羅 莎，黃璐瑤，殷 勤,2，張鈺瑩,2，趙 燕，張智勝,2

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

光呼吸是植物中除光合作用以外的第二大代謝流[1-4]，光呼吸代謝起始于2-磷酸乙醇酸的生成，2-磷酸乙醇酸經(jīng)磷酸酶水解成乙醇酸(GLC)并被運至過氧化物酶體從而進入光呼吸乙醇酸代謝途徑[5]。乙醇酸氧化酶(Glycolate oxidase, 簡稱GLO, EC 1.1.3.15)是一類黃素蛋白氧化酶，在光呼吸途徑中，GLO負責(zé)氧化乙醇酸生成乙醛酸(GLX)并產(chǎn)生等量的H2O2[6]。已知GLO普遍集中在綠色植物的葉片表達，其他部位表達量較低[7-9]。GLO活性的變化不但直接調(diào)節(jié)著植物光呼吸速率還對植物光合作用有著間接的調(diào)控功能[10]。例如，抑制GLO可導(dǎo)致水稻光合速率下降， 而過表達GLO則可提升高光高溫條件下水稻的光合速率[11-12]。此外，GLO在植物逆境響應(yīng)過程中也具有重要功能，植物的GLO活性可被各種環(huán)境脅迫所誘導(dǎo)[13-15]，在干旱脅迫條件下煙草(Nicotianatabacum)、豌豆(Pisurnsativurn)及豇豆(Vignacatjang)中GLO活性均顯著上升[16-18]。在植物抵御病原菌入侵過程中GLO活性也存在上調(diào)現(xiàn)象[19-20]。Rojas等[21]發(fā)現(xiàn)煙草及擬南芥(Arabidopsisthaliana)的非寄主抗性與GLO氧化乙醇酸生成的H2O2緊密相關(guān)。而Noctor等[22]證實C3植物中約70%的H2O2來源于光呼吸中的乙醇酸氧化過程，且在干旱及高溫等逆境條件下這一比例會變得更高。因此，GLO可能在H2O2相關(guān)的信號途徑中發(fā)揮著重要功能[23-25]。

Zelitch等[26]首次從菠菜葉中純化得到了GLO蛋白(SpGLO)，隨后的多肽測序進一步鑒定了SpGLO的一級結(jié)構(gòu)[27]，這使得SpGLO成為研究黃素蛋白氧化酶類的最佳模式蛋白。SpGLO先后在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、畢赤酵母(Pichiapastoris)及漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)中進行過異源表達[28-29]，此外SpGLO還被用于乙醛酸的生物催化合成研究[30]。然而，目前關(guān)于SpGLO的酶學(xué)特性研究結(jié)果比較瑣碎，其全面系統(tǒng)的酶學(xué)特性研究還未見報道。此外，SpGLO同工酶的種類仍存在爭議[31]，并且適合SpGLO的同工酶電泳方法也一直未見報道。本研究克隆了SpGLO基因，將其在釀酒酵母中進行了異源表達與純化，并在現(xiàn)有研究報道的基礎(chǔ)上進一步全面系統(tǒng)分析了SpGLO的酶學(xué)特性。此外本研究利用改進的GLO同工酶電泳方法，首次通過同工酶電泳技術(shù)分析得出SpGLO含有2條GLO同工酶譜帶。對SpGLO酶學(xué)特性及其同工酶組成的進一步闡明，可望為今后在植物中調(diào)節(jié)或改造光呼吸代謝進而提高植物光合效率以及研究植物抗逆機制等提供理論依據(jù)與切入點。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料 菠菜(Spinaceaoleracea, American hybrid 424)、 大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株DH5α、酵母菌(Saccharomycescerevisiae, INVSC1) (his3Δ1/his3Δ1leu2/leu2trp1-289/trp1-289ura3-52/ura3-52)與酵母表達載體pYES2購自Invitrogen公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimeScript TM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit購自寶生物。pMD19-T 載體和基因操作相關(guān)的酶均購自TaKaRa公司。蛋白純化柱(ProfinityTMIMAC resin column，10×64 mm)購自Bio-Rad公司。其他基因操作相關(guān)的試劑盒購自北京天根生物技術(shù)公司，其他化學(xué)試劑為生工生物產(chǎn)品。

1.1.2 培養(yǎng)基 YPD液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨20 g，酵母提取物10 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL；固體YPD培養(yǎng)基添加15 g/L瓊脂。SC缺陷培養(yǎng)基(缺少尿嘧啶)：YNB 6.7 g，葡萄糖20 g，根據(jù)酵母表達載體pYES2質(zhì)粒的基因標記補加16種氨基酸、腺嘌呤，水1 000 mL；固體SC缺陷培養(yǎng)基添加15 g/L瓊脂。SC誘導(dǎo)缺陷培養(yǎng)基，在SC缺陷培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上用D-半乳糖替代葡萄糖。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA的合成 取0.2 g葉片，液氮研磨，加1 mL TRIzol，振蕩混勻，室溫放置5 min；12 000 r/min離心5 min，收集上清；加入200 μL氯仿，振蕩混勻，室溫放置15 min；4 ℃，12 000 r/min離心15 min，收集上清；加500 μL異丙醇，振蕩混勻，放置30 min；4 ℃，12 000 r/min離心10 min，棄上清；加1 mL 75%乙醇洗滌沉淀，4 ℃，12 000 r/min離心5 min，通風(fēng)櫥中風(fēng)干，加84.4 μL DEPC水溶解；然后在84.4 μL的RNA溶液中，加入10 μL 10×DNase Ⅰ Buffer，1.6 μL HPR Ⅰ (40 U/μL)和4 μL DNase Ⅰ(5 U/μL)，總體系100 μL，37 ℃處理1 h，除去DNA；加75 μL水飽和酚，25 μL氯仿，充分振蕩，冰浴10 min；4 ℃，12 000 r/min離心5 min，取上清；加1/10體積的3 mol/L NaAc和2倍體積無水乙醇，-20 ℃放置30 min；4 ℃，12 000 r/min離心5 min，棄上清；加500 μL 75%乙醇洗滌沉淀，通風(fēng)櫥中風(fēng)干，用100 μL DEPC水溶解，用NanoDrop-1000測定濃度及質(zhì)量[32-34]。選取高質(zhì)量的RNA以反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA以作為模板用于后續(xù)的SpGLO基因擴增。

1.2.2 菠菜SpGLO基因表達序列的克隆 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫提供的菠菜(S.oleraceai, American hybrid 424)中SpGLO基因mRNA序列信息(J03492.1)，設(shè)計特異引物(引物于生工合成)并以菠菜葉片cDNA為模板，利用PCR高保真酶KOD plus擴增目標序列，產(chǎn)物純化后連接到pMD19-T載體上并測序鑒定。再次設(shè)計特異引物且在上游引物增加1個6-His標簽，以測序后的pMD19-T-SpGLO載體為模板擴增SpGLO基因的CDS區(qū)域，然后將整個NHisSpGLO片段克隆至pYES2載體。

1.2.3 釀酒酵母的轉(zhuǎn)化 釀酒酵母的轉(zhuǎn)化參照Gietz等[35-36]1992年建立的PEG介導(dǎo)熱擊轉(zhuǎn)化法。將酵母菌種INVSC1劃線至YPD平板于30 ℃培養(yǎng)3 d，挑取單菌落接種至10 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃，250 r/min培養(yǎng)18 h。測定酵母液OD600，吸取適量該菌液至50 mL YPD液體培養(yǎng)基使得其OD600最終為0.4；然后于30 ℃，250 r/min培養(yǎng)3 h。室溫5 000 r/min，5 min離心收集上述菌體，將菌體用1×TE (10 mmol/L)洗滌1次，以同樣條件收集洗滌后的菌體，將菌體沉淀重懸于2 mL的1×LiAc (100 mmol/L)/0.5×TE中，室溫孵化10 min。吸取100 μL孵化后的菌體與2 μL的pYES2-NHisSpGLO載體混勻，并加入700 μL的1×LiAc/40%PEG4000/1×TE，于30 ℃孵化30 min。最后加入88 μL DMSO，42 ℃熱沖擊7 min進行轉(zhuǎn)化，室溫離心收集菌體，取100 μL 1×TE重懸菌體，并涂于固體SC缺陷培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)3 d進行篩選。

1.2.4 菠菜GLO蛋白的表達與純化 NHisSpGLO在酵母菌中的誘導(dǎo)表達參考Invitrogen公司的操作手冊，挑選固體SC缺陷培養(yǎng)基上的酵母單菌落至10 mL 液體SC缺陷培養(yǎng)基中，30 ℃，250 r/min培養(yǎng)18 h。測定上述酵母液OD600，吸取適量菌液至50 mL SC誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基中使得其OD600最終為0.4；30 ℃，250 r/min培養(yǎng)約20 h，于4 ℃，5 000 r/min，5 min離心收集菌體并利用酸洗玻璃珠進行振蕩破碎。將該酵母破碎液與His-tag親和柱層析上樣緩沖液(600 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑，100 mmol/L PBS pH值8.0)等量混勻后上蛋白純化柱，先以1 mL/min流速用His-tag親和柱洗滌緩沖液(300 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑，50 mmol/L PBS pH值8.0)洗滌約10個柱體積，然后以1 mL/min流速用His-tag親和柱洗脫緩沖液(300 mmol/L NaCl，250 mmol/L咪唑，50 mmol/L PBS pH值8.0)洗脫5個柱體積，收集洗脫所得的目的蛋白。純化的蛋白經(jīng)過超濾脫鹽可保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 酶偶聯(lián)法測定GLO活性 參照彭新湘和李明啟[37]的方法并略有改動。1 mL測定體系中含0.52 mL 100 mmol/L的磷酸緩沖液PBS (pH值8.0)，0.1 mL 30 mmol/L的4-氨基安替吡啉，0.1 mL的150 U/mL辣根過氧化物酶POD(現(xiàn)配現(xiàn)用)，0.1 mL 20 mmol/L苯酚(現(xiàn)配現(xiàn)用)，0.1 mL 1 mmol/L黃素單核苷酸FMN，0.05 mL 100 mmol/L GLC，0.03 mL酶液(適情況稀釋)，搖勻于25 ℃恒溫保溫1 min后，測定其在520 nm波長下的吸收值的變化，共測定1 min。

GLO酶動力學(xué)參數(shù)測定參考Lineweaver 和Burk[38]的方法，分別在不同底物濃度梯度條件下測定反應(yīng)速度(乙醇酸：0.1～0.8 mmol/L；乙醛酸：1.0～8.0 mmol/L；甘油酸：0.5～6.0 mmol/L)，通過雙倒數(shù)作圖計算得到各米氏常數(shù)Km，測定草酸的抑制常數(shù)Ki時草酸的濃度為1.0～8.0 mmol/L，Ki同樣結(jié)合雙倒數(shù)作圖計算獲得[38-39]。

1.2.6 GLO同工酶譜分析 菠菜葉片中的SpGLO蛋白在進行GLO同工酶電泳前進行了部分純化，具體步驟如下：先用10%的預(yù)冷冰醋酸緩慢加入離心后的菠菜葉片粗提液上清液中至pH值5.8，靜置15 min；4 ℃，12 000 r/min離心20 min，取上清。然后緩慢添加固體(NH4)2SO4到上清液至20%飽和度，靜置20 min；4 ℃，12 000 r/min離心20 min，取上清后再加 (NH4)2SO4到上清液至飽和度達到40%，靜置4 h；4 ℃，14 000 r/min離心20 min，棄上清。用適量預(yù)冷的20 mmol/L PBS pH值7.8充分溶解沉淀。靜置20 min后，4 ℃，14 000 r/min離心20 min，取上清液至Sephadex G-50層析柱(2.0 cm×32 cm)，以預(yù)冷的20 mmol/L PBS pH值8.0洗脫，流速為3.0 mL/min，收集活性部分。將活性部分進行超濾濃縮用于后續(xù)電泳。GLO同工酶電泳為ClearNative-PAGE體系，使用Caps-氨水緩沖液(pH值10.2)為電泳液[40]，其電泳條件為6%的分離膠，3%的濃縮膠，于4 ℃，100 V電泳9 h后利用GLO活性染色液(NBT 0.016%m/V，吩嗪二甲酯硫酸鹽PMS 0.003%m/V，F(xiàn)MN 0.1 mmol/L，GLC 5 mmol/L，PBS 100 mmol/L pH值8.0)于25 ℃染色20 min，然后觀察。

1.2.7 蛋白濃度測定 粗酶液蛋白含量利用考馬斯亮藍法測定[41-43]，純化后的蛋白含量利用NanoDrop ND-1000測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菠菜SpGLO蛋白的表達與純化

本試驗中為了純化酵母異源表達的SpGLO蛋白，在SpGLO的N端融合有1個組氨酸標簽(NHis)，將構(gòu)建好的pYES2-NHisSpGLO載體與pYES2空載體分別轉(zhuǎn)入釀酒酵母表達菌株INVSC1中，先按Invitrogen操作手冊誘導(dǎo)發(fā)酵10 h，然后破碎酵母并測定粗酶GLO活性，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)有pYES2-NHisSpGLO的釀酒酵母粗酶液可檢測到GLO活性，而轉(zhuǎn)入空載體pYES2的粗酶液無GLO活性。為了得到較高的GLO活性蛋白產(chǎn)量，本試驗于不同誘導(dǎo)時間點取樣并測定其活性，結(jié)果如圖1所示，轉(zhuǎn)化有pYES2-NHisSpGLO的釀酒酵母菌株在誘導(dǎo)發(fā)酵20 h后能得到最高的GLO活性。而延長發(fā)酵時間至32 h后GLO活性顯著下降(P<0.05)。該NHisSpGLO蛋白經(jīng)過His-tag親和柱(Profinity IMAC Resins)分離純化后所得的純蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析如圖2所示已達到較高的純度，可以用于后續(xù)的酶學(xué)特性分析。

2.2 菠菜SpGLO的酶學(xué)特性分析

將純化所得NHisSpGLO在不同pH值條件下以GLC為底物測定其催化活力從而確定其最適pH值，結(jié)果如圖3-A所示，NHisSpGLO在pH值8.0具有最高的催化活力。而在pH值<7.5及pH值>8.5的區(qū)間其催化活力較小(P<0.05),然后再將NHisSpGLO在pH值8.0的PBS緩沖液體系中在不同溫度條件下以GLC為底物測定其催化活力從而確定其最適反應(yīng)溫度，NHisSpGLO的最適反應(yīng)溫度約為39 ℃，在35 ℃以下及40 ℃以上的溫度區(qū)間其催化活力顯著降低(P<0.05)(圖3-B)。

所有數(shù)據(jù)為3次獨立試驗的平均值±SD；根據(jù)Duncan的多范圍檢驗，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖3同。

All values are means±SD of three replicates; Means denoted by the same letter did not significantly different atP<0.05 according to Duncan′s multiple range tests. The same as Fig.3.

圖1pYES2-NHisSpGLO于INVSC1中異源表達時不同誘導(dǎo)時間條件下GLO比活
Fig.1TheGLOactivityofpYES2-NHisSpGLOexpressedinINVSC1atvariousinducedtime

圖2 純化NHisSpGLO的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE assays of the purified NHisSpGLO

圖3 純化所得的NHisSpGLO在不同pH值/溫度條件下的相對活力Fig.3 Relative activities of NHisSpGLO at various pH/temperatures

先前有關(guān)菠菜GLO催化特性的研究都比較單一，本研究系統(tǒng)的測定了菠菜GLO的相關(guān)酶學(xué)參數(shù)。將純化的NHisSpGLO進行了酶動力學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)NHisSpGLO對乙醇酸的親和力最高，Km(乙醇酸)為0.41 mmol/L(表1)，而其對乙醛酸與甘油酸的親和力較低，Km(乙醛酸)與Km(甘油酸)分別為5.83，4.75 mmol/L (表1)，同時NHisSpGLO催化乙醇酸的Vm也顯著高于乙醛酸與甘油酸(表1)。此外由于乙醇酸代謝與草酸代謝可能存在密切的關(guān)系，乙醛酸又是水稻草酸合成的前提[44]，而草酸又是GLO天然的競爭性抑制劑[44-45]，所以本研究分別分析了NHisSpGLO催化乙醇酸或乙醛酸時草酸對其活性的抑制效果，測定了其各自的Ki，結(jié)果見表2。相對于乙醇酸，在以乙醛酸為底物時，NHisSpGLO的催化反應(yīng)更容易被草酸所抑制(較低的Ki)。

表1 NHisSpGLO催化不同底物時的Km與VmTab.1 Km and Vm of NHisSpGLO with various substrates

注：所有數(shù)據(jù)為3次獨立試驗的平均值±SD；根據(jù)Duncan的多范圍檢驗，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。表2同。

Note：All values are means ±SD of three replicates; Means denoted by the different letter were significantly different atP<0.05 according to Duncan′s multiple range tests. The same as Tab.2.

表2 草酸對NHisSpGLO催化活性的抑制效果Tab.2 Inhibition effect of NHisSpGLO with oxalate

2.3 菠菜SpGLO的同工酶譜分析

目前在同工酶的研究中主要采用同工酶譜分析，即將待檢測酶液通過電泳分離，再用特異的顯色方法使酶的位置直接在凝膠中以染色條帶的形式表現(xiàn)出來。酶在凝膠中所顯示的圖譜即為同工酶譜，該分析過程中使用較多的為CN-PAGE電泳[46]。本研究在前期使用了常見的Laemmli體系進行CN-PAGE，該體系使用pH值8.3的Tris-Gly電泳緩沖液[47]，但利用該體系進行SpGLO同工酶譜分析時條帶模糊，分辨率較低。為了提高SpGLO的同工酶譜分辨率，本研究先對SpGLO進行部分純化，主要純化步驟為選擇性酸變性，(NH4)2SO4分級沉淀及葡聚糖凝膠過濾脫鹽。純化后的SpGLO再以Caps-氨水緩沖液作為CN-PAGE的電泳緩沖液進行同工酶電泳[40]。該CN-PAGE體系具有較高的分辨率，能較好地分離SpGLO同工酶(圖4)。SpGLO經(jīng)過電泳與活性染色后出現(xiàn)2條同工酶帶，表明菠菜葉片中可能存在2種GLO同工酶。

3 結(jié)論與討論

在本研究中，首先從菠菜葉片總RNA中通過反轉(zhuǎn)錄PCR擴增得到了SpGLO基因。然后選擇釀酒酵母表達系統(tǒng)對N端融合有His-tag的SpGLO蛋白進行異源表達。因為GLO是定位于過氧化物酶體的真核蛋白，而釀酒酵母表達系統(tǒng)能夠提供真核蛋白質(zhì)所需的一些翻譯后修飾，可以保證異源蛋白SpGLO的生物活性與天然構(gòu)象[48]。此外His-tag通常不會影響目的蛋白的可溶性及催化活性等特性[49]，這也是后續(xù)試驗中利用酵母表達的SpGLO開展生化及酶學(xué)特性研究的重要基礎(chǔ)。在獲得SpGLO蛋白的活性表達產(chǎn)物后，本研究通過His-tag親和層析純化了酵母表達的SpGLO蛋白，并系統(tǒng)的測定了其相關(guān)的動力學(xué)參數(shù)。SpGLO對乙醇酸的親和力最高，同時其在利用乙醇酸為底物時也表現(xiàn)出最高的Vm，因此，可推測乙醇酸為SpGLO的最佳生理底物。在體外酶學(xué)特性分析中SpGLO不僅可以催化乙醇酸形成乙醛酸，其同時還具有將乙醛酸氧化為草酸的活性，而且GLO蛋白也曾經(jīng)被認為可能參與了植物體內(nèi)的草酸合成代謝[50]，不過后續(xù)一些研究表明植物中GLO活性的改變并未能顯著影響其草酸合成[51]?，F(xiàn)有一些研究表明,植物體內(nèi)的乙醇酸與乙醛酸濃度可能處在相近的水平[11,52]，在這種生理環(huán)境中SpGLO更傾向于利用乙醇酸為底物行使其催化功能，本試驗結(jié)果也顯示,SpGLO的乙醛酸氧化活性比其乙醇酸氧化活性更易受到草酸的抑制，因此，在植物體內(nèi)其催化乙醛酸的活性很可能被植物中的高草酸濃度所抑制，該SpGLO不太可能主導(dǎo)菠菜體內(nèi)的草酸合成。

圖4 SpGLO同工酶譜分析(Caps-氨水電泳緩沖體系)Fig.4 SpGLO isozyme pattern (Caps-ammonium hydroxide running buffer system)

雖然有多篇報道曾提及菠菜中可能含有2種或3種GLO同工酶[31,53]，但有關(guān)SpGLO的同工酶電泳圖譜還未見報道。同工酶電泳是同工酶分析最為直接的證據(jù)之一，但不同種類的酶其同工酶電泳條件也不相同，需要大量的摸索試驗來優(yōu)化電泳條件以得到較高的分辨率，這也制約了同工酶電泳技術(shù)在GLO等同工酶分析中的應(yīng)用。本研究初期以Laemmli體系為基礎(chǔ)進行SpGLO同工酶電泳分析，但一直未能得到理想的結(jié)果。由于SpGLO可能具有較高的pI[53]，因此，本研究后期改用pH值10.2的Caps-氨水電泳緩沖液進行同工酶電泳，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過部分純化的SpGLO在該體系中具有較高的分辨率，且首次通過同工酶電泳顯示SpGLO含有2條同工酶譜帶，該結(jié)果與Lindqvist[54]的研究結(jié)果一致。生物體內(nèi)的同工酶雖然催化相同的反應(yīng)，但不同的同工酶常常具有不同的生化特性與生理功能，例如,在鹽芥中Cu/Zn-SOD受到KCN的抑制，而Fe-SOD只可被H2O2抑制[55]；番茄中的果糖激酶同工酶FRK1主要在開花過程中起作用，而另一個同工酶FRK2則主要與不同器官的生長發(fā)育有關(guān)[56]。GLO是植物光呼吸途徑的關(guān)鍵酶，主要負責(zé)氧化乙醇酸生成乙醛酸并同時產(chǎn)生等量的H2O2，由于光呼吸是除光合作用以外的第二大代謝流，這一過程中產(chǎn)生的H2O2量可達到植物總H2O2的70%[22]，而H2O2為植物體內(nèi)重要的信號物質(zhì)，參與了植物體內(nèi)的多種逆境響應(yīng)過程[57-60]，因此，關(guān)于植物GLO同工酶的研究對植物的光呼吸與光合作用的代謝調(diào)控及逆境響應(yīng)相關(guān)的H2O2信號途徑研究均具有重要的指導(dǎo)意義。本研究通過改進的GLO同工酶電泳技術(shù)提高了GLO同工酶電泳的穩(wěn)定性與分辨率，得到了SpGLO同工酶圖譜，該技術(shù)可望進一步被用于其他植物的GLO同工酶譜研究，為將來深入研究植物GLO同工酶之間的生化特性差異并分析其不同生理功能奠定良好的試驗技術(shù)基礎(chǔ)。