牛劍祥 宋瑞 王萬(wàn)祥

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院普通外科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050)

肝細(xì)胞癌(HCC)占全部肝癌的90%以上，是肝癌主要的病理類型〔1〕。HCC細(xì)胞惡性程度高，增殖轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，病情進(jìn)展迅速，總體5年生存率僅5%左右〔2〕。目前手術(shù)切除仍是最主要的治療方法，轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)已成為阻礙HCC患者長(zhǎng)期生存的關(guān)鍵〔3〕。外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)與多種腫瘤患者預(yù)后相關(guān)，CTCs數(shù)目可以反映腫瘤負(fù)荷，能用于檢測(cè)療效，且比標(biāo)準(zhǔn)的影像學(xué)改變更早〔4,5〕。但CTCs對(duì)于檢測(cè)HCC的發(fā)生、手術(shù)療效的評(píng)估及預(yù)測(cè)患者生存率的意義尚不明確，本研究應(yīng)用基于生物素化去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)的循環(huán)HCC分離/鑒定方法檢測(cè)CTCs，評(píng)價(jià)手術(shù)切除HCC組織對(duì)HCC治療及預(yù)后的意義。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科2014年1月至2016年12月行手術(shù)治療的HCC患者60例，男27例，女33例；年齡23～80〔平均(55.7±9.4)〕歲；患者均為初發(fā)且術(shù)前未經(jīng)任何形式的抗腫瘤治療，術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)為HCC。患者及其家屬知情同意。

1.2實(shí)驗(yàn)材料 去唾液酸胎球蛋白、L-賴氨酸購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Sulfo-NHS-1C-Biotin、二喹啉甲酸(BAC)蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司；抗生物素抗體磁珠、CK-3-6H5單克隆抗體購(gòu)自德國(guó)Miltenyi公司；Ficoll-Paque PLUS 購(gòu)自天津?yàn)?yáng)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑購(gòu)自博士德公司；二步法免疫組化試劑盒購(gòu)自中杉金橋公司；TritonX-100(即用型細(xì)胞通透劑)購(gòu)自Amresco公司；CK-3-6H5購(gòu)自德國(guó)Miltenyi公司；L535R型高速離心機(jī)；RT-6100型酶標(biāo)分析儀購(gòu)自深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司；MS磁性分選柱、MACS磁性分選器購(gòu)自德國(guó)Miltenyi公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 采用基于ASGPR的循環(huán)HCC細(xì)胞分離/鑒定系統(tǒng)及免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)患者外周靜脈血中CTCs。真空采血針取患者術(shù)前、術(shù)后第1天及第7天肘正中靜脈血7.5 ml，并加入肝素抗凝，1∶1與生理鹽水混合均勻，加至3 ml細(xì)胞分離液層上，室溫下2 000 r/min離心20 min，吸取單個(gè)核細(xì)胞層，5 ml生理鹽水洗滌3次，室溫下2 000 r/min離心10 min。將外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行去唾液酸胎球蛋白生物素化標(biāo)記。將二者混合并于37℃恒溫水浴箱孵育45 min磁性標(biāo)記HCC，利用磁分選儀器分離，免疫組織化學(xué)染色鑒定，鏡下觀察：Hep Par 1 陽(yáng)性，細(xì)胞呈橢圓形，棕黃色，細(xì)胞核完整，核質(zhì)比高、體積大等特征。排除非特異染色的細(xì)胞和細(xì)胞碎片，符合上述特征的細(xì)胞為CTCs〔6〕。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各時(shí)期CTCs陽(yáng)性率比較 術(shù)后第7天CTCs陽(yáng)性率〔15例(25.0%)〕顯著低于術(shù)前〔28例(46.7%)〕及術(shù)后第1天〔35例(58.3%)；χ2=6.125，13.714，P=0.013，P<0.001〕。

2.2術(shù)前CTCs陽(yáng)性率與臨床資料的關(guān)系 術(shù)前CTCs陽(yáng)性患者腫瘤直徑、數(shù)目及血管浸潤(rùn)率均顯著高于陰性患者(P<0.05)，而年齡、性別、甲胎蛋白(AFP)濃度、乙肝表面抗原(HbsAg)水平、腫瘤分化程度、Child分級(jí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.3術(shù)前CTCs陽(yáng)性率與患者預(yù)后的關(guān)系 術(shù)前CTCs陽(yáng)性患者預(yù)后總生存時(shí)間明顯短于陰性患者(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

表1 術(shù)前CTCs陽(yáng)性率與臨床資料的關(guān)系〔n(%)〕

圖1 患者術(shù)前CTCs陽(yáng)性率與患者預(yù)后的關(guān)系

3 討 論

CTCs多因腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用或診療操作從實(shí)體腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，是實(shí)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，研究顯示CTCs是乳腺癌細(xì)胞在小鼠模型體內(nèi)發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，同時(shí)CTCs陽(yáng)性率高的乳腺癌患者預(yù)后及臨床表現(xiàn)不良〔7〕，且CTCs細(xì)胞群相比原發(fā)灶腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及干細(xì)胞表型，具有較強(qiáng)的惡性行為及耐藥能力〔8〕。目前許多研究指出，CTCs對(duì)腫瘤患者預(yù)后、復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)及療效的評(píng)估具有潛在的指導(dǎo)價(jià)值，包括胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌及肝癌〔9～12〕，但CTCs與HCC病理分型進(jìn)展及預(yù)后的關(guān)系尚無(wú)系統(tǒng)性研究。本研究結(jié)果提示CTCs陽(yáng)性患者病情進(jìn)展較深，由于未納入遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者，故無(wú)法探究CTCs與患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)系，但HCC腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與腫瘤直徑、數(shù)目及血管浸潤(rùn)均存在密切聯(lián)系，肝癌的增殖分為多中心增殖和單中心增殖，即肝內(nèi)腫瘤的多發(fā)生長(zhǎng)及單發(fā)生長(zhǎng)，多中心增殖更容易發(fā)生術(shù)后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移或肝內(nèi)的自體轉(zhuǎn)移〔13,14〕。CTCs的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移方式有多種，且肝臟的血供比較豐富，術(shù)后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率較高，其中以血行轉(zhuǎn)移最為普遍。腫瘤越大、數(shù)目越多、血管浸潤(rùn)程度越深，發(fā)生CTCs的脫落及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率越高，本研究結(jié)果也從側(cè)面反映了CTCs對(duì)于HCC轉(zhuǎn)移的潛在指導(dǎo)作用。預(yù)后分析結(jié)果表明CTCs對(duì)HCC患者預(yù)后評(píng)估具有良好的應(yīng)用價(jià)值。術(shù)后第1天患者CTCs檢出率出現(xiàn)小幅度升高，推測(cè)可能是在手術(shù)切除腫瘤組織過(guò)程中造成的機(jī)械損傷及應(yīng)激等多重作用的影響下，導(dǎo)致HCC組織細(xì)胞的脫落進(jìn)而進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，而術(shù)后第7天顯著降低可能是由于機(jī)械損傷及應(yīng)激進(jìn)入循環(huán)的HCC細(xì)胞為非自發(fā)進(jìn)入循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，與惡性生物學(xué)特性較強(qiáng)的CTCs群體存在本質(zhì)差別，導(dǎo)致其被免疫系統(tǒng)清除，而手術(shù)治療可顯著減輕原發(fā)灶負(fù)荷，減少CTCs的來(lái)源，提示CTCs可在一定程度上反映HCC治療療效。

本研究表明，通過(guò)對(duì)外周血中CTCs 的檢測(cè)可以早期檢測(cè)HCC的發(fā)生、評(píng)估HCC手術(shù)治療的療效、監(jiān)測(cè)HCC轉(zhuǎn)移及預(yù)測(cè)患者生存率，可能成為臨床治療HCC遠(yuǎn)出轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的重要手段。