孫偉明 崔遠(yuǎn)武 王凱 程汝珍 張玉蓮

(1天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院)

阿爾茨海默病(AD)病理上主要表現(xiàn)為以β淀粉樣蛋白(Aβ)為核心的神經(jīng)炎性斑(NPs)和tau蛋白過度磷酸化(p-tau)形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFTs)〔1〕。Aβ和p-tau可相互影響造成神經(jīng)元丟失、破壞突觸結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致AD患者認(rèn)知能力下降〔2～4〕。前期研究發(fā)現(xiàn)，益腎化濁方(YSHZ)可改善輕度AD患者的臨床癥狀，提高認(rèn)知和日常生活能力〔5〕，提高快速老化小鼠(SAMP8)的空間記憶能力〔6〕，保護(hù)神經(jīng)的超微結(jié)構(gòu)〔7〕。在此基礎(chǔ)上，本研究觀察YSHZ對SAMP8海馬區(qū)Aβ和p-tau的表達(dá)及肝腎功能的影響，以探討YSHZ治療AD的機(jī)制及其安全性。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 7月齡雄性健康SPF級SAMP8 20只，體重25～30 g；7月齡雄性SPF級抗快速老化小鼠(SAMR1)10只，體重25～30 g，由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，許可證號〔SCXK(津) 2015-0003〕。

1.2藥物與主要儀器試劑 YSHZ組成：淫羊藿10 g、女貞子10 g、制首烏6 g、肉蓯蓉10 g、石菖蒲6 g、川芎6 g。上述藥物由天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院制劑室制備：水煎3次，每次0.5 h，混合后濃縮至0.624 g/ml，4℃保存?zhèn)溆?。病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司，RM2016)、正置光學(xué)顯微鏡(日本尼康，NIKON ECLIPSE CI)、成像系統(tǒng)(日本尼康，NIKON DS-U3)。Aβ單克隆抗體(abcam公司，ab201061)，p-tau單克隆抗體(Thermo Scientific公司，AT8 MN1020B)，組化試劑盒(Servicebio公司，GDP1001)，天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒(武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司，SEB214Mu、SEA207Mu)，尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)測試盒(南京建成生物工程研究所，C013-1、C011-2)。

1.3給藥與分組 20只SAMP8隨機(jī)分成SAMP8組和YSHZ組；YSHZ組給藥劑量6.24 g/kg。SAMR1和SAMP8組給予等體積的蒸餾水。各組每日灌胃1次，持續(xù)4 w。

1.4免疫組化 采用5%水合氯醛，按照400 mg/kg劑量，腹腔注射麻醉小鼠，仰臥位固定于手術(shù)臺上，開放胸腔，剪開右心耳，將灌注針由心尖處刺入達(dá)主動(dòng)脈，先后灌注0.9%生理鹽水和4%多聚甲醛；取全腦4%多聚甲醛外固定24 h，選取視交叉至丘腦后側(cè)區(qū)域，冠狀切塊得到標(biāo)本，脫水石蠟包埋，切片厚度4 μm?？乖⒉ㄐ迯?fù)中火8 min，?；? min，中低火7 min；血清封閉，滴加抗體(Aβ 1∶200，p-tau 1∶500)4℃孵育過夜；加二抗室溫孵育50 min；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染3 min；脫水封片。400倍顯微鏡下分別選取雙側(cè)海馬CA1區(qū)各3個(gè)區(qū)域拍照。圖片分析采用Image-Pro Plus6.0軟件。

1.5肝腎功能指標(biāo)檢測 取樣前各組禁食24 h。采用眼眶取血法〔8〕收集各組血液，3 500 r/min離心10 min，取血清，分別按照說明書測定AST、ALT、BUN、Cr含量。

2 結(jié) 果

2.1各組海馬CA1區(qū)Aβ、p-tau水平 與SAMR1組比較，SAMP8組和YSHZ組CA1區(qū)Aβ、p-tau表達(dá)量明顯升高(P<0.05)；與SAMP8組比較，YSHZ組CA1區(qū)Aβ、p-tau表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見表1，圖1和圖2。

2.2各組肝腎功指標(biāo) 與SAMR1組較，SAMP8組和YSHZ組ALT水平明顯升高(P<0.05)、AST水平明顯降低(P<0.05)，Cr、BUN水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與SAMP8組比較，YSHZ組ALT、AST、Cr、BUN水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組海馬CA1區(qū)Aβ、p-tau及血清ALT、AST、Cr、BUN水平比較

與SAMR1組比較:1)P<0.05；與SAMP8組比較:2)P<0.05

圖1 各組海馬CA1區(qū)Aβ表達(dá)(DAB，標(biāo)尺=50 μm)

3 討 論

AD的主要病機(jī)在于腎精虧虛，痰瘀是其加重和發(fā)展的關(guān)鍵因素〔9〕。YSHZ中淫羊藿、肉蓯蓉充腎精，溫腎陽，女貞子、何首烏益精髓，滋肝腎；石菖蒲開竅化濕，寧神安智，川芎為血中氣藥，祛瘀活血。方中中藥有效成分淫羊藿苷可以上調(diào)磷酸化糖原合成酶激酶(p-GSK)-3β的表達(dá)，從而減緩GSK-3β過表達(dá)〔10〕；齊墩果酸可以改善AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和突觸可塑性〔11〕；二苯乙烯苷、肉蓯蓉總苷具有保護(hù)AD細(xì)胞模型神經(jīng)元的作用〔12，13〕；石菖蒲、川芎嗪可以抑制AD動(dòng)物模型的神經(jīng)元凋亡〔14，15〕。

NPs和NFTs是AD的主要病理學(xué)特征，是加重AD臨床表現(xiàn)的重要驅(qū)動(dòng)因子〔16，17〕。Aβ可通過誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡、激活tau蛋白過度磷酸化、破壞神經(jīng)元離子平衡等多種途徑發(fā)揮神經(jīng)毒性作用〔18〕；p-tau也可引起突觸功能障礙〔19〕，介導(dǎo)Aβ的毒性作用〔20〕，加重AD患者認(rèn)知障礙〔21〕。YSHZ可上調(diào)AD模型大鼠淀粉樣前體蛋白的非淀粉樣代謝途徑〔22〕；淫羊藿苷可以通過調(diào)節(jié)SAMP8 GSK-3β的表達(dá)〔6〕，從而參與tau蛋白過度磷酸化過程，但該方對NPs和NFTs的直接作用尚需進(jìn)一步證實(shí)。

本研究說明YSHZ可以有效抑制Aβ的毒性作用，減輕tau蛋白的過度磷酸化。同時(shí)，尚未發(fā)現(xiàn)該方對肝腎功能有明顯的毒性作用〔23〕。盡管SAMP8組與YSHZ組血清ALT明顯高于SAMR1組，但SAMP8組與YSHZ組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮SAMP8系小鼠自身存在一定程度的肝功能異?！?4〕。此外，SAMP8組與YSHZ組血清AST低于SAMR1小鼠，考慮AST在肝細(xì)胞中主要存在于線粒體中，出現(xiàn)嚴(yán)重的肝功能損傷時(shí)才會明顯升高〔25〕。

綜上所述，YSHZ可降低SAMP8海馬CA1區(qū)Aβ和p-tau的表達(dá)，從而減輕兩者的神經(jīng)毒性作用，同時(shí)對SAMP8肝腎功能未出現(xiàn)明顯的損傷作用。但該方減少Aβ和p-tau表達(dá)的具體機(jī)制尚需深入研究。