成光宇 趙德喜 榮春書(shū) 劉立明 李琳 姚金文 顧兆偉 翟超

(1長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130021；2吉林省腫瘤醫(yī)院)

偏頭痛主要表現(xiàn)為單側(cè)動(dòng)脈性頭痛，并伴有神經(jīng)癥狀，包括惡心、嘔吐、畏光、畏聲、視覺(jué)障礙、認(rèn)知障礙、情緒和運(yùn)動(dòng)干擾等。偏頭痛患病率在女性中為15%～18%，男性為6%～7%，慢性偏頭痛的全球流行率為0.5%～1.0%〔1，2〕。研究表明，偏頭痛的發(fā)病機(jī)制與即早基因(IEG)的過(guò)度表達(dá)有關(guān)，IEG是細(xì)胞接受刺激后表達(dá)的基因〔3〕。c-fos 和c-jun是一對(duì)關(guān)系密切的IEG，是一種神經(jīng)激活的標(biāo)記，與痛覺(jué)調(diào)控密切相關(guān)〔4〕。本實(shí)驗(yàn)探討和解止痛顆粒對(duì)偏頭痛大鼠模型c-fos、c-jun基因表達(dá)的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 健康Wistar大鼠60只，體重150～200 g。由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，許可證號(hào)：SCXK(鄂)2015-0018。主要試劑與儀器：“和解止痛顆?！?亞泰明星制藥有限公司)；硝酸甘油注射液(北京益民藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H11020289)；水合氯醛注射液(sigma)；兔抗c-fos抗體(abcam)；兔抗c-jun 抗體(abcam)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)濃縮型試劑盒(bioswamp PAB180021)；石蠟切片機(jī)(徠卡顯微系統(tǒng)有限公司RM2235)；攤片機(jī)(湖北康強(qiáng)醫(yī)療器械有限公司TKD-TK)；IMS圖像分析系統(tǒng)(武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司DFC295)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組及偏頭痛大鼠模型制備 60只健康Wistar大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽(yáng)性藥物組、治療組各15只(8只雄性，7只雌性)，各組大鼠在同一環(huán)境下喂養(yǎng)7 d，隨后灌胃7 d。第15天，空白組皮下注射生理鹽水，其余各組皮下注射硝酸甘油注射液(10 mg/kg)制備偏頭痛大鼠模型〔5〕。20 min后大鼠表現(xiàn)為耳赤、煩躁不安、前肢頻繁搔頭、攀籠行為次數(shù)增加，30～50 min達(dá)到高峰，上述現(xiàn)象持續(xù)2.0～2.5 h，繼而大鼠活動(dòng)減少，逐漸蜷臥，提示造模成功。

1.2.2實(shí)驗(yàn)給藥 空白組及模型組大鼠均按10 mg/kg的劑量以0.9%氯化鈉溶液灌胃，1次/d。陽(yáng)性藥物組以1.8 mg/kg鹽酸氟桂利嗪灌胃，1次/d。治療組以“和解止痛顆?！?.6 g加水溶解至150 ml，予10 ml/kg灌胃，1次/d。觀察各組大鼠行為學(xué)變化，每0.5 h記錄1次。

1.2.3大鼠組織包埋與固定 大鼠皮下注射硝酸甘油4 h后，10%水合氯醛溶液(0.3 ml/100 g)麻醉，固定，經(jīng)心臟主動(dòng)脈插管，剪開(kāi)右心耳，快速推注0.9%氯化鈉注射液，4%多聚甲醛磷酸緩沖液300 ml灌注，90 min后斷頭取腦組織，置于10%甲醛中固定48 h。用乙醇逐級(jí)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片。

1.2.4免疫組化染色 將切片組織置于65℃恒溫烘箱中烤片1 h。切片脫蠟，熱修復(fù)抗原，孵育一抗12 h(4℃)，滴加生物素標(biāo)記的二抗孵育30 min(37℃)，DAB顯色、蘇木素復(fù)染3 min、透明、樹(shù)膠封片。應(yīng)用免疫陽(yáng)性細(xì)胞密度〔6,7〕的統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)映射到c-fos和c-jun免疫染色切片，隨機(jī)選擇觀察各組免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及光密度值。免疫組化染色陽(yáng)性反應(yīng)為陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域著色加深，c-fos陽(yáng)性細(xì)胞細(xì)胞核染色為棕黃色，c-jun陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)為棕黃色〔8〕。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠耳紅持續(xù)時(shí)間比較 空白組在整個(gè)過(guò)程中始終未出現(xiàn)耳紅，與模型組〔(169.56±5.97)min〕比較，陽(yáng)性藥物組〔(140.51±9.29)min〕與治療組〔(148.17±8.63)min〕大鼠耳紅持續(xù)時(shí)間均明顯縮短(P<0.01)，且治療組較陽(yáng)性藥物組有所延長(zhǎng)(P<0.01)。

2.2各組大鼠搔頭次數(shù)隨時(shí)間延長(zhǎng)的變化情況 造模前，各組大鼠搔頭次數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模后，與空白組比較，其余各組搔頭次數(shù)明顯升高(P<0.05)，陽(yáng)性藥物組與治療組明顯低于模型組(P<0.01)。31～60 min和61～90 min內(nèi)，陽(yáng)性藥物組與治療組較模型組顯著減少(P<0.01)，陽(yáng)性藥物組與治療組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，61～90min內(nèi)除空白組外各組大鼠搔頭次數(shù)均達(dá)到最高值。91～120 min、121～150 min和151～180 min內(nèi)，除空白組外的各組大鼠搔頭次數(shù)逐漸減少，治療組較陽(yáng)性藥物組明顯減少(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3各組大鼠攀籠次數(shù)隨時(shí)間延長(zhǎng)的變化情況 造模前各組大鼠攀籠次數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模后，與空白組比較，其余各組攀籠次數(shù)明顯升高(P<0.01)，陽(yáng)性藥物組與治療組較模型組明顯減少(P<0.05)。31～60 min和61～90 min內(nèi)，陽(yáng)性藥物組與治療組較模型組顯著減少(P<0.05)，陽(yáng)性藥物組與治療組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。61～90 min內(nèi)，除空白組外各組大鼠攀籠次數(shù)均達(dá)到最高值，91～120 min和121～150 min內(nèi)，除空白組外各組大鼠攀籠次數(shù)逐漸減少，陽(yáng)性藥物組與治療組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。150～180 min內(nèi)，各組均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表1 各組大鼠搔頭次數(shù)隨時(shí)間延長(zhǎng)的變化情況次)

與空白組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.01；與陽(yáng)性藥物組比較：3)P<0.05；下表同

表2 各組大鼠攀籠次數(shù)隨時(shí)間延長(zhǎng)的變化情況次)

2.4免疫組化實(shí)驗(yàn)中c-fos、c-jun基因表達(dá)情況 空白組可見(jiàn)c-fos、c-jun少量陽(yáng)性細(xì)胞，且光密度值表達(dá)不強(qiáng)；與空白組比較，模型組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增多，光密度值顯著增高(P<0.01)；與模型組比較，陽(yáng)性藥物組與治療組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、光密度值均明顯減少(P<0.01)，且陽(yáng)性藥物組較治療組均明顯減少(P<0.01)。見(jiàn)表3，圖1。

表3 各組大鼠腦組織切片c-fos、c-jun陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及光密度值比較

圖1 各組c-fos、c-jun基因的表達(dá)(×200)

3 討 論

c-fos和c-jun是原癌基因，也是IEG，能與基因激酶等信使通路發(fā)生耦聯(lián)，編碼核基因。在正常情況下，c-fos、c-jun基因表達(dá)水平很低，但受到傷害性刺激時(shí)(如腦缺血、血管性病變、神經(jīng)沖動(dòng)等)，c-fos、c-jun基因立即被啟動(dòng)復(fù)制并轉(zhuǎn)錄表達(dá)，最終分別轉(zhuǎn)錄為fos基因和jun基因。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，硝酸甘油能使偏頭痛大鼠腦切片中c-fos、c-jun的表達(dá)升高，從而推測(cè)的表達(dá)與偏頭痛有一定相關(guān)性〔8〕。鹽酸氟桂利嗪是具有循證醫(yī)學(xué)證據(jù)支撐、預(yù)防性治療偏頭痛的有效藥物〔9〕。c-fos、c-jun的陽(yáng)性表達(dá)可被鹽酸氟桂利嗪抑制〔9〕，故選其為研究藥物的對(duì)照藥，如果研究藥物亦能減少c-fos的表達(dá)，則提示研究藥物治療偏頭痛起效〔10〕。

偏頭痛致病因素復(fù)雜，臨床表現(xiàn)多樣，加之其主要臨床特點(diǎn)與《傷寒論》中少陽(yáng)病的病機(jī)有高度切合性，趙德喜等〔11〕據(jù)此提出“從少陽(yáng)病論治偏頭痛”的觀點(diǎn)，臨床擅用《傷寒論》中的小柴胡湯加減治療偏頭痛，取得良好療效，并在臨床實(shí)踐中不斷總結(jié)，逐漸形成了“和解止痛方”，治療偏頭痛患者3 000余例，臨床效果顯著，已制成中藥制劑“和解止痛顆?！辈@得了發(fā)明專(zhuān)利〔12〕。和解止痛顆粒中包含7味藥：柴胡、川芎、黃芩、姜半夏、黨參、白術(shù)、炙甘草。方中柴胡、川芎為君藥。柴胡辛散苦泄，性味微寒，歸肝膽經(jīng)，擅于清半表半里之邪，為和解少陽(yáng)之要藥。川芎性溫味辛，能祛風(fēng)止痛，且現(xiàn)代學(xué)研究已證實(shí)川芎可明顯改善腦供血，優(yōu)化神經(jīng)元新陳代謝等功效。諸藥合用，共奏和解少陽(yáng)之樞機(jī)〔13〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，和解止痛顆粒可有效縮短大鼠耳紅持續(xù)時(shí)間，減少大鼠搔頭及攀籠次數(shù)，并縮短大鼠搔頭、攀籠緩解遷延的時(shí)間，從大鼠行為學(xué)上證實(shí)了和解止痛顆粒起到鎮(zhèn)痛作用。另外“和解止痛顆?！蹦軌蛴行б种芻-fos、c-jun基因的表達(dá)，從而減少神經(jīng)元活性，抑制傷害性痛覺(jué)的傳遞，緩解疼痛刺激，提高神經(jīng)元的穩(wěn)定性，抑制神經(jīng)元對(duì)傷害性刺激的特殊興奮，起到鎮(zhèn)痛作用，縮短頭痛發(fā)作時(shí)間，緩解疼痛程度。

綜上，和解止痛顆粒治療偏頭痛有效，c-fos、c-jun基因可能是其鎮(zhèn)痛作用靶點(diǎn)。