宋衍秋，毛用敏，秦勤，2，叢洪良，2

心力衰竭是各種心臟病的終末階段，是威脅全球性公眾健康的主要原因，病死率高、預(yù)后差，傳統(tǒng)藥物治療雖能有效緩解心力衰竭的癥狀，降低患者住院率，但其5年病死率仍超過50%［1］，未達(dá)到理想的治療效果。β-腎上腺素受體（β-AR）是交感神經(jīng)系統(tǒng)的重要成員，近年來在人類和動物模型中均證實衰竭心臟β3-AR表達(dá)較非衰竭心臟升高2～3倍，具有負(fù)性肌力作用［2-3］，提示β3-AR可能在心力衰竭的發(fā)生發(fā)展過程中具有一定的作用。然而β3-AR在心力衰竭中具體作用尚未闡明。目前尚鮮見應(yīng)用慢病毒RNA干擾（RNAi）技術(shù)研究β3-AR的相關(guān)報道。本研究旨在構(gòu)建攜帶大鼠β3-AR基因（Adrb3）慢病毒干擾載體，可用于后續(xù)體內(nèi)外實驗，為進(jìn)一步研究Adrb3在心力衰竭中的作用提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 慢病毒干擾載體（GV248）、慢病毒包裝質(zhì)?；旌衔铮↙enti-Easy Packaging Mix）由上海吉凱基因技術(shù)有限公司提供；293T細(xì)胞由天津市心血管病研究所保存；大鼠血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）購自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司；T4DNA ligase、AgeⅠ、EcoRⅠ核酸內(nèi)切酶 、GeneJET Plasmid Miniprep Kit、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，HG-DMEM（GIBCO）、0.5%胰蛋白酶-EDTA（GIBCO）、青霉素/鏈霉素及胎牛血清（GIBCO）、Opti-MEM（GIBCO），LipofectamineTMLTX Reagent（Invitrogen）購自美國 Thermo Fisher Scientific公司；RNAisoTMPlus、SYBR Green qPCR MasterMix購自寶生物工程（大連）有限公司；總蛋白提取試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；引物委托北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成；小鼠抗大鼠Adrb3抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；GAPDH抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；羊抗小鼠HRP-IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；LumiGLO Chemiluminescent Substrate購自美國KPL公司。超濾濃縮管（Millipore，MilliporeSigma公司，美國）、核酸蛋白定量檢測儀（BioPhotometer，Eppendorf公司，德國），PCR 儀（PE 9600，Eppendorf公司，德國）、低溫高速離心機(jī)（5417R，Eppendorf公司，德國）、臺式高速離心機(jī)（5415DR，Eppendorf公司，德國）、倒置熒光顯微鏡（NiKon公司，日本）、成像分析軟件（SPOT Imaging公司，美國）、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific公司，美國）、層流超凈工作臺、實時定量PCR儀（7500，ABI公司，美國），電泳系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國），ChemiDOCTMXRS+System（Bio-Rad公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒載體質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)GenBank中大鼠Adrb3基因序列（NM_013108.2）設(shè)計合成2個編碼短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）和單鏈DNA寡核苷酸序列，見表1、2，由上海吉凱基因技術(shù)有限公司合成。單鏈DNA寡核苷酸序列退火形成雙鏈DNA寡核苷酸序列（含有與GV248質(zhì)粒AgeⅠ、EcoRⅠ雙酶切后匹配的粘性末端），退火產(chǎn)物與AgeⅠ、EcoRⅠ雙酶切線性化的GV248質(zhì)粒經(jīng)T4DNA ligase連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆，測序鑒定，測序正確者嚴(yán)格按照GeneJET Plasmid Miniprep Kit說明書操作，提取慢病毒載體質(zhì)粒。

Tab.1 Target sequence information of rat Adrb3 gene sequence(NM_013108.2)表1 大鼠Adrb3基因序列（NM_013108.2）Target序列信息

1.2.2 慢病毒的包裝、收集、濃縮 常規(guī)復(fù)蘇培養(yǎng)293T細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)5×106細(xì)胞傳至100 mm2培養(yǎng)皿，37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)，待293T細(xì)胞密度90%左右，擬行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2 h更換細(xì)胞培養(yǎng)基為Opti-MEM。取慢病毒載體質(zhì)粒Adrb3-RNAi-1、Adrb3-RNAi-2及Adrb3-RNAi-control各16 μg與25 μL Lenti-Easy Packaging Mix、12.5 μL PLUSTMReagent及相應(yīng)體積Opti-MEM混合均勻，總體積為1.5 mL，室溫下溫育10 min。LipofectamineTMLTX Reagent 30 μL加至上述混合液中，混勻，室溫靜置30 min。上述轉(zhuǎn)染體系混合液加至293T細(xì)胞100 mm2培養(yǎng)皿中，混勻，37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)8 h后，棄培養(yǎng)基，10 mL PBS洗滌1次。更換常規(guī)DMEM培養(yǎng)基10 mL，繼續(xù)培養(yǎng)。倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）表達(dá)。

轉(zhuǎn)染72 h后（轉(zhuǎn)染即時為0 h），分別收集293T細(xì)胞上清，獲得攜帶rAdrb3基因慢病毒干擾載體1（Lv-rAdrb3-shRNA-1），攜帶rAdrb3基因慢病毒干擾載體2（Lv-rAdrb3-shRNA-2）及空載慢病毒（Lv-rAdrb3-shRNA-control）；4℃、1 000 r/min離心5 min，去除細(xì)胞碎片；使用0.22 μm的濾器過濾慢病毒上清液；加入到50 mL規(guī)格的超濾濃縮管中；4℃、4 000 r/min離心30 min；所得慢病毒濃縮液分裝，-80℃保存。

1.2.3 慢病毒的滴度測定 293T細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，測定前1 d96孔細(xì)胞板鋪板，每孔細(xì)胞計數(shù)5×103個，體積100 μL，擬行感染；感染前，對待測病毒進(jìn)行10倍梯度稀釋。8個無菌0.5 mL EP管，每管加入10%FBS的DMEM 90 μL，第1個EP管加入待測病毒原液10 μL，混勻后，從第1個管中取10 μL加入到第2個管中，以此類推直至最后1管，第1～8個EP管中加入的病毒原液量依次為：10、1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6μL。待感染細(xì)胞孔吸取90 μL培養(yǎng)基，分別加入相應(yīng)量的Lv-rAdrb3-shRNA-1、Lv-rAdrb3-shRNA-2、Lv-rAdrb3-shRNA-control病毒原液，37℃、5%CO2培養(yǎng)；48 h后加入100 μL培養(yǎng)基，96 h后，觀察熒光表達(dá)情況。根據(jù)慢病毒感染293T細(xì)胞第7天GFP表達(dá)情況計算病毒滴度。病毒滴度=表達(dá)GFP細(xì)胞數(shù)/病毒原液量（TU/mL）。

Tab.2 The oligonucleotide sequence of rat Adrb3 gene shRNA表2 大鼠Adrb3基因shRNA寡核苷酸序列

1.2.4 慢病毒感染VSMC 目的細(xì)胞VSMC常規(guī)培養(yǎng)，設(shè)置正常對照組（Normal組），空載慢病毒組（Lv-rAdrb3-shRNA-control組），攜帶rAdrb3基因慢病毒干擾載體1組（LvrAdrb3-shRNA-1組），攜帶rAdrb3基因慢病毒干擾載體2組（Lv-rAdrb3-shRNA-2組），實驗前1 d，以3×105個細(xì)胞/mL接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔體積為2.5 mL，37℃、5%CO2培養(yǎng)，感染時細(xì)胞密度達(dá)30%左右。以感染復(fù)數(shù)（Multiplicity of infection，MOI）為 10，Lv-rAdrb3-shRNA-control組、LvrAdrb3-shRNA-1組、Lv-rAdrb3-shRNA-2組分別加入50 μL相應(yīng)慢病毒原液，Normal組未做任何處理。感染24 h后，更換完全培養(yǎng)基，感染72 h后，更換含有嘌呤霉素（5 mg/L）的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；感染第5天，收集細(xì)胞到離心管中，10 000 r/min、4℃離心5 min，棄上清，1 mL PBS洗細(xì)胞2次，棄上清，細(xì)胞在-80℃凍存。

1.2.5 實時定量PCR（Real-time PCR）檢測VSMC細(xì)胞Adrb3 mRNA表達(dá)水平 采用寶生物工程（大連）有限公司的UNIQ-10柱總RNA抽提試劑盒提取VSMC細(xì)胞總RNA，應(yīng)用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。在GenBank上查找相關(guān)基因序列，按照引物設(shè)計原則設(shè)計引物序列，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，引物序列見表3。反應(yīng)體系（20 μL）：2×SYBR Green Mix 10 μL，ROX 0.4 μL，上下游引物（5 μmol/L）各 0.5 μL，ddH2O 7.6 μL，cDNA 1.0 μL。反應(yīng)條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個循環(huán)；熔解曲線分析。采用2-ΔΔCt法計算大鼠Adrb3 mRNA相對表達(dá)量。

Tab.3 The sequences and Tm of Real-time PCR primers表3 Real-time PCR引物序列及退火溫度

1.2.6 Western blot檢測VSMC細(xì)胞Adrb3蛋白表達(dá)水平 提取VSMC細(xì)胞總蛋白，嚴(yán)格按照總蛋白提取試劑盒說明書操作。BCA法測定蛋白濃度，蛋白均一化至終濃度1 g/L。配制10%SDS-聚丙烯酰胺分離膠，5%SDS-聚丙烯酰胺濃縮膠，40 μL蛋白樣本，80 V進(jìn)行電泳，待樣品進(jìn)入分離膠后，電壓調(diào)至100 V，直至溴酚藍(lán)泳至靠近凝膠下緣1.5 cm處，停止電泳；350 mA濕轉(zhuǎn)100 min。5%脫脂奶粉封閉3 h；TBST洗膜3次，每次5 min；用5%脫脂奶粉稀釋一抗（小鼠抗大鼠Adrb3抗體），稀釋比例1∶100，4℃孵育過夜；TBST洗膜3次，每次5 min；用5%脫脂奶粉稀釋二抗（羊抗小鼠HRP-IgG），稀釋比例 1∶10 000，37℃孵育 2 h；TBST洗膜3次，每次5 min。LumiGLO顯色。計算大鼠VSMC中Adrb3蛋白相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒干擾質(zhì)粒Adrb3-shRNA序列測序 測序結(jié)果表明，2個大鼠Adrb3-shRNA序列完全正確，無堿基丟失、錯配，見圖1。

2.2 慢病毒的包裝 熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)，轉(zhuǎn)染后第2天即可見較強(qiáng)的熒光表達(dá)，轉(zhuǎn)染第3天，細(xì)胞產(chǎn)生明顯皺縮變圓，出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)。見圖2、3。

2.3 慢病毒的滴度測定 在10-5μL病毒原液孔中觀察到，Lv-rAdrb3-shRNA-1組、Lv-rAdrb3-shRNA-2組均有2個表達(dá)GFP細(xì)胞，Lv-rAdrb3-shRNA-control組有5個表達(dá)GFP細(xì)胞。最終各慢病毒滴度為：Lv-rAdrb3-shRNA-1組為2×108TU/mL、Lv-rAdrb3-shRNA-2組為2×108TU/mL、Lv-rAdrb3-shRNA-control組為5×108TU/mL。見圖4。

2.4 慢病毒感染大鼠VMSC 慢病毒感染VMSC后，隨MOI值增加，綠色熒光表達(dá)增加，細(xì)胞病變效應(yīng)增強(qiáng)。當(dāng)MOI為10時，感染后第3天能達(dá)到80%以上的感染效率，細(xì)胞貼壁良好，未見明顯病變效應(yīng)。見圖5、6。

2.5 Real-time PCR檢測Adrb3 mRNA的表達(dá)水平 各組VSMC rAdrb3 mRNA相對表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Lv-rAdrb3-shRNA-1組、LvrAdrb3-shRNA-2組Adrb3 mRNA水平為Normal組的 12.82%、34.73%（P＜0.05）；Lv-rAdrb3-shRNA-control組與Normal組相比無明顯抑制作用（P＞0.05）。見圖7。

2.6 Western blot檢測Adrb3蛋白表達(dá)水平 各組大鼠VSMC Adrb3蛋白相對表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Lv-rAdrb3-shRNA-1組、Lv-rAdrb3-shRNA-2組Adrb3蛋白水平為Normal組的14.43%、29.96%（P＜0.05）；Lv-rAdrb3-shRNA-control組與Normal組相比無明顯抑制作用（P＞0.05）。見圖8。

Fig.1 Adrb3-shRNA sequencing圖1 慢病毒干擾質(zhì)粒Adrb3-shRNA序列測序

Fig.2 The expression of GFP in 293T cells 2 days after transfection with Adrb3-shRNA plasmid observed by fluorescence microscopy(×40)圖2 熒光顯微鏡觀察慢病毒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞第2天GFP表達(dá)（×40）

Fig.3 The cell morphology of 293T cells 3 days after transfection with Adrb3-shRNA plasmid(×200)圖3 慢病毒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞第3天細(xì)胞形態(tài)（×200）

Fig.4 The expression of GFP in 293T cells 7 days after infection with Lv-rAdrb3-shRNA observed by fluorescence microscopy(×200)圖4 慢病毒滴度測定-熒光顯微鏡觀察慢病毒感染293T細(xì)胞第7天GFP表達(dá)（×200）

Fig.5 The expression of GFP in rat VSMC cells 7 days after infection with Lv-rAdrb3-shRNA observed by fluorescence microscopy(×200)圖5 熒光顯微鏡觀察慢病毒感染VSMC第7天GFP表達(dá)（×200）

Fig.6 The cell morphology of rat VSMC cells 7 days after infection with Lv-rAdrb3-shRNA(×200)圖6 慢病毒感染VSMC第7天細(xì)胞形態(tài)（×200）

Fig.7 Adrb3 mRNA expression of rat VSMC infected with Lv-rAdrb3-shRNA圖7 慢病毒感染大鼠VSMC Adrb3 mRNA表達(dá)

Fig.8 Expressions of Adrb3 protein of rat VSMC infected with LvrAdrb3-shRNA圖8 慢病毒感染大鼠VSMC Adrb3蛋白表達(dá)

3 討論

β3-AR與心力衰竭的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，闡明β3-AR在心力衰竭中的具體作用機(jī)制，有望成為治療心力衰竭的一個新靶點。研究證實β3-AR過表達(dá)，導(dǎo)致持續(xù)負(fù)性肌力作用可能是心力衰竭發(fā)生的基礎(chǔ)。選擇性β3-AR受體拮抗劑能夠改善心力衰竭大鼠的心功能［4］。心肌細(xì)胞特異性過表達(dá)β3-AR轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大，心肌收縮幅度下降［5］。降低β3-AR受體活性可能是心力衰竭的一種治療方法。然而，也有研究證實心肌細(xì)胞特異性高表達(dá)β3-AR轉(zhuǎn)基因小鼠在異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心衰模型中較野生型小鼠心功能改善，左室肥厚減輕［6］?？梢姦?-AR在心力衰竭中到底發(fā)揮何種作用尚未闡明。

RNAi是生物進(jìn)化過程中出現(xiàn)的一種分子生物學(xué)上由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，通過阻礙特定基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯達(dá)到抑制該基因表達(dá)的目的。隨著RNAi技術(shù)的不斷完善成熟，目前該技術(shù)已在疾病的診斷和治療方面發(fā)揮著巨大的作用［7-8］。RNAi的關(guān)鍵因素之一就是選擇合適的載體使雙鏈RNA進(jìn)入宿主細(xì)胞。常用的載體系統(tǒng)有病毒載體和非病毒載體。而病毒載體具有高效、低毒、大容量等一系列優(yōu)點，是近年來研究的熱點。主要包括：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體及腺相關(guān)病毒載體等［9］。慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，慢病毒載體具有可插入外源基因容量大，對于分裂和不分裂細(xì)胞均有感染性，能夠長期穩(wěn)定表達(dá)病毒基因等優(yōu)點而得到廣泛應(yīng)用。慢病毒介導(dǎo)的RNAi可達(dá)到持續(xù)而穩(wěn)定的目的基因沉默效應(yīng)。本研究應(yīng)用第三代慢病毒載體系統(tǒng)，由GV248、pHelper 1.0和pHelper 2.0這3個質(zhì)粒共同組成。GV248質(zhì)粒中含有HIV的基本元件5′LTR和3′LTR。pHelper 1.0質(zhì)粒含有HIV病毒的gag基因，編碼主要的結(jié)構(gòu)蛋白；pol基因，編碼病毒特異性酶；rev基因，編碼調(diào)節(jié)gag和pol基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子。pHelper 2.0含有單純皰疹病毒來源的VSV-G基因，提供病毒包裝所需要的包膜蛋白。該載體系統(tǒng)安全性高，對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有較強(qiáng)的感染能力，并可在體內(nèi)較長期表達(dá)［10］。

目前尚未見應(yīng)用慢病毒構(gòu)建β3-AR干擾載體的相關(guān)報道。本研究設(shè)計2個shRNA寡核苷酸序列，應(yīng)用慢病毒載體系統(tǒng)成功構(gòu)建2個攜帶rAdrb3基因的慢病毒干擾載體及對照慢病毒，滴度均達(dá)到108TU/mL，并從基因、蛋白水平檢測慢病毒對大鼠VSMC Adrb3表達(dá)的影響，Real-time PCR結(jié)果顯示，Lv-rAdrb3-shRNA-1及Lv-rAdrb3-shRNA-2均可顯著抑制Adrb3 mRNA表達(dá)，沉默效率為87.18%、65.27%；Western blot結(jié)果顯示，Lv-rAdrb3-shRNA-1、Lv-rAdrb3-shRNA-2均可顯著抑制Adrb3蛋白表達(dá)，沉默效率為85.57%、70.04%。

綜上所述，本研究應(yīng)用第三代慢病毒載體系統(tǒng)成功構(gòu)建rAdrb3基因重組慢病毒干擾載體，其中LV-rAdrb3-shRNA-1對靶基因的抑制效率達(dá)85%以上，滴度達(dá)2×108TU/mL，LV-rAdrb3-shRNA-1能明顯下調(diào)大鼠VSMC Adrb3的表達(dá)水平，為進(jìn)一步研究Adrb3提供了有效的實驗工具。