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        蒙古族2型糖尿病合并大血管病變與脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)單核苷酸多態(tài)性的相關(guān)性

        2019-03-01 08:24:06董艷慧韓立坤
        中國(guó)老年學(xué)雜志 2019年4期
        關(guān)鍵詞:脂聯(lián)素多態(tài)性基因型

        董艷慧 韓立坤

        (內(nèi)蒙古民族大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古 通遼 028000)

        糖尿病(DM)大血管并發(fā)癥是導(dǎo)致2型糖尿病(T2DM)患者致殘、致死的主要原因,占所有DM患者死亡原因的59%〔1〕。因此,T2DM大血管并發(fā)癥的一級(jí)預(yù)防是DM治療中的一個(gè)重要方面〔2〕。有研究顯示脂聯(lián)素基因的錯(cuò)義突變可導(dǎo)致血漿脂聯(lián)素水平下降,并認(rèn)為這是T2DM的發(fā)病原因〔3,4〕;也有研究顯示脂聯(lián)素基因在大血管紊亂中扮演保護(hù)性角色,但是不同地區(qū)不同種族脂聯(lián)素基因表達(dá)不同〔5〕。既往的研究〔6〕多集中在脂聯(lián)素基因外顯子和內(nèi)含子區(qū),有關(guān)脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)的基因多態(tài)性與T2DM大血管病變的研究較少。通遼市是蒙古族人口最集中的地區(qū),T2DM發(fā)病率較高,故本研究旨在通過對(duì)脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)SNP-11426(rs16861194)、SNP-11391(rs17300539)、SNP-11377(rs266729)3個(gè)位點(diǎn)上的基因型和等位基因頻率的分析,探討其多態(tài)性與蒙古族T2DM大血管病變的關(guān)系。

        1 資料與方法

        1.1研究對(duì)象 選取2015年12月至2017年12月長(zhǎng)期居住于內(nèi)蒙古通遼市,在內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院門診或住院確診的四代以上均為蒙古族的患者430例,其中T2DM不合并大血管病變組(T2DM組)200例,男106例,女94例,平均年齡(45.91±12.18)歲;T2DM合并大血管病變組(T2DM+大血管病變組)230例,男127例,女103例,平均年齡(57.74±8.86)歲。T2DM診斷及分型依據(jù)1999年WHO的診斷標(biāo)準(zhǔn)。大血管病變的診斷標(biāo)準(zhǔn)〔7〕:(1)四肢大血管病變:經(jīng)外周超聲檢查證實(shí)外周血管動(dòng)脈粥樣硬化,有缺血性表現(xiàn)或閉塞、間歇性跛行、足背動(dòng)脈消失、休息痛,甚至缺血性潰瘍或壞疽等臨床表現(xiàn)。(2)冠心?。河械湫托慕g痛或心肌梗死及心電圖表現(xiàn)者,或冠脈造影明確診斷者。(3)腦血管?。翰∈分谐霈F(xiàn)偏癱或其他腦局灶性癥狀,且顱腦CT掃描或磁共振成像(MRI)顯示有缺血或出血改變者。入選對(duì)象均排除遺傳性疾病家族史及嚴(yán)重的全身系統(tǒng)疾病。本研究經(jīng)內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),研究對(duì)象均簽署知情同意書,同時(shí)通過詢問確保樣本間無血緣關(guān)系。

        1.2方法

        1.2.1一般資料及生化檢測(cè) 專人測(cè)量身高(cm)、體重(kg),計(jì)算體重指數(shù)(BMI),BMI=體重(kg)/身高(m)2。記錄飲酒史(是/否)、吸煙史(是/否)、血壓(mmHg)??崭? h后,清晨檢測(cè)糖化血紅蛋白(HbA1c),空腹血糖(FPG),空腹胰島素(FINs)、空腹C肽、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等指標(biāo)。以上所有生化指標(biāo)檢測(cè)試劑盒均由羅氏公司提供。

        1.2.2外周血DNA提取 按照人血液基因組DNA提取試劑盒(大連寶生物有限公司提供)說明書提取外周血DNA。

        1.2.3PCR引物設(shè)計(jì)與擴(kuò)增 從GenBank中查取人脂聯(lián)素基因序列,采用Oligo7軟件進(jìn)行在線引物設(shè)計(jì),由深圳華大基因股份有限公司合成,引物序列均為前向:5'ATCTCAACGGCCTAATGTGAC3',反向:5'GAAGTGGCAACATACAACACC3'。PCR反應(yīng)體系:10倍Taq PCR緩沖液5.0 μl,2.5 mmol/L dNTP 2.5 μl,上游引物2.0 μl,下游引物2.0 μl,Taq酶0.5 μl,MgCl22.5 μl,DNA模板2.0 μl,ddH2O 31.0 μl。反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃ 8 min;變性95℃ 45 s,退火55℃ 45 s,延伸72℃ 45 s,末端延伸72℃ 10 min,4℃保存,共進(jìn)行35個(gè)循環(huán),目的片段長(zhǎng)約355 bp。

        1.2.4測(cè)序與基因型的確定 擴(kuò)增后有效的PCR產(chǎn)物,送北京三博遠(yuǎn)志生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。

        1.3統(tǒng)計(jì)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件,計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn),等位基因頻率、基因型頻率采用直接基因計(jì)數(shù)法計(jì)算。計(jì)數(shù)資料單因素分析采用χ2檢驗(yàn)。以Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)確定研究樣本的群體代表性。

        2 結(jié) 果

        2.1一般資料及生化指標(biāo)比較 兩組性別分布、飲酒史、吸煙史、BMI、TC、LDL-C差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);而T2DM+大血管病變組年齡、SBP、DBP、FPG、HbA1c、FINs、C肽、TG、HDL-C均高于T2DM組(P<0.05)。見表1。

        表1 兩組入選者一般資料及生化指標(biāo)的比較

        與T2DM組比較:1)P<0.05

        2.2DNA提取與PCR擴(kuò)增結(jié)果 提取的DNA及擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物均行1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),使用GDS7500凝膠成像系統(tǒng)(UVP,德國(guó))照相記錄,觀察分析結(jié)果,確保DNA及PCR產(chǎn)物質(zhì)量。電泳圖顯示清楚,干凈無其他雜帶,見圖1、2。

        圖1 人血液中提取的基因組DNA瓊脂糖電泳檢測(cè)其純度

        圖2 基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳檢測(cè)其純度

        2.3PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果 測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站的BLAST分析證實(shí)為目的脂聯(lián)素基因,與本研究SNP位點(diǎn)吻合,部分測(cè)序結(jié)果見圖3~5。

        圖3 SNP-11377位點(diǎn)測(cè)序圖

        圖4 SNP-11426位點(diǎn)測(cè)序

        圖5 SNP-11391位點(diǎn)測(cè)序

        2.4兩組脂聯(lián)素基因型頻率及等位基因頻率比較 T2DM+大血管病變組SNP-11426位點(diǎn)AA、AG、GG;SNP-11391位點(diǎn)GG、GA、AA;SNP-11377位點(diǎn)CC、CG、GG基因型頻率及等位基因頻率與T2DM組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

        表2 脂聯(lián)素基因各位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率比較〔n(%)〕

        3 討 論

        脂聯(lián)素基因已經(jīng)被證明是T2DM的易感基因〔8〕,其啟動(dòng)子區(qū)域SNP位點(diǎn)通過調(diào)控脂聯(lián)素基因的轉(zhuǎn)錄影響脂聯(lián)素表達(dá)水平〔9〕,從而增加胰島素敏感性及具有抗炎等作用,能夠改善糖代謝和胰島素抵抗。有研究表明脂聯(lián)素基因還參與了T2DM大血管疾病的發(fā)生,在阻止T2DM大血管病變中扮演保護(hù)性角色〔10〕,但脂聯(lián)素基因與T2DM及并發(fā)癥的相關(guān)性存在種族、地域、環(huán)境、遺傳背景的差異。國(guó)內(nèi)研究其與T2DM并發(fā)癥的關(guān)系多集中在脂聯(lián)素基因外顯子及內(nèi)含子區(qū)域的SNP,如有研究表明脂聯(lián)素基因內(nèi)含子區(qū)SNP+276(G>T)與T2DM大血管病變無關(guān)〔11〕。同時(shí)也有研究表明脂聯(lián)素基因外顯子區(qū)SNP+45(T>G)不是T2DM合并冠心病的關(guān)聯(lián)因素〔12〕。關(guān)于脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)與T2DM及其并發(fā)癥關(guān)系的研究較少,多是單個(gè)橫斷面研究,如有研究提示脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)SNP-11377(C>G)與T2DM患者肱踝脈搏波傳導(dǎo)速度正相關(guān),進(jìn)一步推斷其可能是T2DM大血管病變的易感基因〔13〕。還有研究表明脂聯(lián)素基因啟動(dòng)區(qū)SNP-11377(C>G)與T2DM患者頸動(dòng)脈中層厚度有關(guān)〔14〕。國(guó)外有一項(xiàng)研究沙特阿拉伯人脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)SNP-11426(A>G)、SNP-11391(G>A)、SNP-11377(C>G)與T2DM合并冠心病無關(guān)〔15〕,而另一項(xiàng)加勒比非洲血統(tǒng)人類脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)SNP-11391(G>A)與T2DM大血管病變的研究結(jié)果也表明二者無關(guān)〔16〕。以上結(jié)果不盡相同,進(jìn)一步證明脂聯(lián)素基因多態(tài)性存在種族地域異質(zhì)性?,F(xiàn)國(guó)內(nèi)尚缺乏有關(guān)蒙古族脂聯(lián)素基因與T2DM大血管病變風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系的研究。本研究結(jié)果顯示其多態(tài)性與本地區(qū)蒙古族T2DM大血管病變無相關(guān)性,不是其患病的危險(xiǎn)因素,可能與其他風(fēng)險(xiǎn)因素存在交叉作用。本研究結(jié)果也提示,隨著年齡的增加,為防止T2DM大血管病變的發(fā)生,臨床上應(yīng)重視控制血糖、血壓、三酰甘油等水平,積極治療。本研究吸煙史與飲酒史兩組間無差別,與T2DM大血管病變危險(xiǎn)因素分析〔17〕結(jié)果不一致,可能與選擇病例存在偏移有關(guān)。本研究觀察的樣本量尚少,有一定的局限性,有待進(jìn)一步加大樣本進(jìn)行更加深入的研究。

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