李羽禾 何 玥 吳玉梅

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦瘤科，北京 100006

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，發(fā)生率及死亡率高，約有60%～80%的乳腺癌患者雌激素受體和/或孕激素受體陽(yáng)性［1］，他莫昔芬（TAM）是雌激素受體和/或孕激素受體陽(yáng)性的絕經(jīng)前乳腺癌患者的一線輔助治療用藥［2］，但長(zhǎng)期服用可增加子宮內(nèi)膜病變及癌變風(fēng)險(xiǎn)，但發(fā)生機(jī)制尚不清楚。PTEN（第10 號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因）是子宮內(nèi)膜癌中突變率最高的基因，被公認(rèn)為是子宮內(nèi)膜的“看家基因”［3］。故本研究選取乳腺癌術(shù)后服用TAM 患者，以Ⅰ型子宮內(nèi)膜腺癌患者及正常子宮內(nèi)膜為對(duì)照，采用免疫組化法檢測(cè)PTEN 蛋白的表達(dá)。旨在探討PTEN 是否參與乳腺癌術(shù)后服用TAM 相關(guān)的子宮內(nèi)膜病變。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018 年1～12 月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）隨診的乳腺癌術(shù)后服用TAM（20 mg/d）的患者56 例。其中因陰道不規(guī)則出血或定期隨訪B 超提示子宮內(nèi)膜異常增厚，住院行宮腔鏡診刮術(shù)獲得子宮內(nèi)膜標(biāo)本的患者10 例，擬定為乳腺癌術(shù)后服用TAM 組；因“宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅲ級(jí)或子宮肌瘤”行全子宮切除術(shù)的正常子宮內(nèi)膜患者10 例，擬定為正常子宮內(nèi)膜組；初治的Ⅰ型子宮內(nèi)膜腺癌患者10 例，擬定為子宮內(nèi)膜癌組。其中正常子宮內(nèi)膜組及子宮內(nèi)膜癌組為對(duì)照組。三組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，見表1。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①乳腺癌術(shù)后服用TAM 超過6 個(gè)月且患者病例資料完整；②患者知情同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①6 個(gè)月內(nèi)曾服用其他內(nèi)分泌治療藥物；②合并其他惡性腫瘤；③曾行放化療及免疫治療者。

1.2 方法

1.2.1 試劑 他莫昔芬（上海華聯(lián)制藥公司，批號(hào)：H10910072），兔抗人PTEN 多克隆抗體（美國(guó)Abcam公司，貨號(hào)：ab31392）。S-P 譜超敏試劑盒（邁新生物有限公司，批號(hào)：1806073825），二氨基聯(lián)苯胺（DAB）酶底物顯色劑（邁新生物有限公司，批號(hào)：180508441C），使用XDS-100 倒置熒光顯微鏡（上海蔡康光學(xué)儀器有限公司）進(jìn)行觀察。

表1 三組患者的一般資料比較

1.2.2 標(biāo)本制作 乳腺癌術(shù)后服用TAM 組、正常子宮內(nèi)膜組及子宮內(nèi)膜癌組中PTEN 蛋白在子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)情況采用免疫組化染色法測(cè)定。子宮內(nèi)膜組織離體后放入甲醛溶液（同和生物，批號(hào)：18032401）固定，石蠟包埋、切片、常規(guī)脫蠟、水化、孵育、抗原修復(fù)，連續(xù)切片，切片厚度4 μm，每例切片6 張。隨后按照免疫組化試劑盒所示步驟進(jìn)行，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，封片。

1.3 觀察指標(biāo)

PTEN 蛋白陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色或棕褐色顆粒，主要位于細(xì)胞質(zhì)中，偶可見于細(xì)胞膜和/或細(xì)胞核。每例均隨機(jī)觀察5 個(gè)高倍視野。PTEN 蛋白定量表達(dá)采用半定量積分法；定性表達(dá)采用主觀分級(jí)記錄，染色強(qiáng)度評(píng)分：陰性為0 分，弱強(qiáng)度為1 分，中等強(qiáng)度為2 分，高強(qiáng)度為3 分；染色陽(yáng)性率評(píng)分：陽(yáng)性率≤5%為0 分，＞5%～25%為1 分，＞25%～50%為2 分，＞50%～75%為3 分，＞75%～100%為4 分?？傇u(píng)分=染色強(qiáng)度評(píng)分×染色陽(yáng)性率評(píng)分，0 分為陰性（-），1～4 分為弱陽(yáng)性（+），5～8 分為中度陽(yáng)性（++），9～12 分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，采用Fisher 精確概率法；符合正態(tài)分布計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料改用中位數(shù)（M）和四分位數(shù)（P25，P75）表示，兩組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)及Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTEN 蛋白染色情況

三組PTEN 蛋白主要位于腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。正常子宮內(nèi)膜組，細(xì)胞質(zhì)中棕黃色顆粒分布均勻，未見缺失，見圖1A；子宮內(nèi)膜癌組，細(xì)胞質(zhì)中棕黃色顆粒均較正常，見圖1B；乳腺癌術(shù)后口服TAM 組，細(xì)胞質(zhì)中棕黃色顆粒明顯減少，部分細(xì)胞棕黃色顆粒呈缺失狀態(tài)，見圖1C。

2.2 三組PTEN 蛋白定量表達(dá)情況

三組PTEN 蛋白定量表達(dá)情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；子宮內(nèi)膜癌組PTEN 蛋白低于正常子宮內(nèi)膜組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 三組PTEN 蛋白定量表達(dá)情況［分，M（P25，P75）］

2.3 三組PTEN 蛋白定性表達(dá)情況

子宮內(nèi)膜癌組表達(dá)強(qiáng)度低于正常子宮內(nèi)膜組，乳腺癌術(shù)后服用TAM 組表達(dá)強(qiáng)度低于正常子宮內(nèi)膜組。見表3。

表3 三組PTEN 蛋白定性表達(dá)情況（例）

3 討論

3.1 乳腺癌國(guó)內(nèi)外進(jìn)展及內(nèi)分泌治療情況

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤。在中國(guó)，乳腺癌的死亡率逐年上升，嚴(yán)重威脅女性的生命和健康，成為社會(huì)的巨大負(fù)擔(dān)［4-7］。乳腺癌治療方式有手術(shù)聯(lián)合放化療、內(nèi)分泌治療、靶向治療等。雌激素受體陽(yáng)性的乳腺癌患者，內(nèi)分泌治療占有十分重要的地位。TAM是一種選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑（SERM)，用于乳腺癌治療已超過30 年，是非常有效的乳腺癌術(shù)后一線輔助治療藥物，可顯著降低乳腺癌的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)［8-12］。2018 年NCCN 乳腺癌指南［13］推薦，絕經(jīng)前首選TAM治療5 年，如仍未絕經(jīng)，則繼續(xù)使用至10 年，顯著降低復(fù)發(fā)率和死亡率［14］。

長(zhǎng)期服用TAM 后月經(jīng)多不規(guī)律，甚至絕經(jīng)，體內(nèi)呈現(xiàn)低雌激素狀態(tài)。TAM 有弱雌激素作用，隨著服用時(shí)間的增加，劑量累積，可引起一系列婦科病變，包括子宮內(nèi)膜增生、息肉、肉瘤和癌變［15-17］。TAM 相關(guān)子宮內(nèi)膜癌患者病理級(jí)別通常為更高級(jí)別，臨床預(yù)后較差［18］，但具體機(jī)制尚無(wú)定論，因此了解其分子機(jī)制對(duì)于制訂治療策略并減少TAM 對(duì)子宮內(nèi)膜的影響至關(guān)重要。明確TAM 相關(guān)子宮內(nèi)膜病變的早期分子標(biāo)志物，可有效預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜病變的發(fā)生，為進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。

3.2 PTEN 與子宮內(nèi)膜癌的相關(guān)性

目前Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌最常見的分子標(biāo)志物有5 種，包括PTEN、PIK3CA、K-ras、β-catenin。PTEN 是10 號(hào)染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物基因［19］，屬于抑癌基因，是Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌中發(fā)現(xiàn)的最早和最常見的遺傳改變之一，被稱做子宮內(nèi)膜的“看家基因”［20］。PTEN 可通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)PIP3 含量從而調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)。PIP3 位于細(xì)胞膜，是細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控的重要通路之一，活化的PIP3 可激活細(xì)胞周期蛋白依賴激酶，使細(xì)胞從G1期進(jìn)入S 期，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖。PTEN 有脂質(zhì)磷酸酶和蛋白磷酸酶活性，使PIP3 去磷酸化，降低細(xì)胞內(nèi)PIP3 水平，從而使細(xì)胞停止在G1期，阻止細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［21］。PTEN 在Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌中的突變率為35%～83%，在至少20%的子宮內(nèi)膜癌前病變中功能完全喪失或突變［22-23］。提示PTEN 表達(dá)缺失不僅限于子宮內(nèi)膜癌，在子宮內(nèi)膜增生中就已存在，是Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌的早期分子事件［16］。本研究對(duì)Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌組織進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)中棕黃色顆粒明顯減少，部分完全缺失；半定量積分法發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌組PTEN 蛋白表達(dá)量低于正常子宮內(nèi)膜組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3.3 乳腺癌術(shù)后服用TAM 導(dǎo)致子宮內(nèi)膜病變可能的分子機(jī)制

越來(lái)越多學(xué)者致力于研究PTEN 與TAM 導(dǎo)致子宮內(nèi)膜病變的相關(guān)性，Holtz 等［23］研究顯示，在有乳腺癌史的子宮內(nèi)膜癌患者中，服用TAM 與未服用TAM患者的子宮內(nèi)膜組織中PTEN 蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異。Prasad 等［24］研究顯示，在有乳腺癌史的女性中，與TAM相關(guān)子宮內(nèi)膜癌含有與散發(fā)性子宮內(nèi)膜癌相似的遺傳改變，為TAM 導(dǎo)致子宮內(nèi)膜病變可能的分子機(jī)制提出了新思路。郭蕾等［25］研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)期婦女服用TAM，PTEN 外顯子突變率明顯高于正常組，而與子宮內(nèi)膜癌組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提出PTEN 可能是TAM導(dǎo)致子宮內(nèi)膜病變的早期分子事件。本研究中，三組PTEN 蛋白定量表達(dá)情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示TAM 的弱雌激素作用，使得子宮內(nèi)膜長(zhǎng)期處于增殖狀態(tài)，引起PTEN 蛋白表達(dá)進(jìn)一步減少，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜病變；乳腺癌術(shù)后服用TAM 組與正常子宮內(nèi)膜組中PTEN 蛋白表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是由于樣本量較小，差異不明顯所致；且PTEN 蛋白定性分析顯示乳腺癌術(shù)后服用TAM 組PTEN 蛋白表達(dá)強(qiáng)度有明顯降低趨勢(shì)。

綜上所述，服用TAM 可能出現(xiàn)PTEN 蛋白的表達(dá)逐漸減少，影響相關(guān)通路，使子宮內(nèi)膜呈持續(xù)增生改變，進(jìn)而發(fā)展為子宮內(nèi)膜癌。馬雪蓮等［26］研究指出，TAM 通過效應(yīng)分子miR-1297 的異常表達(dá)發(fā)揮作用，引發(fā)其下游靶基因PTEN 的表達(dá)發(fā)生改變，致使P13K/P-ATK 途徑激活，P-ATK 表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞異常增殖，逃逸凋亡，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異常增生、發(fā)生癌變。本研究局限性在于樣本量較少，將會(huì)開展更大樣本的研究，專注于PTEN 與TAM 相關(guān)子宮內(nèi)膜病變之間的關(guān)系及具體機(jī)制。明確TAM 相關(guān)子宮內(nèi)膜病變機(jī)制，即可為下一步研究打下基礎(chǔ)，亦可指導(dǎo)乳腺癌內(nèi)分泌治療的臨床用藥。