劉 秀，張亞強，李少斌，王繼卿，胡 江，沙玉柱，張 偉，羅玉柱

(甘肅農(nóng)業(yè)大學 甘肅省草食動物生物技術(shù)重點實驗室，甘肅省牛羊基因改良工程實驗室，動物科學技術(shù)學院，甘肅 蘭州 730070)

藏綿羊是中國最古老的綿羊品種和三大粗毛綿羊品種之一，繁育在3 000～6 000 m氣候寒冷、氧分壓低的青藏高原地區(qū)。在漫長的適應性進化過程中，藏綿羊在生理、生化和形態(tài)學上具有了穩(wěn)定適應高原低氧環(huán)境的遺傳學特性，逐漸在形態(tài)、細胞和分子水平上形成了適應和調(diào)節(jié)機制，是適應青藏高原低氧環(huán)境的優(yōu)勢物種[1]。

脯氨酸羥化酶(Proline hydroxylase, PHDs)是一類雙加氧酶，主要參與調(diào)控低氧誘導因子及低氧反應[2]。有PHD1、PHD2、PHD3和PHD4 4種亞型[3]，PHD2(Proline hydroxylase domain protein 2，PHD2)即脯氨酸羥化酶2，又名EGLN1(Egl nine homolog 1)基因。綿羊EGLN1基因位于其25號染色體上，有7個外顯子，長約5 kb，編碼661個氨基酸[4]。EGLN1基因是一重要的氧氣傳感基因[5]，具有負調(diào)控低氧誘導因子1a(Hypoxia-inducible factor-1a, HIF-1a)的作用，對低氧環(huán)境較為敏感，能夠調(diào)控低氧環(huán)境條件下HIF-1a的表達，是其蛋白降解的主要因子[6]。EGLN1基因表達的降低可減少HIF-1a的降解，可形成HIF-1a的蓄積，使HIF-1a誘導的低氧反應基因的轉(zhuǎn)錄對低氧環(huán)境適應反應的細胞進行調(diào)控，如血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、血紅素氧化酶-1(Heme oxygenase-1, HO-1)、誘導型一氧化氮合酶(Induced nitric oxide synthase, iNOS)、促紅細胞生成素(Erythropoietin, EPO)等，從而提高細胞和組織對低氧的耐受力，使細胞較好的適應低氧環(huán)境，從而達到低氧適應形成對細胞的保護。

EGLN1基因的變異分析可有效研究動物的高原低氧適應性進化。利用全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome wide association study, GWAS)方法對藏族人進行檢測分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EGLN1基因是藏族與漢族人基因頻率差異最大的基因，他們與藏族血紅蛋白濃度以及紅細胞計數(shù)呈顯著相關(guān)，并直接參與了藏族的低氧適應進化過程[7]。EGLN1 基因在人的跨種族基因檢測中表現(xiàn)出了很強的自然選擇性[8]，與蒙古人血紅蛋白含量具有顯著的相關(guān)性[9]，以及慢性高原病[10]、高原水腫[11]和紅細胞增多癥[12]等均具有相關(guān)性。

截至目前， 對EGLN1基因的研究對象主要以世居高原上的土著居民為主，如EGLN1基因與藏族人群的高原性疾病、癌癥、高原環(huán)境的適應等方面研究。以海拔高度不同進行的遺傳特征差異以及基因表達差異研究鮮有報道。因此，本試驗以藏綿羊為研究對象，低海拔湖羊為對照，采用qRT-PCR技術(shù)和PCR-SSCP方法分析EGLN1基因在高低海拔綿羊品種間、不同組織間的表達差異以及遺傳變異特征與低氧適應的相關(guān)性。進而為藏綿羊高原低氧適應性機制以及耐低氧分子標記篩選提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗樣品

樣品包括340只藏綿羊和249只湖羊血樣(表1)，用于基因組DNA提取。部分血液滴至FTA卡(Whatman Bioscience, Middlesex, UK)上，自然晾干后保存?zhèn)溆?。組織樣分別采集3只藏綿羊和3只湖羊的心、肝、脾、肺、腎和骨骼肌組織，立即置于液氮中，帶回實驗室-70 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 FTA卡基因組DNA提取 FTA卡基因組提取采用兩步法[13]。

1.2.2 總RNA提取 采用RNA simple Total RNA Kit試劑盒(北京天根)提取各組織的總RNA。利用Fast King RT Kit(With gDNase)試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 熒光定量引物設計與擴增

根據(jù)GenBank中綿羊EGLN1基因CDS序列(No：XM_012156646.2)，利用在線Primer 6.0軟件設計特異引物，內(nèi)參基因18S參考文獻[14]引物(P1和P2)，引物序列見表2，引物合成由華大基因科技有限公司完成。利用Applied Biosystems Q6實時熒光定量PCR儀進行基因表達量測定，總反應體系為20 μL，包括熒光定量PCR預混液(AceQ? qPCR SYBR? Green Master Mix)10.0 μL、ROX Reference Dye1 0.4 μL、上下游引物各0.4 μL、模板cDNA 2.0 μL、滅菌蒸餾水6.8 μL，每個組織重復3個樣品檢測。機設條件為：預變性，95 ℃，5 min；變性，95 ℃，10 s，退火，60 ℃，30 s，延伸，72 ℃，30 s，40個循環(huán)；熔解反應為，變性95 ℃，15 s；然后60 ℃，60 s。

1.4 綿羊EGLN1基因PCR-SSCP檢測

依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中已有的綿羊EGLN1基因序列(NC_019482.2)，利用Primer 6.0設計特異引物P3(表2)，擴增intron6-intron7部分區(qū)域。

反應體系為20 μL：包括Taq預混酶10 μL(Vazyme)，ddH2O 7.6 μL，引物0.8 μL和DNA模板0.8 μL。

PCR反應條件為：預變性，95 ℃，5 min；變性，95 ℃，30 s，退火，62 ℃，30 s，延伸，72 ℃，30 s，35個循環(huán)；延伸，72 ℃，7 min；4 ℃保存。利用1.5%瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進行電泳檢測。

SSCP檢測：取PCR產(chǎn)物2.5 μL，加入變性緩沖液7.5 μL混勻，在105 ℃進行加熱變性5 min，然后置冰水混合物中。在14%的非變性聚丙烯酰胺凝膠(Acr∶Bis=37.5∶1)和0.5×的TBE液中電泳，外循環(huán)溫度為15 ℃(恒溫)的條件下，220 V電泳20 h。電泳結(jié)束后，將非變性聚丙烯酰胺凝膠進行銀染顯色，判型。

表2 引物序列Tab.2 Primers sequence

1.5 測序與數(shù)據(jù)分析

根據(jù)銀染結(jié)果，確定SSCP帶型，將純合型樣品直接測序，雜合型則進行切膠測序[15]。采用MEGA 5.0軟件對核苷酸序列進行比較，利用Popgene 32.0軟件對基因型頻率和等位基因頻率進行統(tǒng)計，然后對序列純合度(Homozygosity, Ho)、雜合度(Heterozygosity, He)、有效等位基因數(shù)(Effective number of alleles, Ne)進行計算，并進行χ2檢驗分析，采用PIC 6.0軟件對樣品多態(tài)性信息含量(Polymorphism information content, PIC)進行計算。

采用2-ΔΔCT法[16]計算EGLN1基因mRNA的表達情況，ΔCT和ΔΔCT計算采用以下公式計算；ΔCT=CTEGLN1-CT18S，ΔΔCT=ΔCT試驗組-ΔCT對照組，腎的表達數(shù)據(jù)為對照。應用SPSS 16.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊EGLN1基因組織差異表達分析

2.1.1 熒光定量PCR熔解曲線 綿羊EGLN1基因和內(nèi)參基因18S的熔解曲線如圖1所示，兩者均為單一波峰，可知熒光定量PCR擴增產(chǎn)物特異，可進行定量表達測定分析。

2.1.2 綿羊EGLN1基因表達量測定 藏綿羊和湖羊2個品種的EGLN1基因組織表達量測定結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，在2個綿羊品種中，心、肝、肺、脾、腎和骨骼肌中均有表達。其中，肝在湖羊各組織中表達量最高，分別是心、脾、肺和腎和骨骼肌表達量的9.7，15.4，2.8，29.7和7.5倍；在藏綿羊中表達量最高的為脾，是心、肝、肺、腎和骨骼肌的1.7，3.4，2.1，1.3和1.1倍。2個品種相同組織間，湖羊各組織表達量均高于藏綿羊。尤其在心、肝和肺組織中最為明顯。

圖1 EGLN1基因和18S rRNA熔解曲線Fig.1 EGLN1 gene and 18S rRNA fluorescence melt curve plot

1.心臟；2.肝臟；3.脾臟；4.肺臟；5.腎臟；6.骨骼肌；湖羊腎為對照。1. Heart;2. Liver;3. Spleen;4. Lung; 5. Kidney;6. Skeletal muscle; Kidney of Hu sheep represents control group.

2.2 EGLN1基因變異特征分析

2.2.1 SSCP檢測結(jié)果 經(jīng)SSCP檢測，在藏綿羊和湖羊EGLN1基因intron6-intron7部分區(qū)域共發(fā)現(xiàn)4個(A～D)等位基因，形成AA、BB、CC、AB、AC、BC、AD、BD、CD共9種基因型(圖3)。其中在湖羊群體中未發(fā)現(xiàn)BD基因型。序列分析表明，擴增區(qū)域共發(fā)現(xiàn)6個SNPs(c.1921-125A>G、c.1921-122A>G、c.1921-73C>A、c.1895G>A、c.1921+33G>A、c.1921+85T>G)以及1個堿基插入(c.1921-72插入G)和1個堿基缺失位點(c.1921-44缺失T)。變異位點c.1895G>A位于第6外顯子區(qū)，未引起氨基酸的改變，屬于同義突變。

2.2.2 群體遺傳特征 藏綿羊和湖羊的遺傳變異特征分析見表3，4。結(jié)果顯示，藏綿羊和湖羊的優(yōu)勢等位基因分別為等位基因B和A，藏綿羊優(yōu)勢基因型為AB，湖羊優(yōu)勢基因型為AA，其中，在湖羊中未檢測到基因型BD。經(jīng)χ2適應性檢驗，2個綿羊群體均未達到顯著水平(P>0.05)(表4)，表明2個綿羊群體EGLN1基因處于Hardy-Weinberg平衡。

圖3 綿羊EGLN1基因intron6-intron7區(qū)PCR-SSCP檢測結(jié)果Fig.3 Detection the region of intron6-intron7 of EGLN1 gene in sheep by PCR-SSCP

表3 綿羊EGLN1基因的基因型頻率和基因頻率Tab.3 Genotype frequencies and gene frequencies of EGLN1 gene in sheep

2個綿羊群體的遺傳變異參數(shù)見表4。藏綿羊的多態(tài)信息含量為0.63(PIC>0.5)，屬于高度多態(tài)；湖羊的多態(tài)信息含量為0.42，屬于中度多態(tài)。

表4 綿羊EGLN1基因的遺傳變異參數(shù)Tab.4 Genetic variation parameters of EGLN1 gene in sheep

注：PIC>0.5高度多態(tài)；PIC<0.25低度多態(tài)；P.表示2個群體間基因型頻率差異。

Note: PIC>0.5 means high diversity; PIC<0.25 means low diversity;P.Indicating the difference in genotype frequencies between the two populations.

3 結(jié)論與討論

3.1 綿羊EGLN1基因組織表達分析

高原低氧適應是指生活在高原的人及土著動物，為生存和適應高原低氧環(huán)境，所形成的可遺傳的表型特征，以及生理生化方面的變化。EGLN1基因是動物低氧誘導通路上的關(guān)鍵調(diào)控基因，在其適應高原低氧環(huán)境上具有重要作用。在低氧條件下，EGLN1基因的羥化活性明顯降低，從而使HIF-1α和HIF-2α累積，進而特異的增強其下游靶基因VEGF、EPO及VEGFR、乳酸脫氫酶A(Lactate dehydrogenase A,LDHA)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceral dehyde-3-Phosphate dehydrogenase,GAPDH)、內(nèi)皮素-1(Endothelin-1,ET-1)、血紅素氧化酶(Hemeoxygenase,HO)等基因的表達，進而參與機體低氧適應的代謝過程，增強生物體對高寒低氧的適應性[17-19]。

本研究qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，EGLN1基因在藏綿羊和湖羊2個品種的不同組織器官中均有表達，但表達具有組織特異性，且與其他動物的相應研究結(jié)果相似[20-21]。同時，EGLN1基因的表達具有品種特異性，藏綿羊和湖羊分別為繁育在高海拔與低海拔的品種。2個品種間，藏綿羊各組織表達量均低于湖羊，但在心、肝、腎組織中差異更為顯著，表明EGLN1基因的表達與海拔高度明顯相關(guān)。研究表明，心、肺、腎是動物機體呼吸、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)以及信號傳遞等過程的主要調(diào)節(jié)器官。肝是機體新陳代謝的主要器官，在維持三大營養(yǎng)物質(zhì)平衡中發(fā)揮著重要作用，如肝糖原調(diào)節(jié)血糖濃度穩(wěn)定[22]。這些組織器官在動物的適應性方面所發(fā)揮的作用進一步說明，EGLN1基因與動物的高原低氧適應性具有相關(guān)性。葉銀子[23]研究發(fā)現(xiàn)，EGLN1基因在不同海拔高度的沙蜥蜴心、肝中的表達量存在顯著差異(P<0.01)，如低海拔沙蜥蜴肝中表達量極顯著高于(P<0.01)高海拔沙蜥蜴。但在心臟中差異不顯著，與上述研究不一致，可能與研究物種不同有關(guān)。EGLN1基因?qū)Φ脱跽T導因子具有負調(diào)控作用，而藏綿羊EGLN1基因表達量下降，則可說明降低了對低氧誘導因子的抑制，增強其基因的表達量，發(fā)揮其在動物低氧適應過程中的重要作用，使動物機體能夠更好地適應高原低氧環(huán)境。

3.2 綿羊EGLN1基因群體遺傳及適應性特征

本研究在藏綿羊EGLN1基因intron6-intron7區(qū)發(fā)現(xiàn)了6個SNPs、1個插入和1個缺失位點，以及相應的4個等位基因。其中，1個SNPs位于外顯子區(qū)，屬于同義突變，其余均位于內(nèi)含子上。內(nèi)含子是基因上的一個重要原件，對基因表達進行雙向調(diào)控，其發(fā)生突變可能會改變基因的表達效率[24-25]。結(jié)果顯示：EGLN1基因在2個品種間的基因型和等位基因頻率具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，推測這種差異可能與其生活環(huán)境有關(guān)。由于藏綿羊繁育在青藏高原低氧環(huán)境，EGLN1基因可能在進化過程中受到了自然選擇作用，使有利于高寒低氧適應的基因型(AB、BB、BC)受到選擇并富集。李騫等[26]研究表明，在EGLN1基因5′UTR區(qū)和內(nèi)含子區(qū)有6個SNPs在高原藏族群體和低海拔漢族群體之間存在顯著差異，說明6個SNPs位點可能與藏族高原低氧適應性有關(guān)。對藏綿羊和湖羊EGLN1基因的研究也得出相似的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)第4內(nèi)含子中的2個SNPs的純合型個體在2個綿羊間差異極顯著(P<0.01)，推測與藏綿羊的高原低氧環(huán)境適應相關(guān)[27]，與本研究結(jié)果一致。根據(jù)PIC相關(guān)標準[28]，藏綿羊EGLN1基因的PIC值是0.63，大于0.5，呈高度多態(tài)，表明藏綿羊該基因遺傳變異程度較高，多態(tài)性也較為豐富，則選擇潛力較大。因此，藏綿羊EGLN1基因遺傳多樣性豐富，具有作為高原低氧分子標記的潛力和優(yōu)勢。

EGLN1基因在藏綿羊和湖羊的6個不同組織均存在不同程度的表達。藏綿羊各組織表達量低于湖羊，尤其在心、肝、肺組織中。表現(xiàn)出明顯的品種特異性以及組織特異性，這可能與2個品種的生活環(huán)境相關(guān)。在EGLN1基因intron6-intron7區(qū)檢測到6個SNPs、1個堿基插入和1個堿基缺失，說明藏綿羊EGLN1基因遺傳多樣性豐富，且其優(yōu)勢等位基因B和優(yōu)勢基因型AB的頻率極顯著高于湖羊(P<0.01)，具有作為高原低氧分子標記的優(yōu)勢和潛力。