莫毅， 李云娟， 牛向麗， 徐亦辰， 公方強(qiáng)， 王娟， 謝丹尼， 岳桂華， 梁方方

廣西壯族自治區(qū)計(jì)劃生育研究中心 1科教科, 2婦科， 3生殖醫(yī)學(xué)科， 4主任辦公室(廣西南寧 530021)； 5廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院院辦(廣西南寧 530023)； 6廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院遺傳育種實(shí)驗(yàn)室(廣西南寧 530001)

2007年國(guó)際聯(lián)合研究項(xiàng)目人類微生物組計(jì)劃 (The Human Microbiome Project，HMP) 和人類腸道元基因 (或宏基因) 組學(xué)計(jì)劃 (Metagenomics of The Human Intestinal Tract，MetaHIT) 正式啟動(dòng)，標(biāo)志著腸道宏基因組研究的時(shí)代已經(jīng)到來(lái)[1]。隨著項(xiàng)目的推進(jìn)，越來(lái)越多的科研結(jié)果表明腸道菌群在維持人體健康穩(wěn)態(tài)中起至關(guān)重要的作用，而這種作用主要依賴于菌群種類的多樣性、菌群結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和微生態(tài)的平衡性。各種原因?qū)е碌哪c道菌群穩(wěn)態(tài)的失衡都會(huì)影響到人的健康，引發(fā)相關(guān)的疾病，例如肥胖[2-3]、糖尿病[4-5]、非酒精性脂肪肝[6]、強(qiáng)直性脊柱炎[7]、炎癥性腸病[8]、腫瘤[9-11]等。卵巢過(guò)度刺激綜合征(ovarian hyperstimulation syndrome, OHSS)是輔助生殖技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域常見的醫(yī)源性并發(fā)癥，其臨床表現(xiàn)為胃腸道不適、腹腔積液、胸腔積液、少尿、卵巢增大等，嚴(yán)重可危及生命。目前，對(duì)于OHSS腸道菌群變化的相關(guān)研究報(bào)道十分稀少。本研究擬通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)卵巢過(guò)度刺激組、超促排卵組和生理鹽水組大鼠盲腸前段內(nèi)容物菌群16S rDNA 的V3～V4區(qū)域的基因序列進(jìn)行比對(duì)，初步探討輔助生殖技術(shù)中外源激素應(yīng)用對(duì)于大鼠腸道菌群的分布和豐度的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 孕馬血清促性腺激素(PMSG)和人絨毛膜促性腺激素(HCG)購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；剛斷奶的雌性SD大鼠，22日齡，購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 動(dòng)物分組和用藥方案 于2017年11月9—13日在廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院遺傳育種實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房飼養(yǎng)，將10只SD大鼠隨機(jī)分為3組: 卵巢過(guò)度刺激組4只、超促排卵組3只和生理鹽水對(duì)照組3只。

用藥方案如下：生理鹽水對(duì)照組腹腔皮下注射生理鹽水0.2 mL/d，連續(xù)5 d；超促排卵組腹腔皮下注射10 IU PMSG/d，連續(xù)4 d，第5天注射10 IU HCG；卵巢過(guò)度刺激組腹腔皮下注射50 IU PMSG/d，連續(xù)4 d，第5天注射25 IU HCG。注射HCG 48 h后，使用苯巴比妥鈉麻醉開腹腔收集盲腸前段內(nèi)容物，液氮速凍，-80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 高通量測(cè)序 于2017年11月24日將收集好的盲腸前段內(nèi)容物交由生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行腸道菌群宏基因組DNA提取和16s rDNA V3-V4可變區(qū)域的高通量測(cè)序。

1.4 生物信息學(xué)分析 通過(guò)生物學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，利用One Way ANOVA開展樣本組間差異的顯著性檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。生物信息學(xué)分析主要包括了操作單元(operational taxonomicunits，OTU)聚類分析、菌群多樣性分析、菌群分類學(xué)分析和菌群群落結(jié)構(gòu)分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腸道內(nèi)容物菌群的測(cè)序質(zhì)量 大鼠盲腸內(nèi)容物細(xì)菌16S rDNA 基因經(jīng)抽提純化、PCR 擴(kuò)增后進(jìn)行高通量測(cè)序，菌群多樣性統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。參試的3組大鼠腸道內(nèi)容物菌群的測(cè)序覆蓋指數(shù)均達(dá)到0.993以上，說(shuō)明樣品中序列未被測(cè)到的概率較低,高通量測(cè)序結(jié)果可用于后續(xù)的分析。

組別測(cè)序量操作單元測(cè)序覆蓋度生理鹽水對(duì)照組45 018±4 558748±360.994±0.001超促排卵組37 257±14 851617±320.993±0.002卵巢過(guò)度刺激組37 754±7 956745±910.993±0.001

對(duì)參試各樣品進(jìn)行a指數(shù)稀疏曲線的繪制(圖1)。各樣品的稀疏曲線在序列數(shù)目為200左右時(shí)出現(xiàn)拐點(diǎn)，后續(xù)隨著測(cè)序深度不斷增加；當(dāng)序列數(shù)達(dá)2 000條時(shí)，曲線趨于平緩，并逐步進(jìn)入平臺(tái)期。各樣品的稀疏曲線證實(shí)測(cè)序量足夠，覆蓋所有細(xì)菌物種，其豐富程度足以滿足后續(xù)的分析。

圖1 10份腸道內(nèi)容物樣品的稀疏曲線

2.2 大鼠腸道內(nèi)容物多樣性統(tǒng)計(jì)分析 參試的3 組大鼠腸道內(nèi)容物菌群在97%相似性水平的多樣性指數(shù)見表2。其中ACE指數(shù)用于對(duì)菌群豐度進(jìn)行的評(píng)估，表2數(shù)據(jù)表明，超促排卵和卵巢過(guò)度刺激組腸道內(nèi)容物菌群較生理鹽水對(duì)照組豐富性高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而Simpson和Shannon指數(shù)用于對(duì)菌群微生物多樣性進(jìn)行的評(píng)估值，Simpson指數(shù)數(shù)值越大，表明群落多樣性越低，Shannon值越大，表明群落多樣性越高，表2數(shù)據(jù)表明，超促排卵組和卵巢過(guò)度刺激模型組大鼠腸道內(nèi)容物菌群較生理鹽水對(duì)照組的多樣性高。

組別Shannon指數(shù)ACE指數(shù)Simpson指數(shù)生理鹽水對(duì)照組2.92±0.581 050.18±64.920.15±0.075超促排卵組3.20±0.601 053.51±92.940.12±0.057卵巢過(guò)度刺激組3.54±0.501 082.82±92.260.10±0.053

2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)分析 在門(Phylum)的水平上，參試3組樣品的微生物群落構(gòu)成及其相對(duì)豐度如圖2所示。所有樣品均包含厚壁菌門(Firmicutes)、 疣微菌門(Verrucomicrobia)和擬桿菌門(Bacteroidetes)3個(gè)主要的門,占腸道內(nèi)含物菌群含量的97.38以上。3個(gè)主要菌門中厚壁菌門(Firmicutes)在腸道菌群含量最高，分別為生理鹽水對(duì)照組74.12%，超促排卵組63.76%，卵巢過(guò)度刺激組76.56%；Verrucomicrobia菌群含量比例隨著激素用量的增加而遞減，分別為生理鹽水對(duì)照組21.57%，超促排卵組16.28%，卵巢過(guò)度刺激組8.03%；而Bacteroidetes在生理鹽水對(duì)照組中含量比例最低3.10%，而超促排卵和卵巢過(guò)度刺激組比例相對(duì)較高，分別為17.35%和13.55%。

此外，3組腸道內(nèi)容物中還含有變形菌門(Proteobacteria)，放線菌門(Actinobacteria)和無(wú)壁菌門(Tenericuters)及其他一些門的微生物，占菌群含量相對(duì)較低<2.62%。其中，變形菌門(Proteobacteria)含量隨著激素用量的提高而增加，生理鹽水對(duì)照組0.33%，超促排卵組1.02%，卵巢過(guò)度刺激組1.22%；Actinobacteria含量則反而遞減，生理鹽水對(duì)照組0.81%，超促排卵組0.71%，卵巢過(guò)度刺激組0.42%。見圖2。

在屬(Genus)的水平上，3組樣品相對(duì)豐度較高的有乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、艾克曼菌屬(Akkermansia)、腸球菌(Enterococcus)和梭狀芽胞桿菌XlVa(Clostridium XlVa)4個(gè)屬，占腸道內(nèi)含物菌群含量的54.70%以上。

與生理鹽水對(duì)照組相比，隨著外源激素用量增加超促排卵和卵巢過(guò)度刺激組腸道菌群微生物組成復(fù)雜度有所提高，且各優(yōu)勢(shì)菌群含量比例亦發(fā)生相應(yīng)變化：乳酸桿菌屬(Lactobacillus)在3組腸道菌群中占比最高，但其數(shù)量改變未呈現(xiàn)出規(guī)律性；艾克曼菌屬(Akkermansia)呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)(生理鹽水對(duì)照組21.57%，超促排卵組16.28%和卵巢過(guò)度刺激組8.03%)；而Enterococcus(生理鹽水對(duì)照組8.76%，超促排卵組14.43%和卵巢過(guò)度刺激組17.02%)、未定義分類菌(Unclassified)(生理鹽水對(duì)照組4.05%，超促排卵組5.28%和卵巢過(guò)度刺激組10.14%)和Barnesiella(生理鹽水對(duì)照組1.85%，超促排卵組7.78%和卵巢過(guò)度刺激組7.79%)卻呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)。此外，Clostridium XlVa(生理鹽水對(duì)照組8.45%，超促排卵組6.34%和卵巢過(guò)度刺激組6.76%)、Romboutsia(生理鹽水對(duì)照組8.64%，超促排卵組0.02%和卵巢過(guò)度刺激組0.16%)和Acetatifactor(生理鹽水對(duì)照組4.48%，超促排卵組0.26%和卵巢過(guò)度刺激組3.35%)含量也有較大降幅。見圖3。

圖2大鼠腸道菌群在門水平上的分布

圖3 大鼠糞便菌群在屬水平上的分布

3 討論

動(dòng)物腸道菌群中的有益微生物與有害微生物種類及數(shù)量長(zhǎng)期處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)中，腸道微生態(tài)才能得以維持[4]。腸道正常菌群具有促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)消化與吸收、抵御外來(lái)病原菌的入侵、產(chǎn)生重要代謝產(chǎn)物和生物活性成分等不可替代的作用[12]。若正常菌群的種類、數(shù)量和比例發(fā)生異常變化，則腸道菌群的平衡就會(huì)失調(diào)而對(duì)宿主腸道功能會(huì)產(chǎn)生不良影響[6-9]。在本研究中腸道菌群屬水平，與生理鹽水對(duì)照組相比較，隨著外源激素用量的增加超促排卵組和卵巢過(guò)度刺激組的Shannon指數(shù)和ACE指數(shù)逐漸提高，而Simpson指數(shù)逐漸下降，說(shuō)明在外源激素刺激下大鼠腸道菌群多樣性的隨之提高。3組大鼠的腸道微生物優(yōu)勢(shì)菌群的種類未見明顯改變，以Firmicutes、 Verrucomicrobia和Bacteroidetes為主要菌門，但各菌群間的比例均發(fā)生了一定改變。此結(jié)果與劉冬戀等[13]的研究結(jié)果相似，腸道內(nèi)微生物種類繁多， 其中包括Firmicutes、Bacteroides、變形菌門(Proteobacteria)和Verrucomicrobia等6個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門，說(shuō)明短時(shí)間的外源激素刺激并未改變大鼠腸道菌群的優(yōu)勢(shì)菌門。

外源激素的使用對(duì)大鼠腸道微生物的優(yōu)勢(shì)菌群會(huì)產(chǎn)生一定的影響。其中Akkermansia定植于動(dòng)物腸道黏液層，特異性利用腸道黏蛋白進(jìn)行生長(zhǎng)，產(chǎn)生寡糖和短鏈脂肪酸，在宿主的免疫刺激和代謝信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮重要作用；同時(shí)，黏蛋白降解刺激機(jī)體產(chǎn)生更多新的黏蛋白，使黏液層增厚，保護(hù)腸上皮細(xì)胞免受微生物的侵襲；促進(jìn)宿主固有免疫和獲得性免疫系統(tǒng)的發(fā)育，具有抗炎癥作用。本研究中，Akkermansia的相對(duì)豐度隨著外源激素用量增加呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)，降低了其在大鼠腸道微生態(tài)中的有益作用，其相對(duì)豐度與炎性腸病、盲腸炎、肥胖和青少年自閉癥等疾病呈負(fù)相關(guān)的結(jié)果[13]相似。

與Akkermansia的狀態(tài)相反，大鼠腸道菌群中Enterococcus、Barnesiella和未定義分類菌等相對(duì)豐度隨外源激素用量的提高呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。可能原因是宿主應(yīng)激狀態(tài)下，宿主與腸道菌群間的共生狀態(tài)失衡，導(dǎo)致腸道內(nèi)的致病菌增殖，影響宿主的健康狀態(tài)。腸球菌是動(dòng)物體內(nèi)常見的共生菌，當(dāng)宿主免疫機(jī)能下降時(shí)，會(huì)離開其正常寄居部位，并在特定組織局部聚集，然后黏附于宿主細(xì)胞的胞外矩陣蛋白，分泌細(xì)胞溶解素、明膠酶等毒力因子侵襲破壞宿主組織細(xì)胞，引發(fā)宿主的非特異性免疫應(yīng)答，進(jìn)而影響宿主感染性疾病的發(fā)生發(fā)展。研究證實(shí)腸球菌不僅可引起尿路感染、皮膚軟組織感染，還可引起危及生命的腹腔感染、敗血癥、心內(nèi)膜炎和腦膜炎等[14-15]。Barnesiella菌能夠產(chǎn)生內(nèi)毒素，而后者會(huì)損害腸道屏障、引起人體代謝和免疫失衡等不良反應(yīng)[3,13]。

OHSS是輔助生殖技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域中一個(gè)較為普遍的醫(yī)源性疾病，外源激素的應(yīng)用是其發(fā)病的主要誘因。本研究表明外源激素的應(yīng)用，改變了大鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)；隨著激素劑量的增加，對(duì)于機(jī)體有益的菌群的相對(duì)豐度有所下降，而致病菌和未定義菌群的相對(duì)豐度則有所提高，進(jìn)而誘發(fā)OHSS。特定菌種的發(fā)現(xiàn)，為日后靶向調(diào)節(jié)腸道菌群用以輔助OHSS治療提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。但本研究每組的個(gè)體樣品數(shù)量少，缺乏代表性作用，未來(lái)有可能時(shí)應(yīng)行大樣品高通量測(cè)序檢測(cè)。