹柏種仁油脂進(jìn)行提取，并用于后續(xù)的油脂成分和抗氧化活性分析。

表1 不同方法的竹柏種仁油脂提取率

圖1 竹柏種仁油脂的核磁共振碳譜圖

2.2 油脂成分分析

竹柏種仁油脂的核磁共振碳譜(13C-NMR)見圖1，并根據(jù)13C-NMR譜中化學(xué)位移和信號模式，參考文獻(xiàn)[12-13]對信號峰進(jìn)行歸屬?；瘜W(xué)位移δ=176.82處譜峰歸屬為游離脂肪酸羰基中的碳原子；δ=173.17～173.03和δ=172.77處譜峰分別歸屬為甘油骨架sn-1,3位和sn-2位的脂肪酸羰基碳原子；δ=131.00～129.64歸屬為單不飽和脂肪酸的烯烴碳原子，而δ=128.30～127.86歸屬為亞油酸的烯烴碳原子；δ=70.82 歸屬為甘油磷脂中sn-2位上的碳原子；δ=68.86 和δ=62.07 分別歸屬為甘油三酯sn-2位和sn-1,3位上的碳原子；δ=54.35歸屬為磷脂酰膽堿(PC)中與氮原子相連的甲基碳原子((CH3)3N-)；δ=34.16～34.00和δ=33.40處譜峰分別歸屬為與sn-2位和sn-1,3位羰基直接相連的亞甲基上的碳原子；δ=14.13～14.09處譜峰歸屬為脂肪酸末端甲基上的碳原子，甾醇C18(-CH3)特征峰信號在δ=11.55處。

根據(jù)13C-NMR共振峰面積進(jìn)行定量分析可知：竹柏種仁油脂中甘油磷脂(GPL)與甘油三酯(TAG)的摩爾比為0.03，游離脂肪酸與總脂肪酸的摩爾比為0.02，而甾醇與總脂肪酸的摩爾比不足0.01，表明竹柏種仁油脂的主要成分為甘油三酯，而磷脂、游離脂肪酸和甾醇等成分含量極低。

2.3 脂肪酸組成分析

2.3.1 甲酯化衍生

竹柏種仁油脂及其脂肪酸甲酯的核磁共振氫譜(1H-NMR)見圖2。根據(jù)1H-NMR譜中化學(xué)位移和信號模式可知，δ=5.30～5.25譜峰為甘油骨架中次甲基氫質(zhì)子，δ=4.32～4.28和δ=4.17～4.13譜峰為甘油骨架上的亞甲基氫質(zhì)子；而δ=3.70譜峰為脂肪酸甲酯中甲氧基氫質(zhì)子，δ=2.34～2.29譜峰為脂肪酸羰基端2位亞甲基氫質(zhì)子，因此可通過甲氧基氫質(zhì)子與脂肪酸羰基端2位亞甲基氫質(zhì)子的信號峰面積比來計算衍生過程中的甲酯轉(zhuǎn)化率[14-16]。竹柏種仁油脂在室溫條件下，經(jīng)不同濃度KOH-甲醇溶液衍生3 min，其甲酯轉(zhuǎn)化率列于表2。由表2可知，當(dāng)KOH濃度為0.5 mol/L時，甲酯轉(zhuǎn)化率僅為43.86%；隨著KOH濃度增加，甲酯轉(zhuǎn)化率逐漸增加；當(dāng)KOH濃度為2 mol/L時，甲酯轉(zhuǎn)化率達(dá)到99.80%，表明此時竹柏種仁油脂幾乎完全轉(zhuǎn)化為脂肪酸甲酯。

圖2 竹柏種仁油脂(A)和脂肪酸甲酯(B)的核磁共振氫譜圖

表2 竹柏種仁油脂的甲酯轉(zhuǎn)化率

2.3.2 脂肪酸分析

竹柏種仁油脂經(jīng)2 mol/L KOH-甲醇溶液室溫甲酯化衍生3 min后，采用氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)對其脂肪酸組成進(jìn)行分析，脂肪酸總離子流色譜圖見圖3，鑒定結(jié)果列于表3。

圖3 竹柏種仁油脂的脂肪酸總離子流色譜圖

表3 竹柏種仁油脂的脂肪酸組成

從竹柏種仁油脂中共鑒定出7種脂肪酸，主要為棕櫚酸(C16∶0)、油酸(C18∶1n-9)、亞油酸(C18∶2n-6)和花生烯酸(C20:1n-9)。竹柏種仁油脂的脂肪酸組成以不飽和脂肪酸為主，含量高達(dá)93.13%，且其中以亞油酸(43.49%)含量最高，花生烯酸(30.65%)和油酸(18.65%)含量次之；而飽和脂肪酸含量較低，僅為6.87%。

油酸和花生烯酸作為人體重要的單不飽和脂肪酸，能有效調(diào)節(jié)血脂，降低血清總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇含量，預(yù)防高血脂和動脈粥樣硬化等心血管疾病，同時亦能有效減少機體內(nèi)的氧化應(yīng)激產(chǎn)物，降低機體的過度性炎癥反應(yīng)，有助于機體康復(fù)[17-18]。亞油酸是人體必需的n-6型多不飽和脂肪酸，參與調(diào)節(jié)人體生理代謝，可有效預(yù)防高血脂和高膽固醇血癥，并具有抗癌、降血壓和預(yù)防動脈硬化等功效[19-20]。竹柏種仁油脂中富含油酸、亞油酸和花生烯酸等不飽和脂肪酸，表明其具有很高的營養(yǎng)價值和保健功效，可作為特種植物油料進(jìn)行開發(fā)利用，具有良好的應(yīng)用前景和經(jīng)濟價值。

2.4 抗氧化活性

竹柏種仁油脂對DPPH自由基清除率和羥基自由基清除率分別見圖4和圖5。由圖4可知，竹柏種仁油脂對DPPH自由基具有一定的清除能力，且清除率隨濃度增加而逐漸升高，并呈現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)；當(dāng)油脂濃度為6 mg/mL時，清除率達(dá)到74.73%。通過清除率擬合曲線，可得竹柏種仁油脂清除DPPH自由基的IC50為3.36 mg/mL。由圖5可知，竹柏種仁油脂能有效清除羥基自由基，且清除率隨濃度增加而顯著提升；當(dāng)油脂濃度為0.6 mg/mL時，清除率達(dá)到75.05%。通過清除率擬合曲線，可得竹柏種仁油脂清除羥基自由基的IC50為0.38 mg/mL。DPPH自由基是一種穩(wěn)定的自由基，其廣泛用于評估油脂的自由基清除活性[21]；羥基自由基是活性氧中最活潑的自由基之一，其易與生物分子反應(yīng)，引起組織損傷或細(xì)胞死亡[22]。竹柏種仁油脂能有效清除DPPH自由基和羥基自由基，表明其具有較好的抗氧化能力，可用于功能性油脂產(chǎn)品的開發(fā)。

圖4 竹柏種仁油脂的DPPH自由基清除率

圖5 竹柏種仁油脂的羥基自由基清除率

3 結(jié)論

3.1 5種方法對竹柏種仁油脂的提取率具有顯著差異(P<0.05)。Folch法的油脂提取率最高(53.81%)，顯著高于Bligh-Dyer法、甲基叔丁基醚法和正己烷-異丙醇法等4種提取方法，是竹柏種仁油脂提取的理想方法。

3.2 竹柏種仁油脂以甘油三酯為主，磷脂、游離脂肪酸和甾醇含量極低。竹柏種仁油脂經(jīng)2 mol/L KOH-甲醇溶液室溫衍生3 min，甲酯轉(zhuǎn)化率達(dá)到99.80%；同時竹柏種仁油脂脂肪酸以油酸(C18∶1n-9，18.65%)、亞油酸(C18∶2n-6，43.49%)和花生烯酸(C20∶1n-9，30.65%)為主，具有很高的營養(yǎng)價值和保健功效。

3.3 竹柏種仁油脂對DPPH自由基和羥基自由基具有較好的清除能力，且兩者的IC50分別為3.36 mg/mL和0.38 mg/mL，表明竹柏種仁油脂具有較好的抗氧化能力，可作為特種植物油料進(jìn)行開發(fā)利用，具有良好的開發(fā)和應(yīng)用前景。