莫毅， 李云娟， 牛向麗， 徐亦辰， 公方強， 王娟， 謝丹尼， 岳桂華， 梁方方

廣西壯族自治區(qū)計劃生育研究中心 1科教科, 2婦科， 3生殖醫(yī)學科， 4主任辦公室(廣西南寧 530021)； 5廣西衛(wèi)生職業(yè)技術學院院辦(廣西南寧 530023)； 6廣西大學動物科學技術學院遺傳育種實驗室(廣西南寧 530001)

2007年國際聯(lián)合研究項目人類微生物組計劃 (The Human Microbiome Project，HMP) 和人類腸道元基因 (或宏基因) 組學計劃 (Metagenomics of The Human Intestinal Tract，MetaHIT) 正式啟動，標志著腸道宏基因組研究的時代已經(jīng)到來[1]。隨著項目的推進，越來越多的科研結(jié)果表明腸道菌群在維持人體健康穩(wěn)態(tài)中起至關重要的作用，而這種作用主要依賴于菌群種類的多樣性、菌群結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和微生態(tài)的平衡性。各種原因?qū)е碌哪c道菌群穩(wěn)態(tài)的失衡都會影響到人的健康，引發(fā)相關的疾病，例如肥胖[2-3]、糖尿病[4-5]、非酒精性脂肪肝[6]、強直性脊柱炎[7]、炎癥性腸病[8]、腫瘤[9-11]等。卵巢過度刺激綜合征(ovarian hyperstimulation syndrome, OHSS)是輔助生殖技術應用領域常見的醫(yī)源性并發(fā)癥，其臨床表現(xiàn)為胃腸道不適、腹腔積液、胸腔積液、少尿、卵巢增大等，嚴重可危及生命。目前，對于OHSS腸道菌群變化的相關研究報道十分稀少。本研究擬通過高通量測序技術對卵巢過度刺激組、超促排卵組和生理鹽水組大鼠盲腸前段內(nèi)容物菌群16S rDNA 的V3～V4區(qū)域的基因序列進行比對，初步探討輔助生殖技術中外源激素應用對于大鼠腸道菌群的分布和豐度的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 孕馬血清促性腺激素(PMSG)和人絨毛膜促性腺激素(HCG)購于北京索萊寶科技有限公司；剛斷奶的雌性SD大鼠，22日齡，購于廣西醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2 動物分組和用藥方案 于2017年11月9—13日在廣西大學動物科學技術學院遺傳育種實驗室動物房飼養(yǎng)，將10只SD大鼠隨機分為3組: 卵巢過度刺激組4只、超促排卵組3只和生理鹽水對照組3只。

用藥方案如下：生理鹽水對照組腹腔皮下注射生理鹽水0.2 mL/d，連續(xù)5 d；超促排卵組腹腔皮下注射10 IU PMSG/d，連續(xù)4 d，第5天注射10 IU HCG；卵巢過度刺激組腹腔皮下注射50 IU PMSG/d，連續(xù)4 d，第5天注射25 IU HCG。注射HCG 48 h后，使用苯巴比妥鈉麻醉開腹腔收集盲腸前段內(nèi)容物，液氮速凍，-80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 高通量測序 于2017年11月24日將收集好的盲腸前段內(nèi)容物交由生工生物工程(上海)有限公司進行腸道菌群宏基因組DNA提取和16s rDNA V3-V4可變區(qū)域的高通量測序。

1.4 生物信息學分析 通過生物學統(tǒng)計軟件SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，利用One Way ANOVA開展樣本組間差異的顯著性檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。生物信息學分析主要包括了操作單元(operational taxonomicunits，OTU)聚類分析、菌群多樣性分析、菌群分類學分析和菌群群落結(jié)構(gòu)分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腸道內(nèi)容物菌群的測序質(zhì)量 大鼠盲腸內(nèi)容物細菌16S rDNA 基因經(jīng)抽提純化、PCR 擴增后進行高通量測序，菌群多樣性統(tǒng)計結(jié)果見表1。參試的3組大鼠腸道內(nèi)容物菌群的測序覆蓋指數(shù)均達到0.993以上，說明樣品中序列未被測到的概率較低,高通量測序結(jié)果可用于后續(xù)的分析。

組別測序量操作單元測序覆蓋度生理鹽水對照組45 018±4 558748±360.994±0.001超促排卵組37 257±14 851617±320.993±0.002卵巢過度刺激組37 754±7 956745±910.993±0.001

對參試各樣品進行a指數(shù)稀疏曲線的繪制(圖1)。各樣品的稀疏曲線在序列數(shù)目為200左右時出現(xiàn)拐點，后續(xù)隨著測序深度不斷增加；當序列數(shù)達2 000條時，曲線趨于平緩，并逐步進入平臺期。各樣品的稀疏曲線證實測序量足夠，覆蓋所有細菌物種，其豐富程度足以滿足后續(xù)的分析。

圖1 10份腸道內(nèi)容物樣品的稀疏曲線

2.2 大鼠腸道內(nèi)容物多樣性統(tǒng)計分析 參試的3 組大鼠腸道內(nèi)容物菌群在97%相似性水平的多樣性指數(shù)見表2。其中ACE指數(shù)用于對菌群豐度進行的評估，表2數(shù)據(jù)表明，超促排卵和卵巢過度刺激組腸道內(nèi)容物菌群較生理鹽水對照組豐富性高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。而Simpson和Shannon指數(shù)用于對菌群微生物多樣性進行的評估值，Simpson指數(shù)數(shù)值越大，表明群落多樣性越低，Shannon值越大，表明群落多樣性越高，表2數(shù)據(jù)表明，超促排卵組和卵巢過度刺激模型組大鼠腸道內(nèi)容物菌群較生理鹽水對照組的多樣性高。

組別Shannon指數(shù)ACE指數(shù)Simpson指數(shù)生理鹽水對照組2.92±0.581 050.18±64.920.15±0.075超促排卵組3.20±0.601 053.51±92.940.12±0.057卵巢過度刺激組3.54±0.501 082.82±92.260.10±0.053

2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)分析 在門(Phylum)的水平上，參試3組樣品的微生物群落構(gòu)成及其相對豐度如圖2所示。所有樣品均包含厚壁菌門(Firmicutes)、 疣微菌門(Verrucomicrobia)和擬桿菌門(Bacteroidetes)3個主要的門,占腸道內(nèi)含物菌群含量的97.38以上。3個主要菌門中厚壁菌門(Firmicutes)在腸道菌群含量最高，分別為生理鹽水對照組74.12%，超促排卵組63.76%，卵巢過度刺激組76.56%；Verrucomicrobia菌群含量比例隨著激素用量的增加而遞減，分別為生理鹽水對照組21.57%，超促排卵組16.28%，卵巢過度刺激組8.03%；而Bacteroidetes在生理鹽水對照組中含量比例最低3.10%，而超促排卵和卵巢過度刺激組比例相對較高，分別為17.35%和13.55%。

此外，3組腸道內(nèi)容物中還含有變形菌門(Proteobacteria)，放線菌門(Actinobacteria)和無壁菌門(Tenericuters)及其他一些門的微生物，占菌群含量相對較低<2.62%。其中，變形菌門(Proteobacteria)含量隨著激素用量的提高而增加，生理鹽水對照組0.33%，超促排卵組1.02%，卵巢過度刺激組1.22%；Actinobacteria含量則反而遞減，生理鹽水對照組0.81%，超促排卵組0.71%，卵巢過度刺激組0.42%。見圖2。

在屬(Genus)的水平上，3組樣品相對豐度較高的有乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、艾克曼菌屬(Akkermansia)、腸球菌(Enterococcus)和梭狀芽胞桿菌XlVa(Clostridium XlVa)4個屬，占腸道內(nèi)含物菌群含量的54.70%以上。

與生理鹽水對照組相比，隨著外源激素用量增加超促排卵和卵巢過度刺激組腸道菌群微生物組成復雜度有所提高，且各優(yōu)勢菌群含量比例亦發(fā)生相應變化：乳酸桿菌屬(Lactobacillus)在3組腸道菌群中占比最高，但其數(shù)量改變未呈現(xiàn)出規(guī)律性；艾克曼菌屬(Akkermansia)呈現(xiàn)遞減趨勢(生理鹽水對照組21.57%，超促排卵組16.28%和卵巢過度刺激組8.03%)；而Enterococcus(生理鹽水對照組8.76%，超促排卵組14.43%和卵巢過度刺激組17.02%)、未定義分類菌(Unclassified)(生理鹽水對照組4.05%，超促排卵組5.28%和卵巢過度刺激組10.14%)和Barnesiella(生理鹽水對照組1.85%，超促排卵組7.78%和卵巢過度刺激組7.79%)卻呈現(xiàn)遞增趨勢。此外，Clostridium XlVa(生理鹽水對照組8.45%，超促排卵組6.34%和卵巢過度刺激組6.76%)、Romboutsia(生理鹽水對照組8.64%，超促排卵組0.02%和卵巢過度刺激組0.16%)和Acetatifactor(生理鹽水對照組4.48%，超促排卵組0.26%和卵巢過度刺激組3.35%)含量也有較大降幅。見圖3。

圖2大鼠腸道菌群在門水平上的分布

圖3 大鼠糞便菌群在屬水平上的分布

3 討論

動物腸道菌群中的有益微生物與有害微生物種類及數(shù)量長期處于一種動態(tài)平衡狀態(tài)中，腸道微生態(tài)才能得以維持[4]。腸道正常菌群具有促進營養(yǎng)消化與吸收、抵御外來病原菌的入侵、產(chǎn)生重要代謝產(chǎn)物和生物活性成分等不可替代的作用[12]。若正常菌群的種類、數(shù)量和比例發(fā)生異常變化，則腸道菌群的平衡就會失調(diào)而對宿主腸道功能會產(chǎn)生不良影響[6-9]。在本研究中腸道菌群屬水平，與生理鹽水對照組相比較，隨著外源激素用量的增加超促排卵組和卵巢過度刺激組的Shannon指數(shù)和ACE指數(shù)逐漸提高，而Simpson指數(shù)逐漸下降，說明在外源激素刺激下大鼠腸道菌群多樣性的隨之提高。3組大鼠的腸道微生物優(yōu)勢菌群的種類未見明顯改變，以Firmicutes、 Verrucomicrobia和Bacteroidetes為主要菌門，但各菌群間的比例均發(fā)生了一定改變。此結(jié)果與劉冬戀等[13]的研究結(jié)果相似，腸道內(nèi)微生物種類繁多， 其中包括Firmicutes、Bacteroides、變形菌門(Proteobacteria)和Verrucomicrobia等6個優(yōu)勢菌門，說明短時間的外源激素刺激并未改變大鼠腸道菌群的優(yōu)勢菌門。

外源激素的使用對大鼠腸道微生物的優(yōu)勢菌群會產(chǎn)生一定的影響。其中Akkermansia定植于動物腸道黏液層，特異性利用腸道黏蛋白進行生長，產(chǎn)生寡糖和短鏈脂肪酸，在宿主的免疫刺激和代謝信號傳導過程中發(fā)揮重要作用；同時，黏蛋白降解刺激機體產(chǎn)生更多新的黏蛋白，使黏液層增厚，保護腸上皮細胞免受微生物的侵襲；促進宿主固有免疫和獲得性免疫系統(tǒng)的發(fā)育，具有抗炎癥作用。本研究中，Akkermansia的相對豐度隨著外源激素用量增加呈現(xiàn)遞減趨勢，降低了其在大鼠腸道微生態(tài)中的有益作用，其相對豐度與炎性腸病、盲腸炎、肥胖和青少年自閉癥等疾病呈負相關的結(jié)果[13]相似。

與Akkermansia的狀態(tài)相反，大鼠腸道菌群中Enterococcus、Barnesiella和未定義分類菌等相對豐度隨外源激素用量的提高呈現(xiàn)上升趨勢?？赡茉蚴撬拗鲬顟B(tài)下，宿主與腸道菌群間的共生狀態(tài)失衡，導致腸道內(nèi)的致病菌增殖，影響宿主的健康狀態(tài)。腸球菌是動物體內(nèi)常見的共生菌，當宿主免疫機能下降時，會離開其正常寄居部位，并在特定組織局部聚集，然后黏附于宿主細胞的胞外矩陣蛋白，分泌細胞溶解素、明膠酶等毒力因子侵襲破壞宿主組織細胞，引發(fā)宿主的非特異性免疫應答，進而影響宿主感染性疾病的發(fā)生發(fā)展。研究證實腸球菌不僅可引起尿路感染、皮膚軟組織感染，還可引起危及生命的腹腔感染、敗血癥、心內(nèi)膜炎和腦膜炎等[14-15]。Barnesiella菌能夠產(chǎn)生內(nèi)毒素，而后者會損害腸道屏障、引起人體代謝和免疫失衡等不良反應[3,13]。

OHSS是輔助生殖技術應用領域中一個較為普遍的醫(yī)源性疾病，外源激素的應用是其發(fā)病的主要誘因。本研究表明外源激素的應用，改變了大鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)；隨著激素劑量的增加，對于機體有益的菌群的相對豐度有所下降，而致病菌和未定義菌群的相對豐度則有所提高，進而誘發(fā)OHSS。特定菌種的發(fā)現(xiàn)，為日后靶向調(diào)節(jié)腸道菌群用以輔助OHSS治療提供實驗數(shù)據(jù)。但本研究每組的個體樣品數(shù)量少，缺乏代表性作用，未來有可能時應行大樣品高通量測序檢測。