柴成梁 唐柏飛 常曉嬌 林振泉 孫長(zhǎng)坡

(國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院糧油加工研究所1，北京 100037)(中國(guó)糧食研究培訓(xùn)中心2，北京 100031)

轉(zhuǎn)基因大豆是利用現(xiàn)代生物技術(shù)，將外源基因?qū)氩⒄系酱蠖够蚪M中，通過(guò)外源基因的穩(wěn)定遺傳和表達(dá)，實(shí)現(xiàn)大豆的品質(zhì)創(chuàng)新和性狀改良[1]，是世界上商品化最早、推廣應(yīng)用速度最快、種植面積最廣的轉(zhuǎn)基因糧食作物[2]。我國(guó)是轉(zhuǎn)基因大豆的進(jìn)口大國(guó)，且呈逐年增加的趨勢(shì)，2017年我國(guó)進(jìn)口9 553萬(wàn)t大豆，其中主要為轉(zhuǎn)基因大豆[3]。由轉(zhuǎn)基因大豆加工而成的大豆油、色拉油成為進(jìn)入消費(fèi)者生活的食用油。判定食用的大豆油是否含有轉(zhuǎn)基因成分，以及含有哪種外源轉(zhuǎn)基因成分，是國(guó)家監(jiān)管部門(mén)、大豆加工企業(yè)和公眾密切關(guān)心、關(guān)注的問(wèn)題。然而，大豆油在制備精煉過(guò)程中破壞了大豆的DNA[4-5]，造成檢驗(yàn)時(shí)DNA富集難度增加，嚴(yán)重影響了大豆油轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的準(zhǔn)確度。到目前為止，國(guó)家已經(jīng)頒布的標(biāo)準(zhǔn)中沒(méi)有涉及轉(zhuǎn)基因大豆油的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，而對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)無(wú)法應(yīng)用于大豆油的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)[6]。

數(shù)字PCR(digital PCR，dPCR)技術(shù)是近些年來(lái)興起的一項(xiàng)針對(duì)單分子目標(biāo)DNA的定量分析技術(shù)，其原理是將待測(cè)樣品分成幾十到幾萬(wàn)份，相應(yīng)分配到不同的反應(yīng)單元中，每個(gè)反應(yīng)單元中不含有或含有一個(gè)至多個(gè)拷貝的目標(biāo)DNA分子，在每個(gè)反應(yīng)單元中分別對(duì)目標(biāo)DNA分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后采用泊松概率分布公式等統(tǒng)計(jì)學(xué)公式分析單個(gè)反應(yīng)單元的陽(yáng)性信號(hào)，來(lái)定量DNA拷貝數(shù)[7]。數(shù)字PCR技術(shù)擺脫了對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的依賴(lài)，具有更高靈敏度和準(zhǔn)確度。數(shù)字PCR技術(shù)可以分為兩類(lèi):微滴式數(shù)字PCR(droplet dPCR，ddPCR)和芯片式數(shù)字PCR(chip dPCR，cdPCR)[8]。數(shù)字PCR作為更精確和更靈敏的DNA檢測(cè)新技術(shù)，為轉(zhuǎn)基因成分的分析提供了新的手段，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究者不斷探索利用數(shù)字PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行分析。Corbisier等[9]利用數(shù)字PCR分析了玉米種子中外源基因和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的拷貝數(shù)之比，該結(jié)果熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)的結(jié)果相同，證明了數(shù)字PCR技術(shù)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的可行性。Dany等[10]應(yīng)用微滴數(shù)字PCR技術(shù)對(duì)食品和飼料中的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行了精確定量分析。隋志偉等[11]應(yīng)用數(shù)字PCR技術(shù)成功研制了轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。潘廣等[12]基于微滴式數(shù)字PCR平臺(tái)在國(guó)內(nèi)首次建立了轉(zhuǎn)基因玉米品系T25的單/雙重微滴式數(shù)字PCR定量方法。

數(shù)字PCR技術(shù)作為高靈敏度、高精確度的DNA檢測(cè)技術(shù)，在植物的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)方面已有了一定的應(yīng)用[13-17]，但鮮見(jiàn)其應(yīng)用于植物油中的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)。本研究利用微滴式數(shù)字PCR技術(shù)對(duì)3份大豆毛油樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)，確定其中1份大豆毛油含有外源轉(zhuǎn)基因成分，另外2份為非轉(zhuǎn)基因大豆油。同時(shí)，運(yùn)用常規(guī)PCR方法和熒光定量PCR方法對(duì)提取的大豆毛油DNA樣品進(jìn)行外源目標(biāo)基因的擴(kuò)增，未檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因成分，說(shuō)明高靈敏度的數(shù)字PCR技術(shù)更適用于植物油樣品的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的大豆毛油樣品及非轉(zhuǎn)基因大豆油樣品均由北京某糧油公司提供，大豆毛油樣品是該公司運(yùn)用浸出法提取獲得；PCR反應(yīng)所需的引物和TaqMan探針均由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，TaqMan探針?biāo)玫臒晒饣鶊F(tuán)和淬滅基團(tuán)分別為FAM和BHQ1，實(shí)驗(yàn)所用引物和探針序列列于表1中。

1.1.2 試劑與儀器

數(shù)字PCR反應(yīng)液、常規(guī)PCR反應(yīng)液：TAKARA公司；DNA marker：Genstar公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒：中科瑞泰公司； DNA熒光染料Goldview：北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)公司；TE緩沖液由本實(shí)驗(yàn)室配制保存:0.01 mol/L Tris-HCl(pH8.0) + 0.001 mol/L EDTA(pH 8.0)。

Bio-rad電泳槽、恒壓/恒流電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)；PCR熱循環(huán)擴(kuò)增儀；QX 200微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大豆毛油樣品DNA提取

取4個(gè)50 mL離心管，每管取20 mL毛油樣品和20 mL正己烷，常溫下置于磁力攪拌器上混勻攪拌30 min，即為油相；取混勻好的油相20 mL和TE緩沖液20 mL，振蕩搖床混勻1 h；8 000 r/min、4 ℃離心5 min，取下層水相到新的4個(gè)50 mL離心管中；向水相中加入等體積的混勻好的油相，振蕩搖床混勻1 h；重復(fù)上述8 000 r/min離心加入等體積混勻好的油相，振蕩裝勻1 h，至毛油使用量為100 mL；最后一次取水相到新的4個(gè)離心管后，再離心8 000 r/min、4 ℃離心5 min，小心取水相到新的4個(gè)離心管中，加30 μL 助沉劑，1倍體積的預(yù)冷的異丙醇，-20 ℃放置過(guò)夜；15 000 r/min、4 ℃離心30 min，倒掉液體，用100 μL TE緩沖液反復(fù)沖洗有沉淀的部位，收集并移到1.5 mL離心管中，加1倍體積的酚：氯仿：異戊醇(25∶24∶1)溶液，混勻，12 000 r/min、4 ℃離心10 min，取水相到新離心管中；加10 μL carrier RNA和1倍體積的預(yù)冷的異丙醇，-20 ℃放置過(guò)夜；14 000r/min、4 ℃離心30 min，棄上清；向沉淀中加入800 μL 70%乙醇，混勻，14 000 r/min、4 ℃離心30 min；棄上清，室溫晾干沉淀15～20 min，加50 μL TE緩沖液，即為從大豆毛油提取的DNA溶液。

大豆毛油樣品DNA提取結(jié)束后，立即進(jìn)行數(shù)字PCR檢測(cè)，以防DNA降解。

1.2.2 微滴式數(shù)字PCR檢測(cè)大豆毛油樣品DNA的轉(zhuǎn)基因成分

1.2.2.1 微滴式數(shù)字PCR擴(kuò)增方法

提取的大豆毛油樣品DNA轉(zhuǎn)基因成分?jǐn)?shù)字PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照作為質(zhì)量控制。陽(yáng)性對(duì)照為含有待測(cè)序列的質(zhì)粒，陰性對(duì)照為非轉(zhuǎn)基因大豆毛油，空白對(duì)照是以水代替DNA模板。每個(gè)樣品數(shù)字PCR反應(yīng)設(shè)置2個(gè)平行。

表1 引物和探針列表

擴(kuò)增體系和程序：配制探針?lè)ㄎ⒌问綌?shù)字PCR反應(yīng)體系20 μL，引物終濃度為900 nmol/L，探針終濃度為250 nmol/L，振蕩混勻，離心除氣泡，加入Bio-Rad公司的微滴生成卡中，通過(guò)形成油包水結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)體系的分割。將生成的微滴全部轉(zhuǎn)入熒光PCR反應(yīng)板中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?)95 ℃，10 min(預(yù)變性)；2)94 ℃，30 s； 60 ℃，60 s；40循環(huán)(變性，復(fù)性)；3)98 ℃，10 min(終止反應(yīng)，并使微滴結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定)；4)4 ℃，Hold(結(jié)束)。

反應(yīng)結(jié)束后用微滴分析儀對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。

1.2.2.2 微滴式數(shù)字PCR檢測(cè)結(jié)果判定

空白對(duì)照樣品無(wú)擴(kuò)增信號(hào)，陰性對(duì)照樣品只有大豆內(nèi)源基因擴(kuò)增，各目標(biāo)基因陽(yáng)性對(duì)照均有擴(kuò)增，表明數(shù)字PCR體系正常工作。在數(shù)字PCR體系正常工作條件下，根據(jù)目標(biāo)基因有無(wú)擴(kuò)征信號(hào)判斷檢測(cè)的大豆毛油樣品是否含有轉(zhuǎn)基因成分。

1.2.3 常規(guī)PCR檢測(cè)大豆毛油樣品DNA的轉(zhuǎn)基因成分

以提取獲得的毛油DNA樣品為模板，并設(shè)置好陰性對(duì)照和空白對(duì)照，進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，以對(duì)比兩種方法檢測(cè)大豆毛油轉(zhuǎn)基因成分的優(yōu)劣。

20 μL的常規(guī)PCR反應(yīng)體系包括模板2 μL，正向引物及反向引物各0.3 μL，2×PCR Mix 10 μL和7.4 μL超純水。反應(yīng)程序?yàn)椋?1)95 ℃變性5 min；(2)94 ℃變性30 s；(3)54 ℃退火30 s；(4)72 ℃延伸(延伸時(shí)間根據(jù)目的基因片斷長(zhǎng)度計(jì)算)；(5)步驟(2)到步驟(4)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；(6)72 ℃延伸10 min；(7)20 ℃ 10 min。

反應(yīng)結(jié)束后用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆毛油樣品DNA提取

各取每個(gè)大豆毛油樣品100 mL，按本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的DNA提取方法對(duì)大豆毛油樣品進(jìn)行DNA提取，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖1所示。

注：A～C分別為提取的A、B、C 3個(gè)毛油樣品的基因組；Marker從上至下依次為：100、200、300、400、500、700、1 000 bp。

2.2 微滴式數(shù)字PCR檢測(cè)大豆毛油樣品DNA

大豆毛油樣品DNA提取結(jié)束后，為防止DNA降解對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，立即對(duì)所獲得的DNA進(jìn)行數(shù)字PCR反應(yīng)，結(jié)果如圖2所示。

數(shù)字PCR反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)Bio-rad QX 200軟件分析直接讀出檢測(cè)結(jié)果。

如圖2所示，此結(jié)果為陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照樣品檢測(cè)大豆內(nèi)源基因Lectin的檢測(cè)結(jié)果。藍(lán)斑表示檢測(cè)到熒光信號(hào)，黑斑表示無(wú)熒光信號(hào)。A02、B02、C02這3個(gè)孔分別是A、B、C樣品的空白對(duì)照，D02是陽(yáng)性對(duì)照。由圖2的結(jié)果可知，只有陽(yáng)性對(duì)照樣品能檢測(cè)到Lectin基因。

由圖3可見(jiàn)，A、B、C 3個(gè)毛油樣品和陰性對(duì)照樣品均能檢測(cè)出大豆內(nèi)源基因Lectin。由圖4可知，陰性對(duì)照樣品未能檢測(cè)出外源基因成分。結(jié)合圖2～圖4可知，A、B、C 3個(gè)大豆毛油樣品基因組DNA提取成功，且數(shù)字PCR體系工作正常，在此情況下，得到的外源轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)結(jié)果真實(shí)可靠。

圖2 對(duì)照樣品大豆內(nèi)源基因Lectin檢測(cè)結(jié)果

圖3 A、B、C 3個(gè)毛油樣品和陰性對(duì)照樣品大豆內(nèi)源基因Lectin檢測(cè)結(jié)果

圖4 陰性對(duì)照樣品外源基因CaMV35S、NOS和EPSPS檢測(cè)結(jié)果

圖5 A、B、C 3個(gè)毛油樣品外源基因檢測(cè)結(jié)果

由圖5可知，A樣品能檢測(cè)出外源基因CaMV35S和Pat，未檢測(cè)出外源基因NOS 、EPSPS和CryIA(c)，說(shuō)明A毛油樣品是由混有除草劑大豆A5547-127的大豆原料加工而成，而B(niǎo)、C毛油樣品未檢測(cè)出外源基因，說(shuō)明B、C為非轉(zhuǎn)基因大豆油。

2.3 常規(guī)PCR檢測(cè)大豆毛油樣品DNA

作為對(duì)比，用常規(guī)PCR方法和熒光定量PCR方法檢測(cè)所提取的大豆毛油DNA樣品。由圖6結(jié)果可見(jiàn)，提取3個(gè)大豆毛油樣品的基因組DNA后進(jìn)行常規(guī)PCR，未檢測(cè)到外源轉(zhuǎn)基因成分，且大豆內(nèi)源基因Lectin也未檢測(cè)到。同樣，由圖7結(jié)果可見(jiàn)運(yùn)用熒光定量PCR也未檢測(cè)到外源轉(zhuǎn)基因成分及大豆內(nèi)源基因Lectin。

注：1、2、3、4泳道分別檢測(cè)Lectin基因(118 bp)、CaMV35S啟動(dòng)子(195 bp)、NOS終止子(165 bp)、EPSPS基因(320 bp)；Marker從上至下依次：100、200、300、400、500、700、1 000 bp。

圖7 熒光定量PCR檢測(cè)A、B、C毛油樣品外源基因

圖7為檢測(cè)Lectin基因、CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、EPSPS基因的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線，橫坐標(biāo)表示擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)表示反應(yīng)樣品的熒光信號(hào)強(qiáng)度；Ct值為25的4個(gè)擴(kuò)增曲線分別為4個(gè)基因的陽(yáng)性對(duì)照。

3 討論與結(jié)論

2017年6月14日，我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)業(yè)部公布了《2017年農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書(shū)(進(jìn)口)批準(zhǔn)清單》，批準(zhǔn)16個(gè)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)口，用途皆為“加工原料”，其中包括5個(gè)轉(zhuǎn)基因大豆品種。隨著大豆等轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)入我國(guó)市場(chǎng)及百姓的視野和餐桌，為了給國(guó)家監(jiān)管部門(mén)制定相關(guān)制度和政策提供可靠的技術(shù)支撐，同時(shí)，強(qiáng)化轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)技術(shù)儲(chǔ)備，保障公眾對(duì)于轉(zhuǎn)基因食品的知情權(quán)，必需研發(fā)精確、有效、快速的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)。

大豆油在生產(chǎn)過(guò)程中，先后經(jīng)過(guò)多次高溫、脫水、中和等步驟，大豆DNA在此過(guò)程中已被嚴(yán)重降解，大豆油中DNA含量較低，用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法很難得到真實(shí)可信的結(jié)果。本研究利用靈敏度和準(zhǔn)確度更高微滴式數(shù)字PCR技術(shù)，完成了3份大豆毛油的外源轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)，確定了其中1份樣品含有外源轉(zhuǎn)基因成分。針對(duì)大豆毛油樣品中DNA含量較低、降解嚴(yán)重的特點(diǎn)，本研究首先優(yōu)化了大豆毛油樣品的DNA提取方法，減少DNA在提取過(guò)程中的損失，并用較多量的毛油樣品提取DNA以提高其濃度；其次，所選的外源轉(zhuǎn)基因目的片段盡量短且為GC含量高的區(qū)域，以防毛油樣品中的DNA降解。通過(guò)方法的優(yōu)化，成功的檢測(cè)到了大豆毛油樣品中的外源轉(zhuǎn)基因成分，由此建立了一套微滴式數(shù)字PCR方法檢測(cè)大豆毛油中轉(zhuǎn)基因成分的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，運(yùn)用本方法對(duì)市售的精煉大豆油樣品的外源轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)工作正在開(kāi)展。未來(lái)，隨著數(shù)字PCR技術(shù)平臺(tái)的發(fā)展，其成本將會(huì)更低，通量更高，在植物油的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)領(lǐng)域?qū)l(fā)揮更重要的作用。