詹向紅 呂茹 王慧霞 劉永 李偉 劉勝利

(河南中醫(yī)藥大學(xué)認(rèn)知神經(jīng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450046)

隨著生活方式的轉(zhuǎn)變，人們承受的各種精神壓力和情緒刺激不斷增加，若情緒調(diào)節(jié)不良，可嚴(yán)重影響人類的身心健康，加速機(jī)體正常衰老進(jìn)程，并引發(fā)學(xué)習(xí)記憶障礙、癡呆、抑郁癥、免疫力低下等多系統(tǒng)疾患〔1〕，目前關(guān)于認(rèn)知功能衰退的確切機(jī)制尚不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)，慢性應(yīng)激性抑郁會(huì)引起海馬神經(jīng)元谷氨酸(glu)含量升高，N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)過度激活〔2〕，細(xì)胞膜對(duì)鈣離子(Ca2+)通透性增加，大量Ca2+內(nèi)流導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載。而鈣在神經(jīng)生長(zhǎng)及突觸重塑方面有非常重要的作用〔3〕，它通過與特異性的鈣調(diào)蛋白(CaM)結(jié)合，進(jìn)一步激活下游信號(hào)通路〔如環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)〕，調(diào)控與認(rèn)知相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄〔4〕，影響大腦的學(xué)習(xí)記憶能力，因此認(rèn)為Ca2+濃度的改變?cè)诎柎暮Ｄ?AD)和血管性癡呆(VD)中起關(guān)鍵作用〔5，6〕?？梢?，慢性負(fù)性情緒應(yīng)激可以使神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣代謝失衡，進(jìn)而影響認(rèn)知功能。本課題組前期研究證實(shí)長(zhǎng)期單一負(fù)性情緒應(yīng)激是老年性癡呆發(fā)病的危險(xiǎn)因素〔7〕，但在日常生活中，人們更多處于多種負(fù)性情緒的復(fù)合應(yīng)激狀態(tài)，其對(duì)認(rèn)知衰退進(jìn)程的影響及其機(jī)制尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)擬觀察長(zhǎng)期負(fù)性情緒應(yīng)激對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，并從鈣信號(hào)通道探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)3月齡Wistar大鼠56只，購(gòu)于山東魯抗公司(SCXK〔魯〕2013-0001)，雌雄各28只，雄鼠體重(360±10)g，雌鼠體重(300±10)g。實(shí)驗(yàn)在河南省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心IVC環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室(SYXK〔豫〕2012-0009)進(jìn)行，并經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2分組及造模

1.2.1分組 Wistar大鼠正常飼養(yǎng)1 w后，按體重剔除2只偏大的個(gè)體，剩余54只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、D-半乳糖(gal)腦老化陽性對(duì)照組(以下簡(jiǎn)稱D-gal腦老化組)、長(zhǎng)期負(fù)性情緒應(yīng)激組(以下簡(jiǎn)稱負(fù)性情緒應(yīng)激組)，每組14只，雌雄各半，其余12只作為攻擊鼠。各組雌雄大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水。

1.2.2動(dòng)物處理 D-gal腦老化組：參考李文彬〔8〕的方法，于大鼠頸背部皮下多位點(diǎn)注射D-gal 0.1 g/(kg·d)，連續(xù)6 w，復(fù)制D-gal腦老化大鼠模型，作為陽性對(duì)照?？瞻讓?duì)照組：于同樣部位注射等容積的生理鹽水，1次/d，連續(xù)6 w。負(fù)性情緒應(yīng)激組：采用本課題組優(yōu)化和改良的不可預(yù)知性刺激誘發(fā)長(zhǎng)期負(fù)性情緒應(yīng)激〔9，10〕。自實(shí)驗(yàn)第15天開始，負(fù)性情緒應(yīng)激組大鼠分別依次接受8種不同的刺激(束縛、溫水游泳、間接電擊、搖晃、強(qiáng)光、潮濕墊料、噪聲、懲罰性飲水)，每天1種，隨機(jī)出現(xiàn)，持續(xù)4 w。

1.3認(rèn)知功能檢測(cè) 參照李文彬〔8〕實(shí)驗(yàn)方法，實(shí)驗(yàn)第37天開始進(jìn)行為期6 d的空間學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試，記錄大鼠尋找水下平臺(tái)的潛伏期，即尋臺(tái)時(shí)間(SPL)，以此作為定位學(xué)習(xí)記憶成績(jī)；在相同的條件下，尋臺(tái)時(shí)間越長(zhǎng)說明學(xué)習(xí)記憶能力越差。

1.4海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞Ca2+/CaM通路的檢測(cè) ①采用高效液相法測(cè)定glu濃度：取凍存的腦勻漿樣品溶液12 μl，于進(jìn)樣瓶中加入衍生試劑6 μl，四硼酸鈉緩沖液(pH9.18)480 μl，混勻，20℃靜置3 min后進(jìn)樣和檢測(cè)。 ②采用熒光免疫染色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度：磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌待測(cè)樣本，Rhod2-AM探針終濃度為4 μmol/L，37℃孵育20 min；PBS洗滌3次，充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的探針；用高內(nèi)涵成像系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量。③采用Western印跡方法測(cè)定NMDAR、CaM和P-CREB的含量：按試劑盒說明進(jìn)行規(guī)范操作。應(yīng)用Gel-Pro3軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度分析，以GAPDH為內(nèi)參照，計(jì)算NMDAR、CaM、P-CREB/GAPDH光密度比值，反映NMDAR、CaM、P-CREB相對(duì)含量變化。

1.5統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS22.0軟件，三組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，各組間兩兩比較用LSD-t法。

2 結(jié) 果

2.1一般情況觀察 空白對(duì)照組大鼠皮毛光澤度好，反應(yīng)靈敏，活動(dòng)自如，精神狀態(tài)良好；D-gal腦老化組和負(fù)性情緒應(yīng)激組大鼠一般情況大致類似，均呈現(xiàn)毛發(fā)雜亂、無光澤，精神倦怠，反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)減少等情況。

2.2長(zhǎng)期負(fù)性情緒應(yīng)激對(duì)大鼠認(rèn)知功能的影響 與空白對(duì)照組〔(22.10±11.22)s〕相比，D-gal腦老化組〔(30.08±7.60)s〕和負(fù)性情緒應(yīng)激組〔(30.13±10.43)s〕SPL均明顯延長(zhǎng)(P<0.05)；D-gal腦老化組與負(fù)性情緒應(yīng)激組的SPL無明顯差異，均耗費(fèi)較長(zhǎng)時(shí)間尋找跳水平臺(tái)。

2.3長(zhǎng)期負(fù)性情緒應(yīng)激對(duì)CaM通路的影響

2.3.1長(zhǎng)期負(fù)性情緒應(yīng)激對(duì)海馬神經(jīng)元內(nèi)glu和Ca2+濃度的影響 與空白對(duì)照組相比，D-gal腦老化組和負(fù)性情緒應(yīng)激組海馬神經(jīng)元glu含量和Ca2+濃度均顯著增加(P<0.05)；D-gal腦老化組與負(fù)性情緒應(yīng)激組海馬神經(jīng)元glu含量和Ca2+濃度比較無明顯變化。見表1。

2.3.2長(zhǎng)期負(fù)性情緒應(yīng)激對(duì)海馬神經(jīng)元NMDAR、CaM、P-CREB的影響 與空白對(duì)照組相比，D-gal腦老化組和負(fù)性情緒應(yīng)激組海馬神經(jīng)元NMDAR含量均顯著增加(P<0.05)，CaM和P-CREB含量均顯著下降(P<0.05)；與D-gal腦老化組相比，負(fù)性情緒應(yīng)激組海馬神經(jīng)元內(nèi)CaM含量明顯升高(P<0.05)，NMDAR和P-CREB含量無顯著差異，見表2。

表1 各組海馬神經(jīng)元內(nèi)glu和Ca2+濃度的比較

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.05

表2 各組海馬NMDAR、CaM、CREB含量比較

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.05；與D-gal腦老化組比較：2)P<0.05

3 討 論

D-gal注射方法制備腦老化模型，主要機(jī)制是氧化應(yīng)激產(chǎn)生大量自由基，進(jìn)而鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)造成線粒體不可逆損傷、神經(jīng)退行性變，最終表現(xiàn)為認(rèn)知功能下降〔11，12〕，此法被公認(rèn)能較好模擬自然衰老與腦老化狀態(tài)。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇D-gal注射方法制備腦老化大鼠模型，并作為陽性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，負(fù)性情緒應(yīng)激組大鼠與D-gal腦老化大鼠一樣，均呈現(xiàn)擬衰老及腦老化效應(yīng)，與課題組前期研究結(jié)果一致，即慢性負(fù)性情緒應(yīng)激可降低大鼠的興奮性、探究趨勢(shì)及認(rèn)知功能〔13〕。

海馬是情緒、學(xué)習(xí)與記憶、免疫等的調(diào)節(jié)中樞〔14，15〕，海馬神經(jīng)元的興奮性傳遞主要由glu受體介導(dǎo)，glu能系統(tǒng)異常與癡呆發(fā)病的關(guān)系尤為密切。NMDAR是glu受體亞型之一，在海馬及大腦皮層分布密集，可調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶突觸的可塑性〔16〕。長(zhǎng)期負(fù)性情緒應(yīng)激可刺激海馬，使突觸前glu大量釋放，激活NMDAR，促使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，引起興奮毒性的產(chǎn)生。Ca2+濃度的升降對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)起著決定性作用，在生理濃度范圍內(nèi)，Ca2+濃度升高可通過激活Ca2+-CaM-鈣調(diào)蛋白激酶(CaMK)Ⅱ-CREB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶的形成，Ca2+結(jié)合CaM后激活CaMKⅡ，有活性的CaMKⅡ在學(xué)習(xí)記憶過程中發(fā)揮重要的作用，通過P-CREB蛋白KID區(qū)的Ser133，使啟動(dòng)子序列上的CRE元件乙?；瑫r(shí)啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄〔17〕；CREB介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄影響腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(BDNF)的表達(dá)，而BDNF在腦的發(fā)育、分化和突觸重塑等方面發(fā)揮重要作用。因此，Ca2+-CaM-CREB信號(hào)通路直接參與調(diào)控大腦學(xué)習(xí)記憶能力。

本研究發(fā)現(xiàn)，負(fù)性情緒應(yīng)激組大鼠海馬神經(jīng)元glu、NMDAR含量和Ca2+濃度均顯著升高，CaM和P-CREB含量均顯著下降。前三個(gè)指標(biāo)升高，推測(cè)可能是由于長(zhǎng)期負(fù)性情緒應(yīng)激引起了大鼠海馬神經(jīng)元突觸釋放大量的glu，與之結(jié)合的NMDAR增加，引起神經(jīng)元在興奮過程中大量Ca2+流入，Ca2+濃度過高會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性。然而，現(xiàn)代研究已證實(shí)〔18〕，細(xì)胞存在自我保護(hù)機(jī)制，為抑制神經(jīng)元內(nèi)Ca2+濃度過高，CaM可能更多地與鈣通道的Cavl.2的c末端結(jié)合，使游離CaM含量下降，同時(shí)兩者結(jié)合使鈣通道失活〔19〕，這就導(dǎo)致CaM與Ca2+結(jié)合量減少，激活CaMKⅡ的能力減弱，使得P-CREB含量下降，其調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的能力失控，學(xué)習(xí)記憶相關(guān)蛋白合成障礙，表現(xiàn)為大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，這也正是負(fù)性情緒應(yīng)激大鼠SPL延長(zhǎng)的原因所在。雖然負(fù)性情緒應(yīng)激組和D-gal腦老化組大鼠海馬神經(jīng)元CaM含量較空白對(duì)照組下降，但負(fù)性情緒應(yīng)激組CaM含量下降程度不及D-gal腦老化組?？梢?，兩者海馬神經(jīng)元的損傷程度不完全一致，其具體原因還需進(jìn)一步研究。

綜上，長(zhǎng)期負(fù)性情緒應(yīng)激是加速認(rèn)知衰退進(jìn)程的重要原因之一，其部分機(jī)制是通過Ca2+/CaM-CaMKⅡ-CREB信號(hào)通路影響與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降。