陳 林，秦文飛，吳應(yīng)梅，顧 欣，田海燕，李 迪

（1.重慶市生物與食品基礎(chǔ)實驗教學(xué)中心，渝東北特色生物資源開發(fā)利用工程中心，重慶三峽學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，重慶萬州404100； 2.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海200093； 3.海南大學(xué)食品學(xué)院，海南海口570228）

紅心獼猴桃屬中華獼猴桃的紅肉獼猴桃變種[1-2]，其果肉質(zhì)地緊密細嫩，香氣濃郁，果心呈鮮紅色。紅心獼猴桃屬于皮薄多汁漿果[3]，并且對乙烯很敏感，成熟后極易腐爛變質(zhì)，不能長期貯藏。果實采收后若儲藏、運輸方式不當(dāng)會極易使獼猴桃變軟腐爛，這嚴(yán)重影響到紅心獼猴桃種植業(yè)的發(fā)展。近年來，隨著人們生活水平的不斷提高和對營養(yǎng)健康的追求，紅心獼猴桃果酒低酒精度、營養(yǎng)健康養(yǎng)生的特性更受到人們的歡迎。

本實驗對紅心獼猴桃果酒異步發(fā)酵工藝進行探究[4-6]，采用獼猴桃果漿全發(fā)酵，在添加酵母的基礎(chǔ)上利用乳酸菌進行二次發(fā)酵增進風(fēng)味[7-8]，探究一種紅心獼猴桃異步發(fā)酵酒制備方法，提高果酒的營養(yǎng)質(zhì)量和口味，以期充分開發(fā)我國的紅心獼猴桃資源[9]，進一步研究其深加工技術(shù)，提高農(nóng)產(chǎn)品經(jīng)濟價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅心獼猴桃，重慶萬州走馬鎮(zhèn)雙河杜家村金澤農(nóng)業(yè)有限公司種植基地，其品種為紅陽[10]；酵母菌、果膠酶，煙臺帝伯仕自釀機有限公司；乳酸菌，北京川秀科技有限公司；糖化酶，諾維信生物技術(shù)有限公司；檸檬酸，鄭州特征商貿(mào)有限公司；甲醇（標(biāo)準(zhǔn)品），北京勝達惠友科貿(mào)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent Technology 7890B氣相色譜儀，安捷倫科技有限公司；DHP-9080恒溫培養(yǎng)箱，濟南來寶醫(yī)療器械有限公司；PHB-10酸度計，上海虹益儀器有限公司；HT511ATC酒精計，北京金時速儀器設(shè)備有限公司；日本愛拓PAL-1可溶性固形物測定儀，北京陽光億事達貿(mào)易有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 紅心獼猴桃果酒制作流程

原料洗凈，削皮→果肉打漿→低溫滅菌→調(diào)節(jié)pH值、糖度→加入果膠酶、糖化酶、酵母和乳酸菌→攪拌→避光發(fā)酵→發(fā)酵液過濾→濾液乳酸菌發(fā)酵→陳釀→滅菌→裝罐

挑取無病蟲害，八成熟的新鮮紅心獼猴桃，清洗干凈后進行破碎打漿。然后果漿在65～70℃水浴中滅菌15～20 min，接著依次添加0.5%果膠酶、0.4%糖化酶、0.5%酵母充分?jǐn)嚢杌靹?，調(diào)整pH值后，25℃恒溫箱內(nèi)進行發(fā)酵。初次發(fā)酵6 d后過濾再添加乳酸菌增加獼猴桃酒的風(fēng)味和質(zhì)量，最后對發(fā)酵完成的紅心獼猴桃果酒過濾，陳釀。

1.3.2 單因素實驗設(shè)計

（1）乳酸菌接種量對紅心獼猴桃果酒的影響稱取800 g紅心獼猴桃果漿，在發(fā)酵溫度25℃，酵母菌接種量為0.5%，初始pH3.50，初始糖度為23%的條件下避光發(fā)酵6 d，然后過濾等量分成5份依次加入1%、3%、5%、7%、9%的乳酸菌進行第二次發(fā)酵，發(fā)酵溫度25℃。每兩天測量其酒精度并在發(fā)酵結(jié)束后對果酒進行感官評價。

（2）初始糖度對紅心獼猴桃果酒的影響

稱取800 g紅心獼猴桃果漿，發(fā)酵溫度25℃，加入酵母0.5%，初始pH值為3.50，平均分成5份用蔗糖調(diào)整糖度為17%、20%、23%、26%、29%。避光發(fā)酵6 d后加入5%的乳酸菌進行第二次發(fā)酵。每兩天測量其酒精度并在發(fā)酵結(jié)束后對果酒進行感官評價。

（3）pH值對紅心獼猴桃果酒的影響

稱取800 g紅心獼猴桃果漿，發(fā)酵溫度25℃，加入酵母0.5%，初始糖度為23%，平均分成5份用小蘇打調(diào)整pH值為2.90、3.20、3.50、3.80、4.10。避光發(fā)酵6 d后加入5%的乳酸菌進行第二次發(fā)酵。每2天測量其酒精度并在發(fā)酵結(jié)束后對果酒進行感官評價。

1.3.3 正交實驗設(shè)計

為獲得理想工藝參數(shù)，在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇乳酸菌接種量、發(fā)酵糖度和pH值3個因素，設(shè)計L9(34)正交實驗對紅心獼猴桃酒進行優(yōu)化（表1），從而確定最優(yōu)工藝條件。

表1 正交實驗因素及水平表

1.3.4 紅心獼猴桃酒感官評定標(biāo)準(zhǔn)

感官評分主要分為外觀、香氣、口感和整體感覺[11]，總分為100分，各指標(biāo)分別評分，取各指標(biāo)和為總分。評分標(biāo)準(zhǔn)表見表2。

1.3.5 甲醇的測定

準(zhǔn)確稱取甲醇500 mg、乙酸乙酯400 mg，以少量水洗入50 mL容量瓶中，并加水稀釋至刻度，混勻，準(zhǔn)確吸取上述溶液1.0 mL至10 mL容量瓶中，用10%無甲醇的乙醇溶液定容至刻度，混勻。準(zhǔn)確吸取上述溶液0.1 mL、0.3 mL、0.5 mL、0.7 mL于10 mL容量瓶中，用10%的無甲醇的乙醇溶液定容至刻度，混勻后與式樣分別上機測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液校正曲線計算出試樣的甲醇含量[12-15]。

表2 紅心獼猴桃酒感官評定標(biāo)準(zhǔn)

氣相色譜條件：色譜柱為Agilent cp97753 cp-Wax 57cb（50 m×0.32 mm×0.2 μm）；升溫程序35 ℃（2 min）；分流比40∶1；進樣口溫度180 ℃；檢測器溫度250℃；載氣N2（純度99.999%）。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌接種量、糖度及pH值對發(fā)酵的影響（圖1）

紅心獼猴桃酒中的酸主要為有機酸，能夠?qū)飘a(chǎn)生酸澀的口感，乳酸菌對有機酸（特別是蘋果酸）的降解有明顯作用，從而改善和提高果酒風(fēng)味[16]。由圖1（A）看出，隨著乳酸菌接種量增加，果酒中pH值呈上升趨勢，由此得出乳酸菌接種量越大，果酒中的蘋果酸等有機酸越能有效地被分解，從而降低果酒中酸度，提升果酒的感官品質(zhì)。感官分析表明，乳酸菌接種量為5%左右時，感官評分最高。

紅心獼猴桃含糖量與酵母繁殖、發(fā)酵的關(guān)系很密切，果漿中的糖是酵母菌生長繁殖的碳源。由圖1（B）看出，初始糖度為23%、26%時，果酒酒體醇厚、果香濃厚、感官評分較高；初始糖度超過26%時，酒精度呈急速下降趨勢，蔗糖添加量過高，導(dǎo)致體系的滲透壓過高，不利于酵母生長。綜合評價選擇糖度23%作為正交實驗的較優(yōu)水平。

紅心獼猴桃果汁原始酸度一般不適合酵母的生長和發(fā)酵。在微酸環(huán)境下，酵母菌生長、繁殖和發(fā)酵都很迅速。如圖1（C）所示，pH值為3.20時，所釀的果酒感官評分最高，從不同pH值條件的酒精度隨時間的變化趨勢圖可知，pH值在3.50左右時，酒精度變化趨勢較穩(wěn)定，果酒酸甜適中、醇厚酯香。因此綜合評價選擇pH值在3.50左右為正交實驗的較優(yōu)水平。

2.2 紅心獼猴桃發(fā)酵工藝正交實驗結(jié)果分析（表3）

由表3可知，各因素對綜合評分的影響由主到次為初始pH值＞乳酸菌接種量＞初始糖度，其組合最佳為A2B2C1，即乳酸菌接種量為5%，初始糖度為23%，pH值為3.20。根據(jù)最佳組合重新釀造紅心獼猴桃酒呈黃綠透亮色，有清甜的獼猴桃果香，口感酸甜細膩，酒味適中；經(jīng)過殺菌處理后低溫避光能儲存6個月以上，通過氣相分析測得酒樣甲醇含量低于檢出限。

表3 正交實驗結(jié)果

3 結(jié)論

單因素實驗中，乳酸菌接種量越多，越能夠明顯降低果酒中的酸度，增加果酒的口感，但從酒精度和整體的感官評價來看，乳酸菌接種量在5%時，酒精度和感官評分最高；初始糖度越大，會導(dǎo)致發(fā)酵體系中的菌種因為滲透壓過高影響發(fā)酵；由總評分可以看出，初始pH值為3.20時釀造的果酒的酒精度和感官評價較好。

正交實驗結(jié)果中，pH值對獼猴桃酒的發(fā)酵影響最大，主要是因為發(fā)酵菌種對發(fā)酵環(huán)境很敏感，在適宜的微酸的條件下，菌種的生長、繁殖和發(fā)酵速度都很迅速；其次為乳酸菌的接種量，因為乳酸菌能明顯降低果酒中的果酸，從而增加果酒的感官效果，乳酸菌接種量為5%時，果酒有更好的口感和風(fēng)味；初始糖濃度對菌種生存起著關(guān)鍵作用，適宜的糖濃度有利于微生物的生長繁殖，增加果酒的風(fēng)味。因此本實驗得到的最佳工藝參數(shù)為乳酸菌接種量為5%，初始糖度為23%，pH值為3.20。