冀俊林 周玉蘭

(東麗醫(yī)院 1急診內(nèi)科，天津 300300；2神經(jīng)內(nèi)科)

糖尿病已經(jīng)被建議成為癡呆的危險(xiǎn)因素，獨(dú)立于其他已經(jīng)確立的危險(xiǎn)因素如動(dòng)脈粥樣硬化和高血壓〔1,2〕。據(jù)估計(jì)，2型糖尿病患者與無糖尿病人群相比，認(rèn)知功能障礙的危險(xiǎn)增加1.5倍，癡呆風(fēng)險(xiǎn)增加1.6倍〔3〕。2型糖尿病和老年癡呆癥的發(fā)病率會(huì)隨著人口老齡化而逐漸增加〔4〕。丁苯酞是治療缺血性腦卒中的有效藥物〔5〕，它能有效抑制血小板聚集，減少缺血導(dǎo)致的氧化損應(yīng)激傷，調(diào)節(jié)能量代謝，改善微循環(huán)，減少腦梗死的范圍〔6～8〕。研究發(fā)現(xiàn)丁苯酞治療可以改善快速老化小鼠和慢性腦灌注不足導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙〔9,10〕。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用丁苯酞治療鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的認(rèn)知功能障礙，觀察其療效，并探討其可能的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 2月齡健康清潔級(jí)SD大鼠34只，體重200～230 g，由天津市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。每籠飼養(yǎng)2～3只大鼠，動(dòng)物房采用12 h白天/黑夜循環(huán)(8 am/8 pm)，室內(nèi)溫度(22±2)℃，動(dòng)物均可自由獲取食物和水。實(shí)驗(yàn)程序均遵循神經(jīng)科學(xué)研究關(guān)于哺乳動(dòng)物的照料與使用規(guī)定。

Morris水迷宮(MWM，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所)，丁苯酞(石家莊恩必普公司)，STZ、β-actin抗體、蛋白激酶(PK)A、磷酸化(p)-環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)、 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)抗體(Abcam公司)。

1.2模型制作及藥物治療 STZ溶解于檸檬酸鹽緩沖劑(pH4.5)，24只大鼠進(jìn)行STZ(60 mg/kg) 右下腹腹腔注射誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型。注射后72 h采集尾靜脈血液，羅氏血糖儀檢測(cè)血糖水平，血糖>16.7 mmol/L視為糖尿病模型制作成功，共24只。對(duì)照組大鼠(10只)給予等體積檸檬酸鹽緩沖劑。造模成功后糖尿病鼠分為模型組和治療組，每組12只。丁苯酞溶解于植物油，治療組給予劑量為100 mg/(kg·d)的丁苯酞灌胃治療，7 d/w，連續(xù)6 w。模型組及對(duì)照組大鼠每日給予等體積的植物油灌胃。

1.3MWM 治療結(jié)束后的第2天大鼠均通過MWM測(cè)試其空間相關(guān)的學(xué)習(xí)和記憶功能(每天早晨9∶00準(zhǔn)時(shí)開始，同1個(gè)實(shí)驗(yàn)人員操作，保持環(huán)境安靜，調(diào)節(jié)好燈光，盡量避免實(shí)驗(yàn)的干擾因素)。MWM設(shè)備是一高度0.6 m、直徑2 m的無蓋金屬圓桶，桶壁內(nèi)側(cè)為黑色。每次實(shí)驗(yàn)時(shí)桶內(nèi)裝水，水面高度為45 cm，并用黑色食品色素混勻，水溫保持在(22±1)℃。將MWM人為分為4個(gè)象限，訓(xùn)練時(shí)將平臺(tái)放置于第4象限正中(SW方向)，平臺(tái)直徑為12 cm，平臺(tái)表面位于水面下2 cm。水迷宮測(cè)試分為定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)，定位航行實(shí)驗(yàn)連續(xù)5 d，每只大鼠每天訓(xùn)練4次，每次訓(xùn)練間隔60 min，每次從不同方向面向圓筒池壁入水。每只大鼠給予120 s時(shí)間尋找平臺(tái)，記錄大鼠從入水至四肢均爬上平臺(tái)所需的時(shí)間，即逃避潛伏期。如果大鼠在120 s內(nèi)未找到平臺(tái)，由實(shí)驗(yàn)者引導(dǎo)其找到平臺(tái)(不能直接放在平臺(tái)上)，并使大鼠在平臺(tái)上停留20 s。每次訓(xùn)練之間休息30 min。第6天為空間探索實(shí)驗(yàn)，撤去平臺(tái)，使大鼠從NE方向面向圓筒池壁入水，并記錄大鼠進(jìn)入原平臺(tái)所在位置的次數(shù)(穿越平臺(tái)次數(shù))。水迷宮圓筒正上方放置攝像裝置，并連接動(dòng)物追蹤系統(tǒng)監(jiān)測(cè)、傳遞并記錄圖像軌跡和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。本實(shí)驗(yàn)主要記錄逃避潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)。

1.4血糖測(cè)定 實(shí)驗(yàn)開始時(shí)及行為學(xué)結(jié)束后使用血糖儀測(cè)量各組大鼠尾靜脈血糖。

1.5Western印跡檢測(cè)海馬PKA、p-CREB 和BDNF表達(dá) MWM實(shí)驗(yàn)后，斷頭處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，迅速分離腦組織，取海馬組織凍存。樣本使用裂解液混勻， 勻漿使用離心機(jī)離心后取上清液儲(chǔ)存于-80℃?zhèn)溆?。等量的蛋白質(zhì)被12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離并通過轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。轉(zhuǎn)膜后使用5%脫脂牛奶37℃ 封閉1 h，加入一抗：兔抗PKA(1∶1 000)、p-CREB(1∶2 000)和BDNF抗體(1∶2 000)、兔抗β-actin抗體(1∶2 000)后4℃孵化過夜。清洗幾次后加入過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵化。條帶檢測(cè)分析使用 ChemiDoc XRS 系統(tǒng)和凝膠成像分析系統(tǒng)(Quantity one)。所有條帶的光密度值(OD值)均為與β-actin的相對(duì)值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS19.0軟件進(jìn)行重復(fù)測(cè)量方差分析、LSD檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組行為學(xué)結(jié)果 與對(duì)照組相比，模型組及治療組逃避潛伏期顯著延長(P<0.05)，跨越平臺(tái)次數(shù)顯著減少(P<0.05)；治療組與模型組比較，逃避潛伏期顯著減少，跨越平臺(tái)次數(shù)顯著增多(P<0.05)。見表1。

2.2各組血糖水平比較 治療前各組血糖水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后與對(duì)照組相比，模型組血糖水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，治療組血糖顯著下降(P<0.05)；治療后治療組血糖水平仍高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表1 各組大鼠逃避潛伏期及穿越平臺(tái)次數(shù)比較

與對(duì)照組相比：1)P<0.05，與模型組相比：2)P<0.05；下表同

表2 治療前后各組血糖水平比較

2.3各組PKA、p-CREB、BDNF蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組相比，模型組PKA、p-CREB 和BDNF蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)；治療組PKA、p-CREB 和BDNF蛋白表達(dá)明顯高于模型組(P<0.05)；但治療組PKA、p-CREB 和BDNF蛋白表達(dá)仍低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3，圖1。

表3 各組PKA、p-CREB 和BDNF蛋白含量比較

圖1 各組大鼠海馬PKA、p-CREB 和BDNF蛋白表達(dá)

3 討 論

流行病學(xué)研究表明，2型糖尿病患者認(rèn)知障礙和癡呆的風(fēng)險(xiǎn)顯著高于血糖正常的人群〔11，12〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣表明糖尿病大鼠出現(xiàn)了空間學(xué)習(xí)和記憶能力的明顯下降。

糖尿病相關(guān)認(rèn)知功能下降的機(jī)制尚未完全闡明，基于糖尿病可能影響癡呆的病理發(fā)生和發(fā)展的相關(guān)病理生理機(jī)制已經(jīng)提出許多假說，包括：血腦屏障的破壞、神經(jīng)再生受損，高血糖和低血糖，炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，血循環(huán)障礙，胰島素信號(hào)通路的改變等〔13～15〕。丁苯酞作為治療缺血性腦卒中有效藥物，其作用機(jī)制包括：抑制炎癥反應(yīng)、抗血小板聚集、減少神經(jīng)元的凋亡、減少氧化應(yīng)激損傷〔16～18〕。丁苯酞可能是糖尿病大鼠認(rèn)知功能障礙的有效藥物。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過6 w的丁苯酞治療，糖尿病大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯改善。慢性高血糖會(huì)對(duì)腦結(jié)構(gòu)和認(rèn)知功能產(chǎn)生負(fù)面影響〔19〕，有研究報(bào)道，有效的血糖控制有益于認(rèn)知功能的改善〔20〕。高血糖導(dǎo)致的認(rèn)知損傷與活性氧(ROS)的增多和抗氧化水平的下降密切相關(guān)，而使用抗氧化劑可以改善糖尿病大鼠認(rèn)知障礙。丁苯酞治療后糖尿病大鼠的血糖水平下降，這可能是丁苯酞發(fā)揮治療作用的機(jī)制之一。

糖尿病會(huì)導(dǎo)致突觸可塑性的損害，促進(jìn)神經(jīng)元凋亡〔21,22〕。研究表明，PKA-CREB信號(hào)通路與哺乳動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)〔23〕。環(huán)腺苷酸(cAMP)是一個(gè)普遍存在的二級(jí)信使，它與海馬突觸的可塑性和記憶密切相關(guān)，胞質(zhì)cAMP增多促進(jìn)PKA的活動(dòng)，PKA隨后磷酸化并激活了CREB，CREB激活后與環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件(CRE)結(jié)合，隨后調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄〔24〕，如BDNF。CREB的活性對(duì)于維持神經(jīng)功能是至關(guān)重要的，其可以調(diào)節(jié)突觸可塑性、長期記憶的形成和神經(jīng)元存活〔25〕。BDNF是一種在神經(jīng)元生長、存活的調(diào)節(jié)過程中起重要作用的神經(jīng)生長因子，它的表達(dá)增多能提高海馬的神經(jīng)可塑性，改善學(xué)習(xí)和記憶能力，減少神經(jīng)元凋亡〔26,27〕。本實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠海馬區(qū)PKA、p-CREB 和BDNF的蛋白表達(dá)下降，應(yīng)用丁苯酞治療后PKA、p-CREB 和BDNF的蛋白水平明顯上調(diào)。推斷丁苯酞改善糖尿病大鼠認(rèn)知功能的另一機(jī)制可能是通過激活糖尿病大鼠海馬區(qū)PKA-CREB信號(hào)通路，從而上調(diào)BDNF的表達(dá)，影響了海馬突觸可塑性并減少了糖尿病鼠的神經(jīng)元凋亡。

綜上，丁苯酞能夠明顯改善STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的認(rèn)知功能下降，提高糖尿病大鼠海馬PKA、p-CREB 和BDNF蛋白表達(dá)，其改善糖尿病大鼠認(rèn)知功能的機(jī)制可能與丁苯酞治療后糖尿病大鼠血糖的降低和海馬PKA-CREB信號(hào)通路的激活密切相關(guān)。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)盡管丁苯酞治療提高了糖尿病大鼠認(rèn)知功能，降低了糖尿病大鼠血糖水平并提高了PKA、p-CREB 和BDNF蛋白水平的表達(dá)，但仍未達(dá)到正常水平，說明了本實(shí)驗(yàn)中丁苯酞治療方案的局限性。在今后的研究中會(huì)應(yīng)用不同濃度的給藥方案或延長治療時(shí)間，乃至聯(lián)合用藥方案來觀察丁苯酞的療效。