徐麗萍張蕾宋欣偉

1.浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院 杭州 310006 2.杭州市第七人民醫(yī)院

雷公藤（Tripterygium Wilfordii，TW）系衛(wèi)矛科雷公藤屬木質(zhì)藤本植物，具有強效的抗炎及免疫調(diào)節(jié)等作用，其有效活性提取物雷公藤多苷（Tripterygium glycosides，TG）已廣泛應用于各種風濕免疫性疾病的治療，因其療效確切而逐漸受到國際醫(yī)學同行的關(guān)注和認可，但不良反應在很大程度上限制了TG的臨床應用。因此，如何在保證療效的前提下減低TG的不良反應成了風濕免疫性疾病研究的熱點。研究表明，TG不良反應的產(chǎn)生與給藥劑量及給藥時間密切相關(guān)，且臨床多以肝功能損害、性腺抑制最為多見[1]。鑒于此，本課題組成員嘗試在保證療效的基礎(chǔ)上改進給藥時間，以間歇給藥的方式替代連續(xù)給藥，同時摸索最佳的間歇給藥方案，以減少不良反應。為了進一步明確間歇給藥方案在減少藥物性肝功能損害和性腺抑制方面的優(yōu)勢，筆者在動物試驗中將間歇給藥方法與傳統(tǒng)的連續(xù)給藥方法進行比較，觀察不同給藥方式對SD大鼠肝功能及生殖功能的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與分組 清潔級8周齡雌性SD大鼠60只，體質(zhì)量222～258g，由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供[實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2018-0012]。所有大鼠均飼養(yǎng)于23～25℃的室內(nèi)，光照12h，標準飲食、自由飲水，適應性喂養(yǎng)2～3d后用于實驗。將所有大鼠按隨機數(shù)字表法分為間歇給藥組、連續(xù)給藥組、空白對照組，每組各20只。

1.2 試劑與儀器 TG片由浙江省普洛康裕藥業(yè)有限公司生產(chǎn)（批號：Z33020778）。大鼠卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）ELISA 試劑盒、大鼠黃體生成素（luteinizing hormone，LH）ELISA試劑盒均購于杭州達文生物工程公司（批號：YKE20084、YKE20085）。生化分析儀、標準規(guī)格酶標儀均為美國GE公司產(chǎn)品。CL31R低溫高速離心機為Thermo Forma公司產(chǎn)品，以上儀器均由浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 灌胃藥物制備及給藥 將TG片研末，以0.9%氯化鈉溶液配成濃度為2mg·mL-1的混懸液，給藥劑量根據(jù)魏偉等[2]主編的《藥理實驗方法學》中人與動物按體表面積折算的等效劑量比值表計算。各組大鼠按以下方法灌胃：間歇給藥組以20mg/kg·d的TG灌胃給藥4d，其后3d改以等容量的0.9%氯化鈉溶液灌胃；連續(xù)給藥組以20mg/kg·d的TG每天灌胃給藥；空白對照組大鼠連續(xù)每天予等容量0.9%氯化鈉溶液灌胃。

1.3.2 實驗指標檢測 間歇給藥組、連續(xù)給藥組大鼠藥物累積劑量達到800mg·kg-1時，各組分別隨機處死10只大鼠；藥物累積劑量達到1 400mg·kg-1時，各組分別處死余下大鼠，檢測以下指標。

1.3.2.1 大鼠動情周期觀察 處死大鼠前10d，每日上午9～11時行陰道細胞學涂片，以觀察給藥后大鼠動情周期變化。以0.9%氯化鈉溶液浸濕的棉簽輕輕插入大鼠陰道內(nèi)，旋轉(zhuǎn)后取出棉簽并涂片，95%乙醇固定20min后巴氏染色，光鏡下觀察脫落細胞。動情周期持續(xù)時間4～5d，根據(jù)脫落細胞的變化特點來劃分動情周期的各階段[3]：動情間期（65.72±10.69）h，陰道細胞學涂片以白細胞為主；動情前期（18.45±2.14）h，涂片以有核上皮細胞為主；動情期（12.24±3.36）h，以角化上皮細胞為主；動情后期（14.12±3.78）h，涂片上兼見角化上皮細胞和白細胞[4]。陰道涂片細胞學無典型改變者即為動情周期消失。

1.3.2.2 大鼠血清生化指標檢測 大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，室溫下放置1h，2 000r/min離心10min，分離血清后-4℃保存，擇期以ELISA法測定血清FSH與LH水平，生化分析儀檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate transaminase，AST）水平。

1.3.2.3 大鼠子宮、卵巢形態(tài)觀察 大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，天平稱取體質(zhì)量。開腹取子宮和卵巢，以0.9%氯化鈉溶液沖洗，沖洗后用濾紙吸去多余水分，電子天平精確稱重后計算子宮、卵巢指數(shù)。卵巢指數(shù)=卵巢濕重（mg）/體質(zhì)量（g）×100%；子宮指數(shù)=子宮濕重（mg）/體重（g）×100%。

1.4 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s表示，組間比較采用配對樣本t檢驗；計數(shù)資料組間比較采用卡方檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝功能比較 TG累積劑量達到800mg·kg-1時，間歇給藥組、連續(xù)給藥組大鼠ALT、AST水平均高于同時期空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但兩給藥組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。當累積劑量達1 400mg·kg-1時，間歇給藥組、連續(xù)給藥組SD大鼠的ALT、AST水平均較同時期空白對照組顯著升高（P＜0.01），而且間歇給藥組 ALT、AST 水平均低于連續(xù)給藥組（P＜0.05）。見表1。

2.2 TG對大鼠生殖功能的影響

表 1 各組大鼠肝功能比較（±s，U·L-1）Tab.1 Comparison of liver function in each group(±s,U·L-1)

表 1 各組大鼠肝功能比較（±s，U·L-1）Tab.1 Comparison of liver function in each group(±s,U·L-1)

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與連續(xù)給藥組比較，#P＜0.05Note:Compared with blank control group,*P＜0.05,**P＜0.01;compared with continuous administration group,#P＜0.05

組別 累積劑量（800mg·kg-1） 累積劑量（1 400mg·kg-1）AST ALT AST ALT間歇給藥組連續(xù)給藥組空白對照組129.80±31.72*131.40±26.45*45.00±10.90 30.10±5.89*32.30±5.08*22.50±3.59 147.20±15.47**#169.10±28.68**48.00±10.24 38.40±5.97**#45.70±4.11**24.30±3.10

2.2.1 各組大鼠動情周期變化比較 TG累積劑量達到800mg·kg-1時，兩給藥組均有部分大鼠出現(xiàn)動情周期延長，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；間歇給藥組動情周期延長大鼠的比例低于連續(xù)給藥組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但兩組均未出現(xiàn)動情周期消失大鼠。累積劑量達到1 400mg·kg-1時，兩給藥組大鼠動情周期均延長，兩組均有部分大鼠動情周期消失，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），間歇給藥組動情延長及動情周期消失大鼠比例顯著低于連續(xù)給藥組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表 2。

2.2.2 各組大鼠卵巢、子宮指數(shù)比較 TG累積劑量達到800mg·kg-1時，間歇給藥組與連續(xù)給藥組大鼠卵巢、子宮指數(shù)均低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但兩給藥組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。累積劑量達到 1 400mg·kg-1時，間歇給藥組與連續(xù)給藥組大鼠卵巢、子宮指數(shù)均明顯低于空白對照組（P＜0.01），而且間歇給藥組卵巢、子宮指數(shù)高于連續(xù)給藥組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表3。

表2 各組大鼠動情周期變化比較[n（%）]Tab.2 Comparison of estrous cycle changes in each group[n（%）]

2.2.3 各組大鼠生殖激素水平比較 TG累積劑量達到800mg·kg-1時，各組間FSH、LH水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；但間歇給藥組與連續(xù)給藥組FSH/LH值均高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），兩給藥組間比較，間歇給藥組性腺抑制情況較輕，F(xiàn)SH/LH值低于連續(xù)給藥組（P＜0.05）。累積劑量達到1 400mg·kg-1時，與空白對照組比較，間歇給藥組大鼠FSH、LH水平差異仍無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但以上兩組大鼠FSH、LH水平均低于連續(xù)給藥組（P＜0.05）；此時兩給藥組大鼠FSH/LH值均較前進一步升高，均高于空白對照組（P＜0.05）；而間歇給藥組FSH/LH值仍低于連續(xù)給藥組（P＜0.01）。見表4。

表 3 各組大鼠卵巢、子宮指數(shù)比較（±s，mg·g-1）Tab.3 Comparison of ovarian and uterus indexes in each group(±s,mg·g-1)

表 3 各組大鼠卵巢、子宮指數(shù)比較（±s，mg·g-1）Tab.3 Comparison of ovarian and uterus indexes in each group(±s,mg·g-1)

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與連續(xù)給藥組比較，##P＜0.01Note:Compared with blank control group,*P＜0.05,**P＜0.01;compared with continuous administration group,##P＜0.01

組別 累積劑量（800mg·kg-1） 累積劑量（1 400mg·kg-1）卵巢指數(shù) 子宮指數(shù) 卵巢指數(shù) 子宮指數(shù)間歇給藥組連續(xù)給藥組空白對照組0.4080±0.039*0.3498±0.047*0.4475±0.055 1.2035±0.2408*1.0296±0.1342*1.4717±0.3141 0.4176±0.0510**##0.3753±0.0575**0.5066±0.0650 1.6060±0.4320**##1.1134±0.1760**1.7680±0.5463

表 4 各組大鼠 FSH、LH 水平比較（±s，mU·mL-1）Tab.4 Comparison of FSH and LH in each group(±s,mU·mL-1)

表 4 各組大鼠 FSH、LH 水平比較（±s，mU·mL-1）Tab.4 Comparison of FSH and LH in each group(±s,mU·mL-1)

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與連續(xù)給藥組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note:Compared with blank control group,*P＜0.05;compared with continuous administration group,#P＜0.05,##P＜0.01

組別 累積劑量（800mg·kg-1） 累積劑量（1 400mg·kg-1）FSH LH FSH/LH FSH LH FSH/LH間歇給藥組連續(xù)給藥組空白對照組1.12±0.18 1.15±0.11 1.01±0.28 2.77±0.13 2.84±0.22 2.76±0.12 0.39±0.02*#0.41±0.03*0.37±0.03 1.17±0.17#1.36±0.22 1.14±0.22#2.94±0.43#3.07±0.29 2.91±0.09#0.41±0.03*##0.44±0.06*0.38±0.04

3 討論

自20世紀60年代至今，研究證實TG能夠治療多種自身免疫性疾病，并具有起效快、療效好的特點，除了自身免疫性疾病外，TG還可用于皮膚病、血液病、腎臟病等疾病的治療，均有確切可觀的療效[5]。不僅如此，近年來TG逐漸引起了國外學者的注意。2009年Goldbach-Mansky等[6]報道了類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的多中心隨機臨床試驗結(jié)果，TG治療組患者的美國風濕病學會（American College of Rheumatology，ACR）20%緩解率優(yōu)于柳氮磺吡啶組。2015年北京協(xié)和醫(yī)院張烜教授聯(lián)合國內(nèi)9家風濕病研究中心的研究發(fā)現(xiàn)，在RA患者中單用TG的治療效果不亞于單用甲氨蝶呤，而且TG與甲氨蝶呤聯(lián)合使用的療效顯著優(yōu)于單用甲氨蝶呤[7-8]。其療效受到包括美國梅奧診所首席風濕病學專家Mattson等諸多學者的高度重視，但其諸多不良反應，如胃腸道反應、肝酶升高、白細胞下降以及性腺損害（主要表現(xiàn)為月經(jīng)紊亂、精子減少）等，在很大程度上限制了TG的進一步廣泛應用。羅嵐等[9]研究揭示，TG的肝毒性作用主要表現(xiàn)在膽汁淤積、氧化應激、炎癥反應3個方面，并認為這可能與其肝臟蓄積有關(guān)。

本課題組前期進行了大量臨床觀察，發(fā)現(xiàn)臨床上采用TG間歇給藥方案治療RA有著不亞于連續(xù)給藥方案的療效，而且能一定程度地減少TG的不良反應和耐藥的發(fā)生，但不同給藥方式對TG療效及不良反應的影響目前尚無系統(tǒng)研究報道。而本課題組經(jīng)過長期臨床研究發(fā)現(xiàn)，按照說明書建議的每日最大劑量（60mg/d，分3次給藥），每周用藥4d、停3d的間歇給藥方案能最大程度地保證療效，同時可以減少肝臟損害、性腺抑制的發(fā)生。本研究以等效劑量TG進行了動物實驗，證實當累積劑量達到800mg·kg-1和1 400mg·kg-1時，間歇給藥方案能夠顯著降低藥物性肝臟損害以及性腺抑制的發(fā)生，但是否還有更佳的間歇給藥方案，目前正著手開展進一步的實驗及臨床研究。

目前，各類相關(guān)研究對提高TG療效及減少肝臟損害的內(nèi)容較多，而其對性腺損害的影響研究較少。本實驗在研究間歇給藥方式對性腺損害的影響時，采用了目前公認準確可行的動情周期、子宮及卵巢指數(shù)、性激素水平作為性腺功能的評判指標。結(jié)果顯示，TG能使各組大鼠動情周期紊亂，主要表現(xiàn)為動情周期延長；隨著劑量增加，連續(xù)給藥組部分大鼠動情周期消失，比例高達60%。說明TG連續(xù)給藥對大鼠的動情周期的影響更大，隨著累積劑量的增加，兩種不同給藥方式的影響差異更顯著。此外，本實驗研究顯示同等劑量下，間歇給藥對子宮、卵巢發(fā)育的影響更小，可能與持續(xù)給藥更容易造成大鼠體內(nèi)生殖激素水平降低及失調(diào)有關(guān)，干擾卵泡發(fā)育成熟所需的激素微環(huán)境，從而影響子宮、卵巢的發(fā)育。臨床上可以配伍益腎填精類中藥，以減少TG長期使用對性腺的損害，但通過間歇給藥方式來改善尚未見于報道，本研究結(jié)果為該給藥方案的可行性提供了一定的理論依據(jù)。

綜上所述，本研究證實同等劑量下，TG間歇給藥對動物肝功能和性腺的影響小于連續(xù)給藥。但本研究設計較為簡單，未深入研究相關(guān)機制，今后的研究將在評估療效的同時，進一步對不同給藥方式的具體作用機制進行探討。