隋曉宇 孫玉榮 關(guān)易彤

(1齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院婦科，黑龍江 齊齊哈爾 161041；2齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院病理診斷中心)

2015年數(shù)據(jù)顯示，全球每年宮頸癌的新增發(fā)病例和死亡病例分別約為50萬(wàn)和28萬(wàn)，其中7/8的新發(fā)病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家〔1，2〕。高危人乳頭瘤病毒的持續(xù)性感染是宮頸癌發(fā)病的明確原因，目前由于宮頸癌臨床上篩查方法的局限性，尋找新的篩查生物標(biāo)志物至關(guān)重要。宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多宿主基因共同作用的結(jié)果，大量研究顯示，宮頸癌細(xì)胞中miRNA的異常表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)〔3～5〕。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，miR-136在宮頸癌組織中存在異常表達(dá)，與宮頸癌預(yù)后不良關(guān)系密切〔6〕。本研究旨在探討miR-136對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖凋亡的影響及可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 miR-136 mimics、mimics control、siRNA-E2F1(E2F1抑制劑)、E2F1 negative control和PCR擴(kuò)增引物均購(gòu)于廣州銳博生物科技有限公司，人正常上皮293T細(xì)胞株和宮頸癌HeLa細(xì)胞株購(gòu)于上海生命科學(xué)研究院。RPMI-1640培養(yǎng)基、噻唑藍(lán)(MTT)、胎牛血清、Trizol試劑、二甲基亞砜(DMSO)和放射免疫沉淀法(RIPA)蛋白裂解液均購(gòu)于美國(guó)sigma公司；E2F1單抗、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2單抗、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)單抗、β肌動(dòng)蛋白(β-actin)單抗和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔或羊抗鼠免疫球蛋白(Ig)G(IgG-HRP)抗體均購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司；Lipfectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒、PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、膜聯(lián)蛋白-V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡試劑盒和聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白含量檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于大連寶生物公司。流式細(xì)胞儀、實(shí)時(shí)定量PCR儀和電泳儀購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson公司，電泳凝膠圖像分析系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司，酶標(biāo)儀和CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)于上海賽默飛公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人正常上皮293T細(xì)胞和宮頸癌HeLa細(xì)胞以RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃、5% CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，其中培養(yǎng)基中含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和0.1 mg/ml鏈霉素。每2天換液1次，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)70%以上時(shí)，加胰蛋白酶消化，以1∶2進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞，以完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為300 000個(gè)/ml，以每孔1 ml接種于96孔細(xì)胞板上，培養(yǎng)過(guò)夜。當(dāng)細(xì)胞融合度為70%以上時(shí)，將細(xì)胞分為對(duì)照組、miR-136 control組和miR-136 mimics組，按照Lipfectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。miR-136 mimics組細(xì)胞中加入miR-136 mimics和轉(zhuǎn)染試劑，miR-136 control組細(xì)胞中加入mimics control和轉(zhuǎn)染試劑，對(duì)照組細(xì)胞中只加入轉(zhuǎn)染試劑。其中miR-136 mimics和mimics control的終濃度為40 nmol/L。上述試劑混合均勻后，常溫下反應(yīng)20 min后，更換為完全培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞按照1.3中的方法檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效果。

1.3RT-qPCR檢測(cè) 收集生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的293T細(xì)胞和HeLa細(xì)胞，加入Trizol試劑0.5 ml反應(yīng)10 min后，加100 μl氯仿，充分混合后反應(yīng)20 min，12 000 r/min 4℃離心10 min。取上清液于EP管中，加入異丙醇沉淀RNA，離心，棄上清。以75%乙醇洗滌RNA后，離心，棄上清。加入30 μl焦碳酸二乙酯水溶解RNA。采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定RNA濃度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25 μl，其中，上下游引物各0.5 μl，cDNA 2 μl，2×PCR Buffer 12 μl，ddH2O 10 μl。反應(yīng)條件：94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)。內(nèi)參基因?yàn)閁6或β-actin，2-△△Ct法計(jì)算miR-136和E2F1的相對(duì)表達(dá)水平。其中miR-136上游引物為5′-ACACTCCAGCTGGGACTCCATTTGTTTTQ-3′，下游引物為5′-TGGTGTCGTGGA-GTCG-3′；U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；E2F1上游引物為5′-CCCAACTCCCTCTACCCTT-3′，下游引物為5′-CTCCCATCTCATATCCATCCTG-3′；β-actin上游引物為5′-GGACCT-GACTGACTACCTC-3′，下游引物為5′-TACTCCTGCTTGCTGAT-3′。

1.4MTT檢測(cè) 取轉(zhuǎn)染48 h各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞，以每孔50 000個(gè)細(xì)胞鋪板于96孔板上，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，在CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)48 h后，加入20 μl 5 mg/ml MTT溶液，培養(yǎng)4 h待有藍(lán)色結(jié)晶紫產(chǎn)生，加入150 μl DMSO振蕩溶解結(jié)晶，37℃、避光反應(yīng)10 min，490 nm波長(zhǎng)下酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光值(OD值)，以(轉(zhuǎn)染組細(xì)胞OD/對(duì)照組細(xì)胞OD)×100%表示各組細(xì)胞增殖率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5流式細(xì)胞儀檢測(cè) 轉(zhuǎn)染48 h后各組細(xì)胞以0.25%胰蛋白酶消化收集，經(jīng)磷酸鹽緩沖液洗滌后離心，加入結(jié)合緩沖液500 μl制成細(xì)胞濃度為10 000個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。取1 ml細(xì)胞懸液，分別加入5 μl Annexin V-FITC和PI，充分混勻后避光處理10 min，再加入300 μl結(jié)合緩沖液，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。其中每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6Western印跡檢測(cè) 收集各組細(xì)胞，加入300 μl RIPA裂解細(xì)胞，充分搖勻，于冰上反應(yīng)30 min后離心棄上清，以BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)其濃度。每孔加入約50 μg的蛋白質(zhì)，使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺10%分離膠和5%濃縮膠電泳，電泳結(jié)束后，取下凝膠，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，于含5%脫脂奶粉的Tris鹽酸緩沖液(TBST)中封閉處理1 h，加入一抗(Bcl-2、Bax、E2F1和β-actin抗體)，4℃過(guò)夜培養(yǎng)；以TBST每次5 min洗膜3次后，加入二抗(IgG-HRP)，室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次。避光條件下，在膜上滴加電化學(xué)發(fā)光(ECL)液顯影，以凝膠成像儀進(jìn)行掃描，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.7E2F1實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞，以每孔1 ml(100 000個(gè)/ml)接種于96孔細(xì)胞板上，培養(yǎng)過(guò)夜。將細(xì)胞隨機(jī)分為siRNA-E2F1組、陰性對(duì)照組和未處理組。Lipfectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，其中siRNA-E2F1組加入siRNA-E2F1和轉(zhuǎn)染試劑，陰性對(duì)照組中加入E2F1 negative control和轉(zhuǎn)染試劑，未處理組只加入轉(zhuǎn)染試劑。轉(zhuǎn)染6 h后，更換新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，按照上述方法分別檢測(cè)各組細(xì)胞中的增殖、凋亡和Bcl-2、Bax、E2F1蛋白表達(dá)情況。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-136和E2F1在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá) 與正常上皮293T細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量(0.96±0.05)相比，宮頸癌HeLa細(xì)胞中miR-136的相對(duì)表達(dá)量(0.35±0.08)顯著下降(P<0.05)；但宮頸癌HeLa細(xì)胞中E2F1的相對(duì)表達(dá)量(0.28±0.03)較正常上皮293T細(xì)胞中(0.61±0.05)顯著升高(P<0.05)。

2.2過(guò)表達(dá)miR-136對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組相比，miR-136 control組miR-136相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，miR-136 mimics組顯著上升(P<0.01)。成功轉(zhuǎn)染后，與對(duì)照組增殖率相比，miR-136 control組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，miR-136 mimics組顯著降低(P<0.01)。過(guò)表達(dá)miR-136能夠明顯抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖。見(jiàn)表1。

表1 miR-136在宮頸癌HeLa細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞增殖的影響

與對(duì)照組比較：1)P<0.01；下表同

2.3過(guò)表達(dá)miR-136對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響 轉(zhuǎn)染48 h后，與對(duì)照組〔(8.72±1.16)%〕相比，miR-136 control組細(xì)胞凋亡率〔(9.35±1.64)%〕變化不顯著(P>0.05)，而miR-136 mimics組〔(35.86±2.28)%〕顯著升高(P<0.01)。

2.4過(guò)表達(dá)miR-136對(duì)Bcl-2、Bax和E2F1表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，miR-136 mimics組細(xì)胞中Bcl-2和E2F1蛋白表達(dá)量顯著降低，Bax蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.01)。miR-136 control組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1，表2。

圖1 Western印跡檢測(cè)Bcl-2、Bax和E2F1蛋白表達(dá)

組別Bcl-2BaxE2F1對(duì)照組0.48±0.030.18±0.030.36±0.03miR-136 control組0.42±0.050.20±0.060.35±0.03miR-136 mimics組0.23±0.051)0.45±0.081)0.22±0.021)F值25.98318.68824.955P值0.0010.0030.001

2.5沉默E2F1表達(dá)后對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖凋亡的影響 與未處理組相比，陰性對(duì)照組細(xì)胞增殖率、凋亡率、Bcl-2、Bax和E2F1蛋白相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而siRNA-E2F1組細(xì)胞增殖率、Bcl-2和E2F1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低，凋亡率和Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.01)。沉默E2F1表達(dá)后，HeLa細(xì)胞的增殖凋亡趨勢(shì)與上調(diào)miR-136表達(dá)結(jié)果相一致。見(jiàn)圖2，表3。

圖2 沉默E2F1表達(dá)后對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖凋亡的影響

組別增殖率(%)凋亡率(%)Bcl-2BaxE2F1未處理組101.02±2.258.55±1.320.51±0.030.22±0.020.32±0.02陰性對(duì)照組99.65±4.169.13±2.050.49±0.050.25±0.050.30±0.03siRNA-E2F1組53.48±5.321)34.85±2.161)0.26±0.031)0.54±0.051)0.08±0.031)F/P值130.064/0.000191.350/0.00040.395/0.00052.056/0.00072.546/0.000

與未處理組比較:1)P<0.01

3 討 論

miRNAs是一類(lèi)長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的單鏈RNA，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達(dá)，在多種腫瘤細(xì)胞的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮類(lèi)似抑癌基因或原癌基因的作用，具有強(qiáng)大的功能，通過(guò)使特定的蛋白合成阻止，實(shí)現(xiàn)基因沉默的效果〔7,8〕。miR-136是miRNAs中的重要一員，在多種腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮抗腫瘤的作用，與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切。Yang等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-136在膠質(zhì)瘤中表達(dá)下調(diào)，通過(guò)靶向星形膠質(zhì)細(xì)胞提升基因(AEG)-1和Bcl-2基因在人腦膠質(zhì)瘤中發(fā)揮抑制腫瘤的作用。Yan等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-136在三陰性乳腺癌組織中表達(dá)下調(diào)，肉瘤蛋白活化因子(RASAL)2可能是其靶基因，與miR-136表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，過(guò)表達(dá)的RASAL2使miR-136發(fā)揮抑制癌轉(zhuǎn)移的作用。目前，miR-136在宮頸癌中的作用及機(jī)制尚不完全清楚，本研究結(jié)果顯示miR-136在宮頸癌細(xì)胞中呈現(xiàn)低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-136可抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

Bcl-2家族是線(xiàn)粒體途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡的主要基因，Bcl-2和Bax分別是Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白，與宮頸癌等多種腫瘤的細(xì)胞凋亡過(guò)程關(guān)系密切，是細(xì)胞凋亡最常見(jiàn)的評(píng)判指標(biāo)〔11,12〕。E2F1是核轉(zhuǎn)錄因子(NF)E2F家族中研究最為廣泛的一員，在細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換過(guò)程中發(fā)揮重要作用，進(jìn)而起到抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。大量研究顯示，Bcl-2、Bax和E2F1與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔13，14〕。Zhou等〔15〕研究指出，Bcl-2在宮頸癌組織中的表達(dá)顯著高于正常宮頸組織；韓娜娜等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)，與正?；蚵詫m頸炎宮頸組織相比，Bcl-2表達(dá)均有不同程度的升高，Bax表達(dá)降低；辛樂(lè)等〔17〕研究發(fā)現(xiàn)，E2F1在宮頸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于慢性宮頸炎宮頸組織。本研究結(jié)果提示，過(guò)表達(dá)miR-136可能通過(guò)下調(diào)E2F1表達(dá)調(diào)控細(xì)胞周期G0/G1向S期過(guò)度，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，通過(guò)上調(diào)Bax表達(dá)和下調(diào)Bcl-2表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。通過(guò)生物學(xué)信息發(fā)現(xiàn)E2F1 mRNA的3′非翻譯區(qū)p′UTR與miR-136間有一個(gè)在物種間保守的結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)E2F1可能是miR-136的靶基因。Chen等〔18〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-136通過(guò)靶向E2F1可以逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的順鉑敏感性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，E2F1在HeLa中呈現(xiàn)高表達(dá)，與miR-136表達(dá)可能存在負(fù)相關(guān)；沉默E2F1后細(xì)胞的增殖凋亡趨勢(shì)與上調(diào)miR-136表達(dá)后的趨勢(shì)相一致，提示E2F1與miR-136具有相反的生物學(xué)功能。目前，已有研究證實(shí)miR-136與Wnt /β-catenin信號(hào)通路關(guān)系密切，miR-136在宮頸癌中的作用機(jī)制還有待更深入的研究〔19〕。另有研究發(fā)現(xiàn)，E2F1可通過(guò)激活NF-κB的經(jīng)典信號(hào)通路調(diào)控survivin的表達(dá)，從而在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡的作用〔20〕。綜上，miR-136在宮頸癌細(xì)胞中呈現(xiàn)低表達(dá)，上調(diào)其表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與E2F1有關(guān)。