陳思仲 唐俊波 宣偉軍 韋瑀龍 宣毅

(廣西中醫(yī)藥大學 1第一臨床醫(yī)學院耳鼻咽喉頭頸外科，廣西 南寧 530023； 2瑞康醫(yī)學院制藥廠； 3 School of Engineering,Tufts University)

研究表明〔1～3〕，復方健耳劑具有明顯對抗小鼠耳蝸毛細胞與螺旋神經節(jié)神經元凋亡,保護聽力的作用，其作用機制與其干預含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)介導程序性聯級反應細胞死亡途徑有關，然而，細胞凋亡徑路涉及因子眾多而且復雜，因此其藥理作用機制仍未明了，本文以C57BL/6J小鼠老年性聾為模型，觀察復方健耳劑干預Fas配體(L)、細胞色素(cyt)C基因、caspase-3因子表達影響，探討中藥防治老年性聾作用機制。

1 材料和方法

1.1材料 動物老年性聾模型建立〔1～6〕，選擇1月齡剛斷奶國產健康C57BL/6J小鼠15只，由北京維通利華實驗動物技術公司提供〔批號:SCXK(京)2012-0001〕，雌雄不拘，隨機分為2月齡對照組、7月齡對照組和7月齡中藥組各5只。對照組自斷奶后飲用自來水直至月齡，中藥組自斷奶后飲用中藥溶液以代替日常飲水直至7月齡。

mRNA合成單鏈擴增逆轉錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司，熒光定量PCR引物設計在NCBI數據庫查找相關序列，由北京六合華大基因科技股份有限公合成，GoldView Ⅰ型核酸染色劑購于上海索萊寶生物科技有限公司，總RNA抽提試劑盒由美國Axygen公司提供。采用美國Bio-Rad實時定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測系統。

1.2實驗藥物及用量 復方健耳劑主要由葛根、丹參、黃芪、骨碎補等組成。經過水煮、濃縮、烘干、反復粉碎和過篩等流程，制成每克藥粉相當于6.63 g生藥材。小鼠與成人用量換算法計算出該藥的小鼠用量3.65 g/(kg·d)〔7〕。1～3月齡，中藥粉加適量比例水配兌(一般為0.05 g藥粉加5 ml水)，盛于動物自吸喂養(yǎng)瓶內供小鼠飲用,在無其他水源供應的條件下，動物每日飲下規(guī)定的內服中藥劑量，待成長至4月齡后，改用人工灌喂法以進一步確保每日飲下足量中藥。

1.3實時定量PCR 對耳蝸cytC、FasL、caspase-3 mRNA檢測 選擇PCR參考引物序列ACTB(5'-3'):上游AGTGTGACGTTGACATCCGT,下游AGTAACAGTCCGCCTAGAAGC。PCR目標引物序列FasL(5'-3'):上游GAGGTCTGTGACTGAGGGAC,下游AAACGGCCTCTGTGAGGTAG;cytC上游AATCTCCACGGTCTGTTCGG,下游GGTCTGCCCTTTCTCCCTTC;caspase-3 上游CCACGTGGGAAAGTGAACCA，下游CAGGGCTATTGCTGGATGCT。將各組斷頭取耳蝸，置液氮中冰凍備用。按照總RNA小量制備試劑盒步驟提取總RNA，即將樣品剪成小塊，緩沖液R-Ⅰ溶液震蕩洗脫下軟組織，緩沖液R-Ⅱ振蕩混勻，離心取上清，分別加入異丙醇、緩沖液W1A、 緩沖液W2振蕩均勻并離心，棄濾液，最后加無水RNase離心洗脫得RNA。總RNA瓊脂糖凝膠中電泳，判斷總RNA完整性。微量紫外分光光度計測定總RNA濃度，樣本濃度均在100～300 ng/μl的范圍。按照反轉錄反應試劑盒說明，取等量總RNA加入DNA Eraser緩沖液，無水RNase補充總體積，依次加入PrimeScript緩沖液、無水RNase、RT Primer混合物、PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ進行反轉錄PCR反應合成cDNA。加入引物，在實時定量PCR儀檢測系統中，反應條件為95℃預變性10 min,然后95℃15 s,60℃ 1 min,共40個循環(huán)，60℃延伸1 min,測出內參基因ACTB和目的基因FasL、cytC在不同樣本中擴增的Ct值，2-△△Ct法計算基因表達量差異倍數值。

1.4統計學方法 應用SPSS16.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

7月齡對照組較2月齡對照組FasL、cytC、caspase-3表達均明顯增高(P<0.05)。7月齡中藥組cytC、FasL、caspase-3表達量均值則顯著低于7月齡對照組(P<0.05)，與2月齡對照組比較則僅caspase-3水平差異顯著(P<0.05)。見表1。

表1 3組耳蝸組織cytC、FasL、caspase-3 mRNA表達比較值，n=5)

與2月齡對照組比較:1)P<0.05；與7月齡對照組比較:2)P<0.05

3 討 論

細胞凋亡是機體生長發(fā)育、細胞分化和病理狀態(tài)中細胞自主性死亡過程，是細胞內由基因編碼調控的、按嚴格程序執(zhí)行的細胞自殺過程，又稱程序性死亡(PCD)，它廣泛存在于各種細胞中，與許多人類疾病的發(fā)病機制密切相關,其中神經元死亡過程更多的是以凋亡形式表現，而凋亡的主要效應蛋白包括caspase家族的蛋白酶，caspase級聯激活介導的細胞凋亡是目前公認的經典途徑〔8,9〕，它是一組具有相似的氨基酸順序、二級結構的半胱氨酸蛋白酶家族，它的活化與細胞凋亡密切相關，它的激活主要通過線粒體途徑和細胞膜途徑〔10，11〕。線粒體途徑主要由cytC激發(fā)誘導。cytC是一種眾所周知的線粒體蛋白，通過向呼吸鏈傳遞電子來維持ATP產生，從而完成維持生命的功能，然而，在凋亡機制的激活過程中，一旦線粒體受到某種有害因素影響后，不但導致能量代謝障礙，產生大量超氧陰離子，并通過鏈式反應形成活性氧，使線粒體膜通透化，引起跨膜電位崩潰的同時，引起cytC從線粒體中外漏，在胞質內觸發(fā)內源性凋亡通路中caspase級聯激活，即與細胞凋亡蛋白酶活化因子(Apaf)-1結合，在dATP/ATP存在條件下活化caspase-9，caspase-9再激活下游效應caspase-3等，最終導致細胞染色質凝聚和DNA裂解為碎片等細胞死亡特征，即誘導細胞凋亡〔12～15〕。通過不同齡小鼠視網膜細胞線粒體動力學研究發(fā)現〔16〕，感光能量伴隨著年齡老化而明顯下降與反映線粒體代謝有關的蛋白如線粒體分裂和融合蛋白——線性體內源發(fā)動蛋白(OP)1A蛋白、cytC氧化酶等伴隨著年齡下降有關，因此認為與年齡相關的疾病和細胞死亡與線粒體功能隨年齡增長而下降密切相關。而Fas是一種319氨基酸1型跨膜糖蛋白,有3個外半胱氨酸重復結構域和內80個氨基酸結構域，稱為位于C-末端的死亡域(DD)。FasL是Fas的配體，為Ⅱ型跨膜糖蛋白，其N端150個氨基酸為腫瘤壞死因子(TNF)超家族同源區(qū)，FasL也是CD8+T細胞毒性T淋巴細胞和自然殺傷(NK)細胞的主要效應因子之一，它可與膜上3個Fas分子結合，并通過其胞內DD與胞質中Fas相關DD(FADD)結合，繼而通過 FADD末端死亡作用區(qū)域(DED)與鄰近的caspase-8中的DED結合，使caspase-8寡聚化，自身裂解而活化caspase-8，然后激活下游的caspase-3導致細胞凋亡，其中上游的啟動子caspase-8激活后，還可以通過酶解Bcl-2家族中的Bid，變成tBid，使線粒體膜通透性改變，引起cytC釋放，導致caspase聯級反應，使細胞凋亡。而Bcl-2與Bid相反，可阻止線粒體膜通透化，從而阻止cytC釋放，抑制細胞凋亡，因此，該途徑又稱死亡受體途徑。Fas-FasL與TNF一樣，是活化caspase誘導細胞凋亡的細胞膜途徑的關鍵啟起因子〔17～19〕。文獻報道〔11〕，Fas和FasL在正常中樞神經系統中也有表達，但在炎癥和退化的大腦中表達增加，并被認為參與了中樞神經系統的免疫抑制狀態(tài)。Fas和FasL的表達在多種神經系統疾病中顯著升高，提示這種系統可能在中樞神經系統的退行性和炎癥反應中起重要作用。因此，在中樞神經系統中，FasL系統應被視為一把雙刃劍:維持正常腦內免疫抑制狀態(tài)，誘導神經細胞死亡和炎癥反應，Fas-FasL被稱為一個典型的負責細胞介導的細胞毒作用、誘導外源性細胞死亡系統。通過對青年小鼠和老年小鼠研究發(fā)現〔20〕，伴隨著年齡增長，眼組織和血液中FasL表達增加，由此誘導基質金屬蛋白酶(MMP)增多，脈絡膜新生血管減少，以至老年性視功能下降，眼部激光治療能夠降低FasL表達，抑制MMP，從而促進脈絡膜新生血管增多；通過對老年、中年、青年人血細胞Fas/FasL比較顯示〔21〕，老年人Fas/FasL明顯增加，同時分析認為，老年人Fas/FasL高表達，與T淋巴細胞亞群比例失調導致免疫功能下降，由此介導的細胞凋亡關系密切。本次研究中cytC基因代表了cytC水平，由此提示，老年性耳蝸感音神經細胞凋亡出現可能是同時通過線粒體和細胞膜兩種途徑介導caspase級聯激活引發(fā)細胞PCD，這與前述文獻報道老年性相關疾病可通過細胞膜Fas-FasL激活和(或)線粒體功能障礙引起cytC異常增加并外泄引起細胞凋亡相符〔19～21〕,同時還提示復方健耳劑具有保護線粒體，防止cytC外泄或穩(wěn)定細胞膜，抑制FasL,以阻止其觸發(fā)caspase引起細胞PCD的藥理作用。

研究表明〔1～6〕，在C57BL/6J小鼠老年性聾模型中，2月齡聽力學和耳蝸毛細胞和螺旋神經節(jié)神經元形態(tài)學保持正常狀態(tài)，7月齡則出現以高頻聽力損害為主，耳蝸毛細胞和螺旋神經節(jié)神經元凋亡以耳蝸基底部為重的病理變化，由此證實耳蝸感音神經細胞凋亡伴隨著年齡增長而出現從耳蝸底回向頂回不斷發(fā)展趨勢，聽功能損害也相應出現從高頻向低頻不斷發(fā)展的規(guī)律，中藥制劑防治顯示其具有顯著對抗老年性耳蝸感音神經細胞凋亡和保護聽力的作用，中藥防治具有顯著降低caspase-3表達的藥效作用〔2〕，與本次研究一致，由此提示，caspase是引起耳蝸感音神經細胞凋亡的相關生化級聯反應的重要系統，是中藥藥理作用機制的關鍵環(huán)節(jié)。之前研究還表明，復方健耳劑可以提高小鼠耳蝸組織腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)的表達〔22〕，由此認為其保護耳蝸感音神經細胞作用可能機制除了可通過膜結合型GTP/GDP結合蛋白(Ras)-絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號轉導途徑產生系列生物學作用,即酪氨酸蛋白激酶(Trk)B是BDNF的功能型受體，是信號轉導所必需，BDNF與TrkB結合，通過 Ras-MAPK信號轉導途徑發(fā)揮其生物學作用，或通過激活神經元特定的信號傳遞途徑或影響轉錄因子結合DNA活性，來保護神經元免受氧化應激損傷等作用外〔23，24〕，近年研究證實〔25〕，BDNF可降低β淀粉樣蛋白(Aβ)誘導caspase-3和鈣蛋白酶激活，通過全長型酪氨酸蛋白激酶B受體(TrkB-FL)激活促進神經元存活，并且通過BDNF介導的腺苷A2A受體激活，保護突觸可塑性、傳輸和神經遞質的釋放功能，因此，BDNF還能降低caspase-3活性，從而阻止細胞PCD〔25，26〕。但是，理論上影響caspase通路的因素錯綜復雜，中藥還通過其他何種徑路啟動，最終阻止caspase-3介導的細胞凋亡有待研究。