邢波建，于 淼，吳 迪，徐 笑，李連艷，劉玉芬

(哈爾濱師范大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150025)

Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)是一類Ⅰ型跨膜糖蛋白模式識別受體，能夠通過識別保守的病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)參與機(jī)體的天然免疫過程。TLRs分布十分廣泛，在20多種細(xì)胞中均可檢測到其存在信號，主要分布于單核-巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、T細(xì)胞等免疫細(xì)胞中[1]。TLRs可以激活相關(guān)信號分子，同時(shí)也可以引起胞內(nèi)炎性介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，進(jìn)而激活非特異性和特異性免疫，共同清除抗原異物[2]。

近年來，有大量研究顯示[3-5]，TLRs與各種細(xì)菌感染導(dǎo)致的疾病發(fā)生有著密不可分的關(guān)系，這些研究對細(xì)菌感染的機(jī)制及疾病的預(yù)防、診斷和治療具有重要意義。迄今為止，已在人體中發(fā)現(xiàn)11種TLRs，即TLR1～TLR10和TLR14，在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)15種TLRs[6-7]，其中小鼠可表達(dá)TLR11～TLR13，但不表達(dá)TLR10。以往認(rèn)為，TLR15為禽類所特有[8-9]，但最新研究證實(shí)，在釘螺中也存在TLR15，其生物學(xué)功能是否與禽類的TLR15相同，目前尚不清楚[10]。

chTLR15作為雞體內(nèi)的一種天然免疫分子，在如何參與免疫應(yīng)答、保護(hù)機(jī)體方面已經(jīng)具有了一定的研究基礎(chǔ)[11]，但是對于不同品種雞該因子詳細(xì)的生物信息學(xué)分析和組織表達(dá)譜尚不夠豐富。因此，本研究通過克隆海蘭褐雞TLR15全長基因，獲得生物信息學(xué)特征，并對其胞外區(qū)進(jìn)行原核表達(dá)，制備相應(yīng)的多克隆抗體，檢測TLR15在雞體內(nèi)的分布規(guī)律，旨在為進(jìn)一步研究禽類TLR相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制提供基礎(chǔ)材料。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物、菌種、質(zhì)粒和試劑

海蘭褐雞購自哈爾濱市松北區(qū)興旺養(yǎng)殖場；成年昆明鼠購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)、pGM-T載體均購自天根生化科技(北京)有限公司；pET32a表達(dá)載體由哈爾濱師范大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。KpnⅠ、Hind Ⅲ和T4DNA連接酶購自全式金(TRANS)生物有限公司；鼠抗His標(biāo)簽單克隆抗體、HRP-羊抗鼠IgG二抗和DAB顯色試劑盒購自博奧森生物技術(shù)(北京)有限公司；其他試劑為進(jìn)口或者國產(chǎn)分析純。

表1 chTLR15引物序列Tab.1 Primer pairs of chTLR15

注：pTLR15擴(kuò)增序列為胞外區(qū);chTLR15擴(kuò)增區(qū)域?yàn)榭缒^(qū)和胞內(nèi)區(qū)。

Note:The amplified sequence ofpTLR15 is extracellular region;The region ofchTLR15 amplification was transmembrane and intracellular.

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank上已發(fā)表的三黃雞chTLR15(登錄號：JN112024.1)序列，利用Primer 5.0和Primer-Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設(shè)計(jì)第1對特異性引物，用于擴(kuò)增chTLR15的胞外區(qū)，分別在上游引物和下游引物引入KpnⅠ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)。同時(shí)設(shè)計(jì)第2對引物，用于擴(kuò)增跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)序列(表1)。

1.3 chTLR15基因的RT-PCR擴(kuò)增

從雞脾臟中提取總RNA，依據(jù)TRIzol LS plus RNA Extraction Kit說明書進(jìn)行操作，獲得完整的RNA樣品，再按照 Golden 1stcDNA Synthesis Kit(with gDNA Remover)說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作，37 ℃孵育10 min去除gDNA，55 ℃孵育1 h后，85 ℃再孵育10 min，得到完整的cDNA。依照SuperTaqDNA Polymerase說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)體系的配置，反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，72 ℃終延伸10 min。獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收后，委托博仕(哈爾濱)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定，獲得序列后將進(jìn)行全序列拼接。

1.4 chTLR15基因的生物信息學(xué)分析

使用Blast (basic local alignment search tool, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)上與海蘭褐TLR15同源的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析；采用SMART (simple modular architecture research tool, http://smart.embl-heidelberg.de/)對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測；SWISS-MODEL (http://www.swissmodel.expasy.org/)對蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，并利用MEGA 7.0以及DNAMAN 6.0，對核苷酸序列進(jìn)行建樹分析。

1.5 chTLR15胞外區(qū)原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以KpnⅠ和Hind Ⅲ分別雙酶切胞外區(qū)PCR產(chǎn)物和pET32a載體，回收目的片段，以T4DNA連接酶構(gòu)建重組表達(dá)載體pET32a-TLR15ER，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后進(jìn)行鑒定，然后再轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)菌，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切和測序鑒定出陽性菌株。

1.6 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、檢測及多克隆抗體的制備

將陽性菌株接種于2 mL LB培養(yǎng)基(Amp+, 100 μg/mL)中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。取上述菌液以1/100的比例接種于50 mL新鮮的LB液體培養(yǎng)基(Amp+, 100 μg/mL)中，37 ℃搖床培養(yǎng)至OD600值達(dá)0.3～0.5，在超凈工作臺(tái)中取出1 mL菌液作為誘導(dǎo)前對照，在剩余菌液中加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，37 ℃誘導(dǎo)，每隔1 h收集菌體，離心收獲細(xì)菌沉淀。將收集的菌體用10 mmol/L的PBS (pH值8.0)懸浮進(jìn)行超聲破碎、蛋白純化，進(jìn)行SDS-PAGE分析，再轉(zhuǎn)印到NC膜上，5%的脫脂奶封閉后，加入鼠抗His單克隆抗體孵育，PBS清洗后加入1∶4 000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG孵育，DAB顯色至條帶清洗，完成對表達(dá)產(chǎn)物的Western Blot檢測。純化的蛋白與等體積的弗氏完全佐劑進(jìn)行充分混合，按照每只50 μg的劑量采用皮下多點(diǎn)注射法免疫四周齡昆明成年小鼠，對照組注射等劑量0.9%生理鹽水。14 d后，再進(jìn)行2次加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)免疫14 d后，眼眶采全血分離血清，采用ELISA方法測定抗體效價(jià)后，于-20 ℃分裝保存。

1.7 chTLR15的免疫組織化學(xué)檢測

采用石蠟包埋法對脾、肝、肺進(jìn)行處理，以約5 μm厚度進(jìn)行切片。脫蠟復(fù)水后用10%山羊血清進(jìn)行封閉后加入一抗，37 ℃濕盒孵育20 min，之后滴加生物素化二抗工作液，37 ℃孵育40 min，洗滌后滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP)，室溫濕盒中孵育40 min，用DAB進(jìn)行顯色。蘇木精復(fù)染、梯度脫水透明并樹膠封片。

2 結(jié)果與分析

2.1 chTLR15基因的PCR擴(kuò)增

以提取的雞脾臟組織中總RNA為模板，根據(jù)GenBank上發(fā)表的chTLR15基因的序列設(shè)計(jì)2對引物，PCR反應(yīng)后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，均得到清晰的目的條帶(圖1-2)，全部基因長度約為2 607 bp，其中，胞外區(qū)目的基因片段大小約為1 980 bp，與預(yù)期相符。

M.DNA Marker DL2000;1,2.chTLR15基因胞外區(qū)的擴(kuò)增。M.DNA Marker DL2000;1,2.Amplification of extracellular domain of chTLR15 gene.

M.DNA Marker DL5000;1.陰性對照;2.chTLR15基因全長的RT-PCR產(chǎn)物。M.DNA Marker DL5000;1.Negative control;2.Full-length RT-PCR products of chTLR15 gene.

圖3 chTLR15蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.3 The prediction of chTLR15 domain structures

2.2 chTLR15基因的生物信息學(xué)分析

經(jīng)序列拼接，獲得的海蘭褐雞TLR15基因全長2 607 bp，編碼868個(gè)氨基酸，其中，胞外區(qū)1 962 bp。該克隆序列已提交GenBank，登錄號為：MH143572。使用SMART在線軟件，模擬出chTLR15的功能區(qū)(圖3)。chTLR15蛋白胞外區(qū)位于肽鏈的N端區(qū)，有1個(gè)典型亮氨酸富集亞家族區(qū)(Leucine-rich repeats, typical subfamily, LRR_TYP)，6個(gè)明顯的亮氨酸重復(fù)序列(Leucine-rich repeat, LRR)，1個(gè)C端亮氨酸富集區(qū)(Leucine-rich repeat C-terminal domain, LRR_CT)，1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)和胞內(nèi)C端TIR結(jié)構(gòu)域，符合TLR分子的典型結(jié)構(gòu)特征[12]。應(yīng)用SWISS-MODEL在線軟件，模擬出chTLR15氨基酸的三級結(jié)構(gòu)(圖4)，N端的胞外區(qū)呈現(xiàn)出2個(gè)馬蹄形的折疊，中間的跨膜區(qū)由2個(gè)α螺旋組成，C端形成TIR結(jié)構(gòu)域，通過三維模擬可以看出，該分子中α螺旋的含量較少，β折疊和β轉(zhuǎn)角相對較多。

經(jīng)DNAMAN 6.0的比對以及MEGA 7.0建立的核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)(圖5)，與所選參考序列相比，三黃雞和海蘭褐雞的同源性高達(dá)99.85%，僅有4處位點(diǎn)發(fā)生變化，分別是168，449，925和1 362位堿基發(fā)生變化，但氨基酸的序列沒有變化；和草原松雞略有差異，同源性為92.13%，和鴻雁差異較大同源性為84.77%，與白腰叉尾海燕、紫水雞和其他物種差異較大。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，海蘭褐雞與家麻雀以及釘螺TLR15親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，序列差異也很大，與釘螺的核苷酸同源性是39.81%，氨基酸序列同源性僅有22.10%。

A圖與B圖是同一水平面，順時(shí)針旋轉(zhuǎn)90°。Figure A and Figure B are the same horizontal plane with clockwise rotation 90°.

圖5 基于不同物種TLR15的核苷酸序列進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree based on the nucleotide sequences of TLR15 from different species

2.3 chTLR15胞外區(qū)重組表達(dá)載體的構(gòu)建

以KpnⅠ和Hind Ⅲ分別雙酶切胞外區(qū)PCR產(chǎn)物和pET32a表達(dá)載體，回收目的片段后連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行雙酶切鑒定和測序驗(yàn)證。瓊脂糖凝膠電泳檢測后，得到一條約5 900 bp的片段和一條約2 000 bp的片段，與預(yù)期片段大小相符(圖6)。經(jīng)最后測序表明，目的基因片段已經(jīng)與表達(dá)載體相連接，并且正確插入到了表達(dá)載體的目的位點(diǎn)處，由此構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒，命名為pET32a-TLR15ER。

M1.DNA Marker DL15000;M2.DNA Marker DL2000;1.酶切產(chǎn)物;2.對照質(zhì)粒。M1.DNA Marker DL15000;M2.DNA Marker DL2000;1.Enzyme-digested product;2.Control plasmid.

2.4 胞外區(qū)的誘導(dǎo)表達(dá)和多克隆抗體的制備

將重組質(zhì)粒pET32a-TLR15ER轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(ED3)受體菌中，經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后每隔1 h收集菌樣，提取包涵體蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析(圖7)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在5 h為最佳誘導(dǎo)條件，誘導(dǎo)菌在72 ku處增加了一條特異的誘導(dǎo)表達(dá)條帶。取誘導(dǎo)后菌液，經(jīng)超聲波破碎后對收集的上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析(圖8)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在裂解沉淀物中有與目的蛋白大小相符的條帶，而上清中無此條帶，表明該表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在。經(jīng)過3次免疫制備鼠抗雞TLR15胞外區(qū)抗體，經(jīng)ELISA 檢測，抗體效價(jià)為1∶10 000。采用Western Blot方法檢測重組蛋白的特異性(圖9)，抗His單克隆抗體與pET32a-TLR15ER重組蛋白發(fā)生反應(yīng)，在分子量約為72 ku處出現(xiàn)一條特異性條帶。

M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn);1.細(xì)菌無誘導(dǎo)對照;2-8.誘導(dǎo)不同時(shí)間的表達(dá)產(chǎn)物。M.Protein Marker;1.Bacteria without induction control;2-8. Induction of expression products at different times.

M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn);1-3.菌體裂解的沉淀;4-6.菌體裂解的上清。M.Protein Marker;1-3.Precipitation of cell cleavage；4-6.Supernatant of cell cleavage.

M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.蛋白樣品的雜交條帶；2.未誘導(dǎo)重組菌。M.Protein Marker;1.Hybridization strip of protein sample;2.Uninduced recombinant bacteria.

2.5 chTLR15的免疫組織化學(xué)檢測

取海蘭褐雞脾臟、肝臟、肺的組織材料，經(jīng)免疫組織化學(xué)檢測(圖10)，A圖為脾臟，B圖為肝臟，C圖為肺。A、B、C組中1組為對照組，2組為試驗(yàn)組。結(jié)果表明，對照組無陽性染色，在試驗(yàn)組中，脾臟、肝臟、肺均有陽性染色，陽性染色細(xì)胞呈深黃色，脾臟染色最深；肝臟和肺染色較淺，少數(shù)陽性染色細(xì)胞呈淺黃色，表明脾臟是主要產(chǎn)生TLR15的部位且主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。

3 討論

眾所周知，早期對TLR的研究顯示，該基因可以參與果蠅背腹側(cè)極性的形成，所以命名為Toll受體[13]。隨后，Hashimoto等[14]研究發(fā)現(xiàn)，該基因編碼1種跨膜蛋白，進(jìn)而闡述了該蛋白的結(jié)構(gòu)。而在1996年，研究人員又發(fā)現(xiàn)該基因能夠激起成年果蠅的免疫反應(yīng)，其表達(dá)產(chǎn)物在抗感染方面發(fā)揮重要作用[15-16]。chTLR15作為天然免疫的重要組成部分，在禽類感染性疾病中的作用已經(jīng)具有了一定的研究基礎(chǔ)。已有研究表明，chTLR15主要在雞抗細(xì)菌感染過程中發(fā)揮重要作用[17]，但Chen等[18]研究發(fā)現(xiàn)TLR15也能夠識別病毒和細(xì)菌的非甲基化的CpG-DNA序列，激活機(jī)體的抗病毒反應(yīng)。而且，以往研究認(rèn)為TLR15為禽類所特有，但在2018年，有報(bào)道稱，在釘螺中發(fā)現(xiàn)TLR15[10], 但對該分子在細(xì)胞中的定位、配體的誘導(dǎo)和傳導(dǎo)的信號通路都尚未明確，故不能確定二者是同系物。由于物種的親緣關(guān)系，可以看出海蘭褐雞與三黃雞的核苷酸同源性高達(dá)99.85%，氨基酸完全一致。這與Ruan等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在不同地方品種雞chTLR15的胞外區(qū)會(huì)存在某些多態(tài)性位點(diǎn)的報(bào)道不一致。海蘭褐雞與其他鳥類之間相比親緣關(guān)系也較近，和貝類的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)[20]。

有研究表明，在受到細(xì)菌感染時(shí)chTLR15的表達(dá)量會(huì)上調(diào)[21]。王燕等[22]在用白痢沙門氏菌刺激雛雞時(shí)也得到了相同的結(jié)論。還有一些研究者通過免疫組化實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，chTLR15可以在脾臟中大量表達(dá)，說明脾臟在TLR15的表達(dá)中占有十分重要的地位，作為外周免疫器官，脾臟受到細(xì)菌感染之后，chTLR15的表達(dá)量會(huì)出現(xiàn)上調(diào)[23]。一些研究還揭示出禽類特異性的TLR15在功能上和TLR2相似[24]，這在雞感染沙門氏菌后，脾臟中TLR15和TLR2的mRNA表達(dá)量都會(huì)增加中得到證實(shí)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，未受感染的狀態(tài)下，海蘭褐雞TLR15在脾臟中表達(dá)量也是最高，與前述研究具有一致性。

TLR15在發(fā)揮作用時(shí)，主要通過其胞外區(qū)識別病原微生物的PAMPS，故本研究選用胞外區(qū)進(jìn)行原核表達(dá)，得到了與預(yù)計(jì)相符的重組目的蛋白，免疫動(dòng)物后獲得了相關(guān)抗體。在驗(yàn)證chTLR15組織分布譜時(shí)該抗體可以進(jìn)行有效的結(jié)合，表明該重組蛋白屬于有活性的有功能的TLR15分子，可以用于今后進(jìn)一步觀察分析TLR15的功能特征，并為開發(fā)出新型的生物制劑奠定了基礎(chǔ)，也為后續(xù)的相關(guān)領(lǐng)域的研究提供了充足的分子基礎(chǔ)。