宋慧，任錫亮，張香琴

(寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜研究所 寧波市瓜菜育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 寧波 315040)

芥菜(Brassicajuncea)是十字花科蕓薹屬草本植物，是全國(guó)各地普遍栽培的常用蔬菜，特別是南方地區(qū)，芥菜是當(dāng)?shù)氐奶厣Y源和支柱型產(chǎn)業(yè)，對(duì)增加當(dāng)?shù)剞r(nóng)民的經(jīng)濟(jì)收入有重要作用。同時(shí)，我國(guó)是芥菜的原產(chǎn)地，擁有1 000多份各具特色的芥菜種質(zhì)[1]，這為培育豐產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、成熟期短、抗病蟲(chóng)、耐逆、適應(yīng)性強(qiáng)的優(yōu)質(zhì)芥菜品種提供了豐富的育種材料[2-3]。旦巴等[4-6]和宋偉林等[7]先后利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(polymerase chain reaction，RAPD)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeats，SSR)和相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence—related amplified polymorphism，SRAP)等標(biāo)記對(duì)西藏地區(qū)野生芥菜資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)西藏特殊的地理環(huán)境和復(fù)雜的地貌使得當(dāng)?shù)刭Y源變異豐富，分子聚類結(jié)果與種質(zhì)地理位置密切相關(guān)。蒲曉斌等[8]和徐愛(ài)遐等[9]對(duì)我國(guó)西南、西北、西部及北部地區(qū)芥菜資源和品種進(jìn)行資源評(píng)估，聚類結(jié)果遵循地理和生態(tài)環(huán)境規(guī)律，為芥菜種質(zhì)資源搜集提供了依據(jù)。喬愛(ài)民等[10]和陳發(fā)波等[11]研究表明，芥菜變種間存在遺傳多樣性，并呈現(xiàn)地域分布規(guī)律。

寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院自開(kāi)展芥菜遺傳育種以來(lái)，除了搜集江浙一帶農(nóng)家品種，還引進(jìn)大量芥菜資源，經(jīng)過(guò)歷年繁育配組，材料品目繁多、來(lái)源模糊、表型鑒定工作繁重，極不利于親本選配。曾川等[12]在對(duì)三峽庫(kù)區(qū)芥菜品種聚類分析后，認(rèn)為試驗(yàn)材料來(lái)源比較狹窄或者模糊的情況下，分子標(biāo)記能夠更準(zhǔn)確地區(qū)分材料間遺傳距離。本研究利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院芥菜種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析，梳理材料間親緣關(guān)系，為進(jìn)一步鑒定和利用種質(zhì)材料提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜研究所十字花科課題組保存的41份優(yōu)質(zhì)特異芥菜種質(zhì)資源。

1.2 DNA提取

取芥菜幼葉，利用CTAB法提取DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳和微量核酸濃度測(cè)定儀(K5600)檢測(cè)DNA濃度和質(zhì)量，要求電泳條帶清晰無(wú)彌散，A260/280為1.7～1.8。

1.3 RAPD和SSR擴(kuò)增與檢測(cè)

RAPD引物參考蒲曉斌等[8]，SSR引物參考巴旦等[6]和陳發(fā)波等[11]報(bào)道的序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用康為世紀(jì)生物科技有限公司2×TaqMasterMix(Day)PCR混合液，按照說(shuō)明書(shū)調(diào)整反應(yīng)體系為10 μL：5 μL 2×TaqMasterMix(Day)、0.4 μL引物(5 mmol·L-1)、1 μL DNA(10 ng·μL-1)，加ddH2O至10 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，37 ℃(RAPD)/55 ℃(SSR) 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 2 min。RAPD和SSR的PCR產(chǎn)物分別用1%普通瓊脂糖凝膠和2%MS-6高分辨率瓊脂糖凝膠(Takara)電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，統(tǒng)計(jì)條帶清晰、樣品間有多態(tài)性的位點(diǎn)，相同遷移位點(diǎn)擴(kuò)增出條帶的記為“1”，無(wú)條帶記為“0”，建立0和1矩陣。計(jì)算標(biāo)記多態(tài)信息量，利用NTSYS-pc2.10e軟件處理數(shù)據(jù)，繪制聚類圖。多態(tài)性比例=(多態(tài)性位點(diǎn)/擴(kuò)增位點(diǎn))×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異引物的多態(tài)性

試驗(yàn)共使用48個(gè)RAPD和98對(duì)SSR標(biāo)記，分別擴(kuò)增395和462個(gè)位點(diǎn)，平均每個(gè)引物擴(kuò)增8.2和4.7個(gè)條帶。篩選到8個(gè)RAPD和10個(gè)SSR差異引物，在41份芥菜種質(zhì)中擴(kuò)增出30個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，2種標(biāo)記的多態(tài)性比例分別為3.04%和3.90%，SSR標(biāo)記多態(tài)性比RAPD的高(表1，圖1)。

表1 RAPD和SSR標(biāo)記在41份芥菜種質(zhì)中的多態(tài)性

圖1 SSR引物在41份芥菜材料中的擴(kuò)增

2.2 41份芥菜種質(zhì)聚類

通過(guò)計(jì)算41份材料間的遺傳相似系數(shù)繪制聚類圖，結(jié)果(表2，圖2)表明，材料間遺傳相似系數(shù)為0.31～1.00，以0.78為閾值，可以將供試材料分作9種類型。其中，第Ⅲ類包含芥菜種質(zhì)最多，有16份，第Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅷ類分別只包含1份芥菜，其他各類包含2～7個(gè)芥菜材料。第Ⅸ類與第Ⅰ類遺傳距離最遠(yuǎn)，差別最大；第Ⅸ類中的9號(hào)材料與其他各類相似系數(shù)均較小(0.56～0.62)，是41份芥菜材料中差異最大的材料，9號(hào)與第Ⅰ類37號(hào)相似系數(shù)最小(0.31)、遺傳距離最大。根據(jù)分析結(jié)果，可以選擇不同類型、遺傳相似系數(shù)小的芥菜相互配組，利用雜種優(yōu)勢(shì)選育品種。

表2 供試41份芥菜種質(zhì)聚類結(jié)果

圖2 41份芥菜種質(zhì)材料的聚類

3 小結(jié)

遺傳多樣性是反映育種材料遺傳變異的重要指標(biāo)[13]，遺傳多樣性豐富，說(shuō)明種質(zhì)類型多樣，遺傳差異較大，在品種選育及改良中有更多可選擇和利用的基因。利用聚類分析明確作物種質(zhì)資源的遺傳多樣性及其變化趨勢(shì)，有助于正確選擇親本，較好地利用種質(zhì)資源。分子標(biāo)記技術(shù)在芥菜品種親緣關(guān)系[14-17]和種質(zhì)遺傳多樣性[18-19]分析中應(yīng)用廣泛。陳發(fā)波等[11]利用SSR標(biāo)記檢測(cè)到16份芥菜變種間的遺傳相似系數(shù)為0.41～0.75，平均值為0.6，說(shuō)明芥菜變種間存在一定的遺傳多樣性；Qi等[20]利用40對(duì)AFLP引物對(duì)中國(guó)芥菜16個(gè)變種的親緣關(guān)系進(jìn)行分析，其遺傳相似系數(shù)為0.63～0.88。本試驗(yàn)利用RAPD和SSR引物檢測(cè)到41份芥菜種質(zhì)間遺傳相似系數(shù)為0.31～1.00，材料間遺傳變異較豐富，說(shuō)明寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院近年來(lái)搜集引進(jìn)的芥菜種質(zhì)差異較大，蘊(yùn)含豐富的遺傳基因。在實(shí)際應(yīng)用中，4、13、14和28等4份材料，由于收集的時(shí)間、地點(diǎn)和獲得途徑不同，雖然外觀表型相似，但不能完全確定是否是同一個(gè)材料，對(duì)用作親本一直存在疑慮。本實(shí)驗(yàn)將這4份材料聚為一類，有效地解決了這個(gè)問(wèn)題，如此可以避免使用同類材料配組，減少育種消耗。此外，我們選擇14號(hào)轉(zhuǎn)育成的雄性不育系為母本，分別與來(lái)自不同類群的8號(hào)和11號(hào)雜交，育成了甬雪3號(hào)[浙(非)審蔬2012008]和甬雪4號(hào)[浙(非)審蔬2014002]雪里蕻。這2個(gè)品種表現(xiàn)生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、產(chǎn)量高、抗病毒病，雜種優(yōu)勢(shì)非常明顯，顯示了根據(jù)聚類結(jié)果選配親本的優(yōu)勢(shì)。甬雪3號(hào)和甬雪4號(hào)雪里蕻雜交新品種的推廣應(yīng)用，受到了種植基地的歡迎。