童 萌，劉 青

(甘肅省婦幼保健院婦科，蘭州 730050)

卵巢癌是女性癌癥死亡的第五大原因，據(jù)統(tǒng)計(jì)在美國，2017年卵巢癌的新發(fā)人數(shù)約22 440例[1]；在韓國，2004—2014年，卵巢癌的發(fā)病率從3.2/10萬增加到4.8/10萬[2]；而在我國，2015年約有52 100例新發(fā)病例，且有22 500例死亡[3]。而卵巢上皮性癌(epithelial ovarian cancer,EOC)是卵巢癌的主要類型，占卵巢癌的90%以上，有顯著的組織學(xué)和分子異質(zhì)性。由于早期癥狀不明顯，70%的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已為晚期，并伴有腹膜轉(zhuǎn)移，且無論對治療的初始反應(yīng)如何，最終均可以觀察到化學(xué)抗性[4]。EOC的治療仍以腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)+以鉑類為基礎(chǔ)的化療為主，最新的治療方法包括貝伐單抗和聚ADP-核糖聚合酶奧拉帕尼，但手術(shù)的局限性和患者對化療藥物耐藥性的提高以及靶向藥物使用的局限性，使患者的5年生存率普遍低于35%，而5年復(fù)發(fā)率高達(dá)80%[5]；相反，早期(Ⅰ～Ⅱ期)患者的生存率高達(dá)90%[6]。因此，卵巢癌的早期診斷成為患者治療效果及預(yù)后評估的重要影響因素。臨床上常用糖類抗原125和人附睪蛋白4等腫瘤標(biāo)志物對EOC的診治效果及預(yù)后進(jìn)行評估，但因其敏感性不高且缺乏特異性，故指導(dǎo)作用有限。近年來，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells,CTCs)的提出，為卵巢癌的早期發(fā)生、癌癥進(jìn)展和治療提供了新思路?，F(xiàn)就CTCs與卵巢癌的早期診斷、個(gè)體化治療效果反應(yīng)及預(yù)后評估的關(guān)系予以綜述。

1 CTCs的概述

CTCs由Ashworth[7]于1869年首先提出；1976年，Nowell[8]將CTCs定義為來源于原發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移性腫瘤，獲得脫離基膜的能力并通過組織基質(zhì)進(jìn)入血管的腫瘤細(xì)胞。CTCs體積大于外周白細(xì)胞，且核大，可見病理性核分裂象或多核巨細(xì)胞，在熒光顯微鏡下，4，6-二脒基-2-苯基吲哚、細(xì)胞角蛋白19呈陽性。Fan等[9]及Poveda等[10]的研究顯示，CTCs同一細(xì)胞中會同時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞核4，6-二脒基-2-苯基吲哚陽性的藍(lán)染和細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞角蛋白19陽性的綠染。CTCs的分型包括上皮表型、間質(zhì)細(xì)胞表型、上皮與間質(zhì)混合表型及循環(huán)腫瘤微栓，Liberko等[11]的研究顯示，CTCs的形成、遷移、侵襲與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。CTCs是漂浮細(xì)胞群，其可從原發(fā)部位分離，并通過循環(huán)和淋巴系統(tǒng)傳播到整個(gè)身體，對失巢凋亡具有抗性。CTCs被認(rèn)為是轉(zhuǎn)移的種子細(xì)胞，分離不需要任何侵入性程序?；贓OC的性質(zhì)和位置，CTCs在EOC患者中的血液傳播途徑尚不清楚，同時(shí)酪氨酸激酶受體在EOC的CTCs形成中的作用尚未確定。近年來對CTCs的研究表明，從循環(huán)系統(tǒng)中捕獲酪氨酸激酶受體陽性細(xì)胞是分離CTCs用于腫瘤細(xì)胞的基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)表征的有效方法[12]。因此，酪氨酸激酶靶向分離CTCs將有助于癌癥治療方法的設(shè)計(jì)，確定癌癥患者對化療藥物效果的反應(yīng)和耐藥機(jī)制。但由于外周血中的CTCs從原發(fā)腫瘤流入脈管系統(tǒng)并以極低的濃度(僅占白細(xì)胞的1/106～1/107)在血流中循環(huán)，且在血液中呈現(xiàn)出很高的異質(zhì)性，故CTCs檢測技術(shù)仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。

2 CTCs的檢測

CTCs的檢測過程可分為細(xì)胞的富集及鑒定，目前為止，已有多種技術(shù)用于EOC中CTCs的富集和檢測，CTCs的分離或富集主要基于免疫磁性顆粒的大小，而CTCs的檢測主要基于免疫細(xì)胞化學(xué)法。其中，基于物理特性使CTCs分離或富集的新技術(shù)，如用于分離和檢測EOC患者CTCs的微流體裝置已在研究中得到應(yīng)用[13-14]；同時(shí)，基于微流體的ParsortixTM技術(shù)也已應(yīng)用于CTCs的檢測和富集。Nagrath等[15]用功能捕獲技術(shù)成功富集了116例患者中115例轉(zhuǎn)移性肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌及結(jié)腸癌患者外周血中的CTCs；同時(shí)，還有物理捕獲技術(shù)，如ISET、Dean Flow Franctionation檢測系統(tǒng)，也可富集外周血中的CTCs；此外，Katarina等[16]使用抗體捕獲技術(shù)分別對卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌及宮頸癌患者進(jìn)行CTCs富集。富集分離后的CTCs需進(jìn)一步鑒定，目前常用的方法有免疫熒光標(biāo)記、RNA原位雜交、染色體核型鑒定等，它們可以對細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)及分子學(xué)等進(jìn)行測定，以實(shí)現(xiàn)對CTCs的定性及定量分析[17]。其中，免疫標(biāo)記法是最常用的方法，其利用上皮細(xì)胞的特異性抗體，對一種或多種抗體染色，從而鑒定出CTCs。常用的卵巢癌特異性抗體有細(xì)胞角蛋白、上皮細(xì)胞細(xì)胞黏附分子、切除修復(fù)交叉互補(bǔ)蛋白1、親環(huán)素C及葉酸受體α等。臨床上，研究者可以根據(jù)以上不同的卵巢特異性抗體，對CTCs做出選擇。食品藥品管理局采用依賴抗上皮細(xì)胞黏附分子對CTCs進(jìn)行選擇，并公布當(dāng)外周血CTCs≥2個(gè)/7.5 mL時(shí)為CTCs陽性，這種方法主要用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌。然而，由于CTCs在上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中可導(dǎo)致上皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)下調(diào)，故會影響CTCs的捕獲。Po等[18]利用基于神經(jīng)鈣黏素的流式細(xì)胞儀檢測了卵巢癌患者的卵巢癌細(xì)胞系，結(jié)果表明單獨(dú)基于神經(jīng)鈣黏素分離出的CTCs是單獨(dú)使用上皮細(xì)胞黏附分子離出CTCs的2.1倍。Tsai等[19]首次采用新型微流體系統(tǒng)以卵巢癌CX-BG1-10-A適體包被的磁株為特征來捕獲血液的CTCs，此方法獲得的CTCs中白細(xì)胞明顯減少，且假陽性率較CellSearch檢測方法低至少兩個(gè)數(shù)量級，故其成為一種有前景的檢測手段。而Obermayr等[14]為了提高CTCs富集的純度，開發(fā)了一種富集CTCs的工作流程，即結(jié)合密度梯度離心和濃縮、ParsortixTM微流體技術(shù)及實(shí)時(shí)熒光定量測定聚合酶鏈反應(yīng)分析的方法，消耗CTCs中約106污染的白細(xì)胞，從而為臨床研究中CTCs的檢測和分子表征的探索進(jìn)一步提供了可靠的理論依據(jù)。

3 CTCs在卵巢癌早期診斷中的價(jià)值

目前，血清糖類抗原125和人附睪蛋白4是評估卵巢癌最常用的標(biāo)志物，但由于兩者單獨(dú)檢測缺乏敏感性和特異性，CTCs的檢測為患者提供了一種更為方便、無創(chuàng)及精準(zhǔn)的檢查方法。有研究顯示，在500例卵巢癌Ⅰ期患者中，血清糖類抗原125的陽性率(65%)明顯低于CTCs，且卵巢癌早期(Ⅰ期、Ⅱ 期)的檢出率(82%和85%)明顯低于晚期(Ⅲ 期、Ⅳ期)(91%和100%)(P<0.05)，證明CTCs的增加與癌癥進(jìn)展相關(guān)[20]。Ried等[21]研究比較了CTCs計(jì)數(shù)與癌癥的狀態(tài)和風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)果表明CTCs篩查檢測EOC的敏感性較高，且CTCs計(jì)數(shù)越多，則為惡性腫瘤的可能性越高。隨著時(shí)間的推移，CTCs的檢測也可用于評估治療的有效性。Pearl等[22]分離了129例術(shù)前卵巢癌患者的侵襲性循環(huán)腫瘤細(xì)胞(invasive circulating tumor cells，iCTCs)，結(jié)果顯示iCTCs在卵巢癌早期(Ⅰ～Ⅱ 期)患者中的特異度和陽性預(yù)測值均高于糖類抗原125(98.1%比76.2%，77.8%比61.6%)。Guo等[23]及Suh等[24]的研究顯示，CTCs診斷早期卵巢癌的敏感性高于血清糖類抗原125。Gostner等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在早期診斷中卵巢癌患者的CTCs狀態(tài)與免疫系統(tǒng)功能也相關(guān)，如在CTCs陽性患者中，與免疫系統(tǒng)相關(guān)的生物標(biāo)志物(新蝶呤、色氨酸及犬尿氨酸)水平均顯著升高。上述研究表明，CTCs檢測在區(qū)分卵巢良惡性腫瘤和早期卵巢癌的診斷中發(fā)揮重要作用，且在很大程度上提高了EOC早期診斷的敏感性和特異性。

4 CTCs在卵巢癌精準(zhǔn)治療中的應(yīng)用價(jià)值

卵巢癌治療過程中化療藥物耐藥性的提高及生物靶向治療的進(jìn)展使得CTCs在卵巢癌的個(gè)體化治療中呈現(xiàn)出獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值。Aktas等[26]研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌患者中CTCs表面的腫瘤抗原或分子標(biāo)志物可作為生物靶向治療的靶點(diǎn)。而Obermayr等[27]利用聚合酶鏈反應(yīng)對CTCs進(jìn)行了檢測，鑒定了卵巢癌CTCs的新基因標(biāo)記，包括細(xì)胞周期素2基因、缺氧誘導(dǎo)基因、腫瘤相關(guān)膜蛋白2基因、T細(xì)胞分化蛋白2基因、酵母蛋白C基因和神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白8 基因六種，其中酵母蛋白C基因陽性的CTCs患者更可能出現(xiàn)鉑類藥物耐藥。Craescu等[28]研究指出，酵母蛋白A基因?yàn)槊庖咭种扑幬锃h(huán)孢素A的受體；隨后Lee和Kim[29]的研究證實(shí)，酵母蛋白A基因具有逆轉(zhuǎn)鉑類化學(xué)抗性的巨大潛力，其在各種癌癥中表達(dá)上調(diào)，與癌癥的惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。而Zhang等[20]的研究顯示，血液CTCs數(shù)量隨著治療方法的變化而變化，且CTCs中上皮細(xì)胞黏附因子和人類表皮生長因子受體2的表達(dá)與化療的耐藥性相關(guān)。Katarina等[30]使用MetaCell技術(shù)通過基于熒光顯微鏡的細(xì)胞形態(tài)學(xué)評估結(jié)合相對基因表達(dá)分析來檢測CTCs，發(fā)現(xiàn)人角蛋白7基因、白血病基因、上皮細(xì)胞黏附分子基因、Mucin16、Mucin1、牛角蛋白18 和牛角蛋白19基因的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故得出根據(jù)不同基因的表達(dá)可以檢測出EOC患者中CTCs的表達(dá)情況，這些基因在作為輔助卵巢癌早期診斷潛在生物標(biāo)志物的同時(shí)，也可預(yù)測卵巢癌的治療反應(yīng)。

5 CTCs評估卵巢癌預(yù)后及復(fù)發(fā)的價(jià)值

EOC的轉(zhuǎn)移存在于所有實(shí)體惡性腫瘤中，包括腹膜腔內(nèi)腫瘤細(xì)胞球體利用腹水轉(zhuǎn)移和血行轉(zhuǎn)移兩種途徑。血液中的CTCs不僅可以更好地了解腫瘤轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性和評估腫瘤的治療效果，還為治療后的反應(yīng)提供了科學(xué)依據(jù)。同時(shí)CTCs不僅可以作為參與卵巢癌血行轉(zhuǎn)移的途徑，也有評估預(yù)后或預(yù)測生物標(biāo)志物的作用。Caixeiro等[31]的研究表明，血液中高水平的CTCs與結(jié)直腸癌、乳腺癌和前列腺癌的疾病進(jìn)展與預(yù)后相關(guān)。而有薈萃分析顯示，卵巢癌患者CTCs陽性計(jì)數(shù)與患者的總生存期、無進(jìn)展生存期及卵巢癌的分期相關(guān)[32-35]。莫美絨等[36]采用CellSearch系統(tǒng)檢測了56例卵巢癌患者術(shù)前血液中的CTCs，結(jié)果顯示，CTCs陽性計(jì)數(shù)與腫瘤的分化程度、分期、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)情況獨(dú)立相關(guān)，且CTCs陽性組患者5年生存率低于陰性組(47.62%比91.43%，P=0.032)。Pearl等[22]研究表明，iCTCs陽性的EOC早期患者的總生存期和無進(jìn)展生存期與晚期患者比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)，iCTCs陽性計(jì)數(shù)≥5個(gè)/mL患者的總生存期和無進(jìn)展生存期均明顯低于iCTCs陽性計(jì)數(shù)<5個(gè)/mL的患者。此外該研究發(fā)現(xiàn)，在不同腫瘤分期、殘余病灶的大小及對鉑類化療藥物敏感的患者中，與糖類抗原125相比，iCTCs在判斷患者的總生存期和無進(jìn)展生存期方面準(zhǔn)確性更高，提示iCTCs陽性計(jì)數(shù)的升高與預(yù)后不良有關(guān)。一項(xiàng)針對2 000例EOC患者血液中CTCs的存在能否顯示微小殘留病灶的研究表明，CTCs陽性患者的總生存期較CTCs陰性患者短[37]。Obermayr等[37]的多中心研究顯示，在術(shù)后經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)6個(gè)月化療的患者中，存在缺氧誘導(dǎo)基因且CTCs陽性患者的無病生存期及總生存期均短于缺乏缺氧誘導(dǎo)基因且CTCs陽性的患者，表明患者的CTCs狀態(tài)與無病生存期和總生存期緊密相關(guān)。Chebouti等[38]在基因水平研究了卵巢癌患者手術(shù)前和鉑類藥物化療后上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的CTCs發(fā)生率，而與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄物包括磷脂酰肌醇-3-激酶和絲氨酸/蘇氨酸蛋白-2激酶，結(jié)果表明磷脂酰肌醇-3-激酶陽性的CTCs患者總生存期和無進(jìn)展生存期顯著降低，且在手術(shù)后有殘余癌灶的患者中，可以觀察到上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化樣CTCs。上述結(jié)果均表明，CTCs的計(jì)數(shù)及狀態(tài)在評估卵巢癌預(yù)后方面有顯著優(yōu)越性。

6 展 望

CTCs是腫瘤細(xì)胞，其與原發(fā)性腫瘤分離并進(jìn)入血流。CTCs不與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合，且其由于失巢凋亡的抗性而在血流中存活，每107個(gè)血液元素大約存在1個(gè)腫瘤細(xì)胞，比較罕見。由于CTCs具有監(jiān)測創(chuàng)傷性小、可連續(xù)監(jiān)測等特點(diǎn)，故可為卵巢癌的治療和預(yù)后提供相關(guān)信息。細(xì)胞角蛋白、上皮細(xì)胞細(xì)胞黏附分子、切除修復(fù)交叉互補(bǔ)蛋白1等均為卵巢癌CTCs的分子標(biāo)志物，這些分子標(biāo)志物為卵巢癌的早期篩查、精準(zhǔn)化治療、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的判斷、尋找耐藥性的原因、評估卵巢癌術(shù)后或放化療的療效及預(yù)后提供了重要的理論依據(jù)。此外，CTCs的檢測為更好地理解細(xì)胞間的相互轉(zhuǎn)移提供了依據(jù)，對抗性遺傳改變的實(shí)時(shí)檢測過程提供了良好的參考價(jià)值。但由于可用樣品的量有限，缺乏統(tǒng)一檢測方法、參考標(biāo)準(zhǔn)及費(fèi)用昂貴，CTCs的檢測仍具挑戰(zhàn)性，故其在臨床婦科腫瘤方面尚未廣泛應(yīng)用。針對目前CTCs的分離、富集與鑒定方法仍不能滿足臨床工作的需要，故未來需進(jìn)一步提高CTCs檢測的敏感性和特異性，從而提高CTCs對卵巢癌的早期診斷價(jià)值；同時(shí)，希望以后有更多大規(guī)模的前瞻性研究來提高CTCs的生物學(xué)特性，以支持CTCs在卵巢癌的個(gè)體化治療和預(yù)后評估及復(fù)發(fā)方面的臨床價(jià)值。