郭靜文，史曉蕾，劉 茜，趙青松，邸 銳，劉兵強(qiáng)，閆 龍，王鳳敏，張孟臣，趙寶華，楊春燕

(1.河北省農(nóng)林科學(xué)院 糧油作物研究所，國家大豆改良中心石家莊分中心，農(nóng)業(yè)部黃淮海大豆生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北省遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050035； 2.河北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050024)

大豆(Glycinemax(L.) Merrill)起源于中國[1]，大豆籽粒中蛋白質(zhì)含量約占干質(zhì)量的40%左右，是人類重要的植物蛋白來源。21世紀(jì)以來，品質(zhì)性狀改良成為大豆育種的主要目標(biāo)之一，而提高大豆籽粒蛋白質(zhì)含量也成為國內(nèi)外品質(zhì)育種的重要指標(biāo)[2-3]。目前，通過常規(guī)雜交育種方法培育高蛋白大豆品種難度較大，而已發(fā)表的QTL定位結(jié)果有時(shí)也難以用于指導(dǎo)作物育種實(shí)踐。因此，如何利用大豆資源中的優(yōu)異基因，從分子水平揭示復(fù)雜的蛋白質(zhì)合成代謝機(jī)制，是進(jìn)行分子育種的重要前提。

國內(nèi)外關(guān)于大豆蛋白質(zhì)含量的研究有諸多報(bào)道。普遍認(rèn)為大豆蛋白質(zhì)合成受微效多基因調(diào)控，是數(shù)量性狀遺傳，加性效應(yīng)明顯[4]。試驗(yàn)材料的不同，環(huán)境條件的差異對蛋白質(zhì)的含量也均有較大的影響。目前，在大豆所有的20個(gè)染色體上均發(fā)現(xiàn)有相關(guān)的QTL位點(diǎn)，共有298個(gè)QTL，詳細(xì)信息可參考公共網(wǎng)站(http://soybase.org/)。連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析均顯示20號染色體檢測到的大豆籽粒蛋白質(zhì)合成相關(guān)QTL的頻率最高[5-7]，且在該染色體上有一個(gè)QTL區(qū)段(A688～Satt239)在多個(gè)環(huán)境和群體中均被檢測到[8]。同時(shí)，大量研究表明，蛋白質(zhì)含量與油分含量、單株產(chǎn)量、株高、主莖節(jié)數(shù)、主莖分枝數(shù)、開花期、成熟期均呈負(fù)相關(guān)[9-11]，而蛋白質(zhì)與脂肪兩性狀很難通過染色體片段重組的方法分開，因此，推測這2個(gè)性狀緊密連鎖或一因多效[12]。

對于蛋白質(zhì)合成積累的研究，早期主要集中在闡述蛋白質(zhì)構(gòu)成因子、物質(zhì)積累過程和環(huán)境條件幾個(gè)方面。蛋白質(zhì)的基本組成單位是氨基酸，氨基酸通過脫水縮合形成肽鏈。蛋白質(zhì)是由1條或多條多肽鏈組成的生物大分子，每一條多肽鏈有20至數(shù)百個(gè)氨基酸殘基不等。關(guān)于蛋白質(zhì)合成的調(diào)控，前人研究發(fā)現(xiàn),磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)是控制種子中蛋白質(zhì)和脂肪酸合成的重要調(diào)控基因，廣泛分布于高等植物的細(xì)胞質(zhì)中。Chen等[13]發(fā)現(xiàn)利用反義PEP基因轉(zhuǎn)化油菜籽粒后，檢測到蛋白質(zhì)含量降低，同時(shí)含油量比對照增加了15%以上，該研究證明了底物競爭調(diào)控籽粒蛋白質(zhì)、脂肪比率的理論。轉(zhuǎn)錄因子是一類蛋白質(zhì)合成的重要調(diào)控因子，它們在蛋白質(zhì)代謝中發(fā)揮著重要作用。大豆轉(zhuǎn)錄因子GmDof4和GmDof11轉(zhuǎn)化擬南芥后，抑制了蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)[14]。近些年來，研究人員通過比較不同物種間蛋白質(zhì)合成相關(guān)的基因，從中發(fā)現(xiàn)一些共性的調(diào)控基因：LEC1、LEC2、ABI3、FUS3，這些關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控著胚胎發(fā)生和種子的成熟。LEC1是ABI3、FUS3上游的正向調(diào)控因子，而ABI3、FUS3、LEC1 基因協(xié)同作用以控制種子發(fā)育過程中的多個(gè)基本過程，當(dāng)其中某個(gè)基因發(fā)生突變后，不僅貯藏蛋白的含量降低，同時(shí)也降低了對ABA的敏感性[15]。通過對蛋白質(zhì)合成基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式調(diào)控元件進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，貯藏蛋白基因的啟動(dòng)子區(qū)域具有2個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域 RY/G和B-box，其中RY/G結(jié)構(gòu)域包括2個(gè)作用元件 RY(CATGCA)和G-box(CACGTG)分別與B3或bZIP、bHLH類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，而B-box由DistB (GCCACTTGTC)和ProxB(CAAACACC)2個(gè)作用元件組成，分別與bZIP或MYB類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，因此，推測這些轉(zhuǎn)錄因子對蛋白質(zhì)的合成具有調(diào)控作用[16]。

轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(RNA-Seq)的發(fā)展使得功能基因和蛋白的發(fā)現(xiàn)步伐大大加快。該技術(shù)將 RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA，然后對 cDNA 文庫進(jìn)行測序，旨在快速全面的獲取某物種在某狀態(tài)的下的全部轉(zhuǎn)錄本[17]。其以速度快、準(zhǔn)確性高、運(yùn)行成本低等特性受到廣泛關(guān)注。與基因芯片技術(shù)相比，RNA-Seq技術(shù)能夠?qū)μ囟?xì)胞或組織在特定狀態(tài)下的基因表達(dá)種類和豐度進(jìn)行更精準(zhǔn)的定性定量分析。近年來 RNA-Seq 技術(shù)在作物研究中被廣泛應(yīng)用于基因資源挖掘、揭示突變體變異機(jī)制、探究作物生理生化過程、研究抗病、抗逆的機(jī)制等方面，為不同生物的功能基因組學(xué)開展提供了新的思路與研究方法[18-19]。在基因資源的挖掘方面，Wang等[20]利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對野生和突變型棉花的毛狀體纖維細(xì)胞的分裂與延長過程進(jìn)行探究；和小燕等[21]以含油量高及含油量低的2個(gè)花生品系為研究材料，構(gòu)建了與油脂累積相關(guān)的2個(gè)發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組測序文庫，發(fā)現(xiàn)各類調(diào)控脂肪酸生物合成的基因在花生種子油脂合成初期十分活躍，并挖掘到油體固醇蛋白等基因可能參與了油脂的合成與代謝；除此之外，研究人員利用 454 平臺(tái)從玉米[22]、羊草、油橄欖[23]等植物中發(fā)現(xiàn)了新基因。RNA-Seq技術(shù)對揭示突變體變異機(jī)制也具有一定的作用。欒海業(yè)等[24]以大麥白化穎殼突變體與野生型植株為研究材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，結(jié)果表明，導(dǎo)致大麥白化穎殼突變體的出現(xiàn)，可能是因?yàn)槿~綠體形成和發(fā)育的相關(guān)基因其表達(dá)受到了相關(guān)抑制，從而導(dǎo)致了光合作用的降低。在探究作物生理生化過程方面，陳靜[25]利用 RNA-Seq 技術(shù)對花生種子休眠與解除休眠過程進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)赤霉素 20 氧化酶、EREBP-like 因子熱激蛋白等綜合調(diào)控花生種子休眠解除以及萌發(fā)。在抗病蟲害研究中，李海燕等[26]以抗病的五寨黑豆為材料，對大豆胞囊線蟲侵染前與侵染后的轉(zhuǎn)錄組文庫進(jìn)行檢測對比，發(fā)現(xiàn)苯丙烷類代謝途徑及氧化磷酸化代謝通路對五寨黑豆的抗病有重要作用。黃啟秀等[27]利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對抗枯萎病抗性表現(xiàn)不同的7種材料進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了可能與海島棉枯萎病抗性相關(guān)的代謝通路-類黃酮代謝通路。除此之外，研究人員還應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在水稻[28]、小麥[29-30]以及甘薯[31]等作物中進(jìn)行了相關(guān)的抗病試驗(yàn)，取得了一定的結(jié)果。在抗逆境領(lǐng)域，任夢露等[32]利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)研究大豆莖稈對蔭蔽脅迫的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)南豆 12 在蔭蔽脅迫下其細(xì)胞壁多糖的含量和木質(zhì)素含量有明顯提升，并對生長素發(fā)生響應(yīng)，以此方式來增加植株莖的強(qiáng)度，從而保持莖的某種形態(tài)優(yōu)勢，并提升其抗倒伏性，最終實(shí)現(xiàn)提高對蔭蔽環(huán)境的適應(yīng)程度。孫愛清等[33]以強(qiáng)抗旱花生品種為材料，對干旱處理過的花生葉片進(jìn)行 RNA-Seq 分析，旨在探究花生干旱脅迫下的植株響應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)類黃酮代謝途徑可能在該過程中有重要作用。目前，作物中利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的應(yīng)用十分廣泛，但在挖掘大豆發(fā)育時(shí)期籽粒中蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因的研究鮮有報(bào)道。

因此，本研究以遺傳背景相近的大豆高蛋白品系冀HJ117及其回交親本冀豆12為研究材料，利用測序技術(shù)檢測兩樣本開花后14 d籽粒的表達(dá)譜。通過對差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋、GO功能分類、富集代謝途徑的分析以及熒光定量PCR分析，篩選出與蛋白質(zhì)合成密切相關(guān)的基因，為揭示蛋白質(zhì)合成代謝機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

親本組合冀豆12與茶秣食豆雜交后代與母本冀豆12(蛋白質(zhì)含量46.48%)回交2次，得到高蛋白大豆冀HJ117(蛋白質(zhì)含量52.99%)。冀HJ117和冀豆12由河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所提供。將冀HJ117和冀豆12大豆籽粒種植于河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所堤上試驗(yàn)站，當(dāng)試驗(yàn)材料進(jìn)入開花盛期時(shí)，分別對冀HJ117和冀豆12同一天開花的花朵進(jìn)行標(biāo)記，并對開花后14 d的籽粒進(jìn)行取樣，使用液氮速凍保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA-Seq文庫的構(gòu)建及測序 RNA-Seq文庫構(gòu)建及測序工作由華大基因科技有限公司完成。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理及差異表達(dá)基因的篩選 對測序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去雜處理得到有效序列(Clean reads)，使用比對軟件SOAPaligner/soap2將有效序列比對到參考基因組。利用唯一比對上基因的reads數(shù)目和比對上參考序列的總reads數(shù)來計(jì)算基因表達(dá)量，基因表達(dá)量的計(jì)算使用RPKM法[34]，差異表達(dá)基因的篩選參照Audic等[35]發(fā)表在Genome Research上的基于測序的差異基因檢測方法?；诓町惢虻墓δ茏⑨?，對所有差異表達(dá)基因進(jìn)行Gene Ontology(GO)功能顯著性富集分析，分析將計(jì)算得到的P值(P-value)通過Bonferroni校正之后，以correctedP-value≤0.05為閾值，滿足此條件的GO條目(GO term)定義為在差異表達(dá)基因中顯著富集的GO term，以此確定差異表達(dá)基因行使的主要生物學(xué)功能。代謝通路(Pathway)顯著性富集分析將Q值(Q value)≤0.05的Pathway定義為在差異表達(dá)基因中顯著富集的Pathway，從而確定差異表達(dá)基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

1.2.3 qRT-PCR檢測候選基因的表達(dá)量 隨機(jī)選取9個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行基因的表達(dá)量檢測，使用北京天根公司的RNA prep pure Plant Kit試劑盒分別提取大豆冀HJ117及冀豆12 14 d籽粒的RNA，并使用TaKaRa RNA PCRTMKit(AMV) Ver.3.0反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，進(jìn)行熒光定量PCR分析，選用CYP2基因?yàn)閮?nèi)參基因。

試驗(yàn)所選基因及引物序列如表1，合成于生工生物工程(上海)股份有限公司。qRT-PCR試驗(yàn)參照TaKaRa Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒，反應(yīng)體系含SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL、模板0.5 ng、PCR正向引物(10 μmol/L) 1 μL、PCR反向引物(10 μmol/L) 1 μL, 補(bǔ)水至總體積20 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃孵育30 s；40個(gè)循環(huán)的95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s。該反應(yīng)使用美國Bio-Rad Lcycleri Q5熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用 2-ΔΔCt法進(jìn)行相對定量分析，計(jì)算過程如下：先分別計(jì)算出每組的ΔΔCt=(Ct目的基因1-Ct內(nèi)參基因)-(Ct目的基因2-Ct內(nèi)參基因)，再根據(jù)ΔΔCt 求出 2-ΔΔCt以及標(biāo)準(zhǔn)誤。使用Microsoft Excel 2007 軟件處理數(shù)據(jù)并作圖。

表1 基因名稱及引物序列Tab.1 Genes and primers for qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 測序質(zhì)量評估與數(shù)據(jù)比對統(tǒng)計(jì)

通過高通量測序儀Illumina HiSeqTM2000對冀豆12和冀HJ117 14 d籽粒的cDNA測序，分別得到原始序列8 747 900，8 486 919條。通過過濾，冀豆12得到有效序列8 684 049條，占原始序列的99.27%；冀HJ117得到有效序列8 410 499條，占原始序列的99.10%。表明測序質(zhì)量較高，適合進(jìn)行后續(xù)的生物信息分析。

將冀豆12與冀HJ117過濾得到的有效序列與大豆參考基因組進(jìn)行比對，表2是各樣品與參考基因組的數(shù)據(jù)比對統(tǒng)計(jì)。從比對結(jié)果看，兩樣本成功比對上的序列均在700萬條以上，效率分別為85.75%，86.01%。

表2 有效序列與參考基因組比對結(jié)果統(tǒng)計(jì)Tab.2 Comparison between clear reads and reference genomes

2.2 cDNA片段隨機(jī)性檢驗(yàn)

由于不同參考基因有不同的長度，筆者把reads在參考基因上的位置標(biāo)準(zhǔn)化到相對位置(reads在基因上的位置與基因長度的比值)，然后統(tǒng)計(jì)基因不同位置比對上的reads數(shù)量。從圖1可以看出，2個(gè)樣品的reads在參考基因上不同位置的分布相對比較均勻，表明cDNA片段化的隨機(jī)性好，保證了測序質(zhì)量。

2.3 差異表達(dá)基因的篩選

將兩樣本差異檢驗(yàn)的P-value作多重假設(shè)檢驗(yàn)(FDR)校正，并根據(jù)基因的表達(dá)量(RPKM值)計(jì)算該基因在不同樣本間的差異表達(dá)倍數(shù)。將同時(shí)滿足FDR≤0.001且倍數(shù)差異不低于2倍的基因定義為差異表達(dá)基因。經(jīng)分析冀HJ117和冀豆12 2個(gè)轉(zhuǎn)錄組，共得到差異表達(dá)基因336個(gè)，其中冀HJ117較冀豆12上調(diào)表達(dá)基因195個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因141個(gè)(圖2-A)。

2.4 差異表達(dá)基因的功能注釋

通過差異表達(dá)基因的篩選，獲得差異表達(dá)基因的GO IDs。對冀豆12和冀HJ117的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋，在336個(gè)差異表達(dá)基因中，獲得功能注釋的基因?yàn)?34個(gè)，未找到匹配信息的基因數(shù)為102個(gè)，2種情況占比分別為69.94%，30.36%(圖2-B)。

A.冀豆12的reads在參考基因上的分布均勻性統(tǒng)計(jì)；B.冀HJ117的reads在參考基因上的分布均勻性統(tǒng)計(jì)。A.Distribution statistics of reads mapped to reference gene in Jidou 12; B. Distribution statistics of reads mapped to reference gene in Ji HJ117.

A.差異表達(dá)基因的篩選；B.差異表達(dá)基因的功能注釋統(tǒng)計(jì)。A.Screening of differential transcription genes; B. Functional annotation of differential transcription genes.

2.5 差異表達(dá)基因的GO分類

對樣本冀HJ117與冀豆12的336個(gè)差異表達(dá)基因的GO功能注釋進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，GO總共有3個(gè)類目，分別描述基因參與的生物過程、所處的細(xì)胞位置以及基因的分子功能。

圖3是冀HJ117與冀豆12樣品差異表達(dá)基因GO注釋聚類圖，從圖中可知，在生物過程分組的差異表達(dá)基因注釋到了15個(gè)GO條目中，其中新陳代謝過程有95個(gè)差異表達(dá)基因，占生物過程分類的22.9%，其中61個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，34個(gè)基因下調(diào)表達(dá)；細(xì)胞過程有76個(gè)差異表達(dá)基因，占生物過程的18.4%，47個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，29個(gè)基因下調(diào)表達(dá)；應(yīng)激反應(yīng)有58個(gè)差異表達(dá)基因，占14.0%，上調(diào)表達(dá)基因41個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因17個(gè)；而生物過程正向調(diào)控所占比例最低，僅有2個(gè)差異表達(dá)基因下調(diào)表達(dá)，占比例0.5%。

在所處的細(xì)胞位置類目下差異表達(dá)基因共注釋到6個(gè)GO條目中，其中細(xì)胞、細(xì)胞組分、細(xì)胞器3個(gè)條目的差異表達(dá)基因較多，分別有160，144，98個(gè)差異表達(dá)基因，占細(xì)胞位置的36.2%，32.7%，22.2%；封閉性膜和大分子復(fù)合物的差異表達(dá)基因數(shù)目最少，均為4個(gè)，占0.9%比例。

然而在分子功能分組中差異表達(dá)基因注釋到5個(gè)GO條目，其中具有催化活性的差異表達(dá)基因有117個(gè)，占49.5%；具有連接活性的差異表達(dá)基因有101個(gè)，占42.8%；而酶調(diào)節(jié)活性和分子傳感器活性均僅有2個(gè)差異表達(dá)基因，占該分組比例0.8%。

2.6 GO功能的顯著性富集分析

GO功能顯著性富集分析可以篩選出在差異表達(dá)基因中顯著富集的GO功能條目，并篩選出差異表達(dá)基因與哪些生物學(xué)功能顯著相關(guān)。結(jié)果如表3所示，參考基因在生物過程分組中有注釋的基因共25 633個(gè)，本研究有注釋的差異表達(dá)的基因共171個(gè)。在該分組中有3個(gè)條目顯著富集，主要涉及應(yīng)激反應(yīng)、化學(xué)穩(wěn)態(tài)以及離子穩(wěn)態(tài)；在細(xì)胞位置分組，有注釋的參考基因共27 869個(gè)，本研究注釋到162個(gè)基因差異表達(dá)，并在高爾基堆，高爾基池2個(gè)條目達(dá)到顯著富集；在分子功能分組，有注釋的參考基因共29 635個(gè)，本研究有179個(gè)注釋的差異表達(dá)基因，這些差異表達(dá)基因在氧化還原酶類、氧化金屬離子、受體氧，氧化還原酶類、氧化金屬離子，氧化還原酶類3個(gè)條目顯著富集。

圖3 差異表達(dá)基因GO注釋聚類圖Fig.3 GO annotation of differentially expressed genes

表3 差異表達(dá)基因中顯著富集的GO termsTab.3 Significantly enriched GO items in DEGs

2.7 KEGG分析

將樣本冀HJ117與冀豆12的表達(dá)基因與KEGG數(shù)據(jù)庫比對，數(shù)據(jù)庫中具有通路注釋的基因共29 169個(gè)，本研究中注釋到的差異表達(dá)的基因共有197個(gè)，參與了72個(gè)代謝通路。將Qvalue≤0.05的pathway定義為在差異表達(dá)基因中顯著富集的Pathway。本試驗(yàn)的Pathway顯著性富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，差異基因僅顯著富集在蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成途徑中，該途徑共有34個(gè)差異表達(dá)基因，占有注釋的差異表達(dá)基因的17.26%，其中冀HJ117較冀豆12有33個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，1個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。

除此之外，差異表達(dá)基因還參與黃酮和黃酮醇的生物合成，丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝，脂肪酸生物合成，檸檬烯和蒎烯降解，類黃酮生物合成以及各類氨基酸的代謝和蛋白質(zhì)輸出途徑等通路中，其詳細(xì)信息統(tǒng)計(jì)于表4中。

圖4為KEGG數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成途徑的詳細(xì)信息，其中加粗方框?yàn)樯险{(diào)基因所在位置，虛線方框?yàn)橥瑫r(shí)存在上調(diào)基因和下調(diào)基因。差異表達(dá)基因推測的蛋白名稱、所對應(yīng)的KO號以及該基因的log2ratio值統(tǒng)計(jì)于表5中。從表中發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因所對應(yīng)的表達(dá)蛋白主要有鈣聯(lián)蛋白(Calnexin，CNX)、結(jié)合免疫球蛋白(Binding immunoglobulin protein，Bip)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合連接酶(RING-finger protein with membrane anchor 1，RMA1)以及熱激蛋白(Heat shoct proteins，Hsp20、Hsp40、Hsp70、Hsp90)。其中熱激蛋白Hsp20的差異表達(dá)基因最多，共21個(gè)，其中20個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，1個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。

表4 Pathway顯著性富集分析結(jié)果Tab.4 Pathway enrichment analysis of DEGs

注：**.達(dá)到極顯著差異。

Note：**.The difference is significant at the 0.01 level.

加粗標(biāo)記為上調(diào)基因所在位置；虛線標(biāo)記為下調(diào)基因所在位置。The bold marker is the location of the up-regulated genes; The dotted marker is the location of the down-regulated gene.

表5 蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成途徑差異表達(dá)基因詳細(xì)信息Tab.5 Details of genes in protein processing in endoplasmic reticulum

2.8 調(diào)控表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子分析

在冀HJ117與冀豆12差異表達(dá)的336個(gè)差異表達(dá)基因中，共有6個(gè)調(diào)控表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，分屬在5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族中，分別是MYB、AP2、HSF、B3、以及Trihelix。其中有4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在冀HJ117中表達(dá)量較高，有2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在冀豆12中表達(dá)量較高，表6是差異表達(dá)基因中的轉(zhuǎn)錄因子的詳細(xì)信息。

表6 差異表達(dá)基因中的轉(zhuǎn)錄因子Tab.6 Transcription factors of differential transcription genes

2.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的可靠性，從蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成途徑的34個(gè)差異表達(dá)基因中隨機(jī)挑選9個(gè)基因(表1)進(jìn)行qRT-PCR檢測，經(jīng)檢測候選基因擴(kuò)增的引物熔解曲線均為單峰，表明該引物對基因的擴(kuò)增具有特異性。

通過對9個(gè)基因分別在冀HJ117與冀豆12 14 d籽粒中的表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，候選基因在冀HJ117中的表達(dá)量均高于在冀豆12中的表達(dá)量(圖5)，該結(jié)果與RNA-Seq的分析結(jié)果趨勢相一致。

圖5 候選基因在冀HJ117與冀豆12的表達(dá)量Fig.5 Expression of candidate genes in Ji HJ117 and Jidou12

3 結(jié)論與討論

蛋白質(zhì)的合成代謝是個(gè)復(fù)雜的過程，主要涉及兩方面：一是氨基酸的生理合成，即碳素和氮素的調(diào)運(yùn)，二是貯藏蛋白基因的轉(zhuǎn)錄翻譯及加工。大豆作為固氮植物將大氣中的氮?dú)廪D(zhuǎn)化為氨，氨通過轉(zhuǎn)氨作用為其他氨基酸提供氨基，其中谷氨酰胺合成酶是氨代謝中的一個(gè)主要調(diào)控點(diǎn)。對于氨基酸的生物合成機(jī)理，多數(shù)氨基酸有其各自的合成通路，并與眾多基因和酶的參與有關(guān)，其發(fā)生作用的位點(diǎn)、啟動(dòng)功能的時(shí)期以及如何使細(xì)胞內(nèi)的各組分發(fā)生變化目前尚無定論[36]。杜若琛[37]研究發(fā)現(xiàn)，大豆種子的發(fā)育可分為 3 個(gè)時(shí)期：開花后 10～30 d為前期，該時(shí)期為蛋白質(zhì)合成階段；30～80 d為中期，該時(shí)期蛋白質(zhì)發(fā)生快速積累，并合成貯藏蛋白；80～100 d為后期，蛋白質(zhì)積累緩慢。其中貯藏蛋白占種子總蛋白含量的80%左右[38]，可分為白蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白4類。在種子的胚發(fā)育過程中，醇溶蛋白在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成，而后形成蛋白質(zhì)聚集體，直接形成蛋白體并于其中貯存。白蛋白、球蛋白和谷蛋白首先在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上形成分子量較大的前體，經(jīng)過高爾基體的受體分選，進(jìn)入特定的運(yùn)輸囊泡，經(jīng)由受依賴型運(yùn)輸或聚集體形式運(yùn)輸至蛋白質(zhì)貯存液泡中，最后經(jīng)過液泡加工酶等的剪接轉(zhuǎn)換為成熟型貯藏蛋白質(zhì)[39]。

在本研究中，冀HJ117與冀豆12的差異表達(dá)基因顯著富集在蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成途徑中，其差異表達(dá)的基因主要為鈣聯(lián)蛋白(CNX)、結(jié)合免疫球蛋白(Bip)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合連接酶(RMA1)以及熱激蛋白(Hsp20、Hsp40、Hsp70、Hsp90)。該途徑中，差異表達(dá)的Hsp基因所占比例最高，尤其以Hsp20的差異表達(dá)基因最多，共有21個(gè)。Hsp是一類從細(xì)菌到高等真核生物中普遍存在且高度保守的蛋白，根據(jù)分子量的大小可以分為5個(gè)家族，即Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60和小分子熱激蛋白(sHSF)，因?yàn)閟HSF的分子量普遍在20 ku左右，故也稱為Hsp20[40]。許多研究表明，熱激蛋白在細(xì)胞中可以作為“分子伴侶”參與合成中的多肽反應(yīng)，使其正確折疊；它還能夠幫助新生肽穿過細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)到細(xì)胞的不同部位發(fā)生作用；在高溫等脅迫環(huán)境中，熱激蛋白可以組織熱變性蛋白的聚集，阻止蛋白的不可逆變性或有利于蛋白質(zhì)變性后的復(fù)性[41]。

鈣聯(lián)蛋白是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的一種磷酸化的鈣結(jié)合蛋白，在哺乳細(xì)胞中它會(huì)與單葡糖基化修飾的糖蛋白相連接，幫助其成熟[42]。對于那些需要更多加工的非天然蛋白質(zhì)，將會(huì)被UDP葡萄糖糖蛋白葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(Glycoprotein glucosyltransferase，GT)識別，并使其聚糖分子A分支重新葡萄糖基化，這樣就可以再次與鈣聯(lián)接蛋白或鈣網(wǎng)織蛋白相連，進(jìn)行重新折疊，這就是鈣聯(lián)接蛋白-鈣網(wǎng)織蛋白循環(huán)(Calnexin-calreticulin cycle)[43]。Bip屬于Hsp70家族蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)體中的成員，參與進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)體的分泌型蛋白質(zhì)和膜蛋白的折疊、貯存和轉(zhuǎn)運(yùn)過程[44]。

本研究中對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能的顯著性富集分析，顯示差異表達(dá)基因在氧化還原酶類條目中顯著富集。而有研究表明，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的時(shí)候，會(huì)有一套“質(zhì)控”系統(tǒng)將折疊正確的蛋白質(zhì)釋放，對于發(fā)生錯(cuò)誤的蛋白將通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的降解途徑(ER-associated degradation，ERAD)運(yùn)出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并降解[45]。在該降解途徑中，Hsp70伴侶蛋白會(huì)與非天然蛋白結(jié)合，并使其與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合酶Doa10、RMA1、HRD相結(jié)合，防止其轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體。Hsp70分子蛋白還可以與氧化還原酶類蛋白一起幫助構(gòu)象不正確的蛋白重新折疊，改變其構(gòu)象[46]。攜帶有膜錨定結(jié)構(gòu)的RMA1存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，該蛋白是一種在擬南芥到人類中都廣泛存在、非常保守的泛素連接酶[32]。RMA1蛋白能與UBE2J1蛋白相互作用，如果過表達(dá)RMA1蛋白會(huì)降低細(xì)胞內(nèi)囊性纖維化病跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)的水平[47]。RMA1蛋白最主要的作用是在CFTR蛋白翻譯過程中或翻譯剛剛完成之后檢測CFTR蛋白N末端結(jié)構(gòu)域的折疊情況。

本研究中還篩選到一些與蛋白質(zhì)合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，主要包括5個(gè)家族的轉(zhuǎn)錄因子，分別是MYB、AP2、Hsf、B3、以及Trihelix家族的轉(zhuǎn)錄因子。前人研究表明，熱休克轉(zhuǎn)錄因子是一組結(jié)構(gòu)及功能具有廣泛同源性，普遍存在于真核生物細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)高度保守[48]。植物中Hsfs分為A、 B、 C 3個(gè)家族，又分為16個(gè)亞族。前人研究表明，植物中存在的Hsfs，能夠與Hsps的啟動(dòng)子區(qū)域的熱機(jī)元件(HSEs)結(jié)合，從而啟動(dòng)熱激反應(yīng)，激活下游基因的表達(dá)，對提高植物的耐熱性有重要的調(diào)控作用。大豆中有38個(gè)Hsfs基因，劃分到3個(gè)家族，12個(gè)亞族中，其中GmHsf-34基因在擬南芥中的超量表達(dá)，提高了植株對干旱和熱脅迫的耐受性[49]。Chauhan等[50]從小麥種子中克隆了TaHsfA2d，轉(zhuǎn)TaHsfA2d擬南芥植株不僅表現(xiàn)耐高溫，還表現(xiàn)出耐鹽和抗旱性，同時(shí)轉(zhuǎn)基因植株還表現(xiàn)出較高的產(chǎn)量和生物量積累。在黃淮海地區(qū)，大豆的生長季在6-10月之間，而大豆一般在7月下旬進(jìn)入開花期，因此，大豆的開花期至鼓粒期是黃淮海地區(qū)最熱的時(shí)期。本研究中檢測到一個(gè)Hsf轉(zhuǎn)錄因子的高表達(dá)，推測該基因與提高大豆的耐熱性有關(guān)，對蛋白質(zhì)合成的影響還需進(jìn)一步的研究。除此之外，在冀HJ117與冀豆12的差異表達(dá)基因中還檢測到MYB和B3類轉(zhuǎn)錄因子，Ezcurra[18]和Reidt[15]等研究表明，該類轉(zhuǎn)錄因子對蛋白質(zhì)的合成具有調(diào)控影響。因此，推測本研究篩選到的轉(zhuǎn)錄因子與蛋白質(zhì)合成密切相關(guān)，但這些轉(zhuǎn)錄因子具體的作用機(jī)制還需深入的研究。

綜合上述研究，本研究以遺傳背景接近的冀HJ117與冀豆12為材料，對開花后14 d的籽粒進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，篩選到與蛋白質(zhì)合成相關(guān)的基因。差異表達(dá)基因富集的GO分子功能條目與蛋白折疊有關(guān)，并且通過Pathway顯著性富集分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因富集在蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成途徑中，該途徑中的鈣聯(lián)蛋白、結(jié)合免疫球蛋白、熱激蛋白以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合連接酶均在蛋白質(zhì)合成通路中起關(guān)鍵作用，因此，該途徑是冀HJ117與冀豆12蛋白質(zhì)含量產(chǎn)生差異的重要通路。

RNA-Seq分析獲得了大豆中蛋白質(zhì)合成相關(guān)的基因的基本信息及其可能的生物學(xué)功能。蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成途徑可能是冀豆12與冀HJ117蛋白含量產(chǎn)生差異的重要通路，因此，在該途徑中富集的差異表達(dá)基因以及篩選到的差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子很可能是與蛋白合成密切相關(guān)的基因。