張文娟，李莉娟，趙葉梅，張連生

(蘭州大學第二醫(yī)院血液科，蘭州 730030)

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)是皰疹病毒科γ亞科嗜B淋巴細胞組群中的雙股DNA病毒，與傳染性單核細胞增多癥、嗜血細胞綜合征等疾病密切相關。EBV是人類發(fā)現的第一個致癌病毒，屬于Ⅰ類致癌物質。EBV感染人體后，T淋巴細胞不能立即識別，因病毒具有嗜B細胞的特點，故EBV可潛伏在B淋巴細胞中，刺激細胞增殖、惡性轉化等。EBV感染可導致機體罹患鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、胃癌等惡性腫瘤。程序性細胞死亡配體 1(programmed cell death-ligand 1，PD-L1)是免疫檢查點中關鍵的負性調控分子，其表達上調有助于腫瘤細胞的免疫逃逸，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究顯示，在惡性腫瘤中PD-L1的表達水平與EBV感染相關[1]?，F就PD-L1的表達與EBV感染相關性的研究進展進行綜述。

1 PD-L1概述

PD-L1，也稱CD274、B7-H1，是1999年發(fā)現的負性共刺激分子，屬于B7/CD28 超家族成員，是程序性細胞死亡受體1(programmed cell death receptor 1，PD-1)的配體之一[1]。PD-L1是由胞外段的IgV和IgC兩個胞外結構域、中間疏水跨膜區(qū)以及胞內段的30個氨基酸組成的Ⅰ型跨膜糖蛋白，含有290個氨基酸殘基[2]。PD-L1表達于鼠源T、B細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞(dendritic cell，DC)及經骨髓間充質干細胞培養(yǎng)的骨髓細胞上。雖然PD-L1的信使RNA可在骨骼肌、肺組織及胎盤等健康組織中檢測到，但PD-L1蛋白很少在正常組織中檢測到[3]，表明蛋白表達受信使RNA轉錄后調控。PD-L1主要在抗原呈遞細胞如吞噬細胞、DC上表達[4]，也能在非造血細胞中表達，如內皮細胞、胰島細胞及上皮細胞等，可使細胞免除免疫介導的損傷，從而保護組織[5]。在免疫正常的機體中，PD-L1在保持免疫耐受與保護性免疫的協(xié)調中起著極其重要的作用。

PD-1是一個跨膜蛋白受體，胞質區(qū)尾部包含一個免疫受體酪氨酸抑制基序和一個免疫受體酪氨酸轉化基序，后者是PD-1發(fā)揮負性調控作用的關鍵部位。PD-1主要表達于T細胞、B細胞、單核細胞、自然殺傷細胞及DC[5]。PD-1與PD-L1結合后，可抑制T細胞的增殖，并可誘使抗原特異性T淋巴細胞凋亡，還能促使初始CD4+T細胞向調節(jié)性T細胞轉化[6]。PD-1與PD-L1的相互作用可使PD-1胞質區(qū)域的免疫受體酪氨酸抑制基序和轉化基序的氨基酸結構域出現磷酸化，可招募含SH2結構域的酪氨酸磷酸酶2，通過去磷酸化抑制下游T細胞受體信號，阻斷T細胞活化，抑制效應細胞增殖、細胞周期生存基因表達以及白細胞介素-2等細胞因子釋放[7-8]，抑制磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)通路，抑制糖酵解，促進脂肪酸氧化，從而影響細胞代謝，進一步抑制T細胞的增殖活化及功能失調[9-10]。

PD-L1在肺癌[11]、卵巢癌[12]、黑色素瘤[13]、乳腺癌[14]、腎細胞癌[15]、胃癌[16]、淋巴瘤[17]等多種腫瘤組織中的表達上調。在惡性腫瘤中，PD-L1表達的上調能使腫瘤反應性T淋巴細胞群功能減弱，抑制T細胞活化，有助于腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視，促進腫瘤細胞的生長增殖[18]。

PD-L1在惡性腫瘤中表達的上調主要由兩種機制介導，一種是通過信號通路調節(jié)，另一種是腫瘤微環(huán)境通過分泌細胞因子及促炎因子等調節(jié)，這兩種機制存在相關性。抑癌基因第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(phosphates and tensin homologue on chromosome 10 gene，PTEN)是PI3K/Akt信號通路的負性調控分子，當PTEN基因缺失或突變時會導致該通路的過度激活[19]，從而導致PD-L1表達上調[20]。Janus激酶 (Janus kinase，JAK) /信號轉導及轉錄激活因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)信號通路的異常調節(jié)可通過激活上游間變性淋巴瘤激酶導致STAT3高表達，從而上調PD-L1的表達；表皮生長因子受體活化結合下游信號轉導通路、Toll樣受體4激活促分裂原活化的蛋白激酶信號通路均可使PD-L1的表達上調[21-22]。細胞因子中腫瘤壞死因子-α、γ干擾素通過激活核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)介導PD-L1的表達[23]。有研究表明，在腫瘤中缺氧誘導因子1α介導的缺氧狀態(tài)可使髓源性抑制細胞、DC、巨噬細胞以及腫瘤細胞上PD-L1的表達上調，并且腫瘤細胞對細胞毒性T細胞作用的耐受性增加[24]。PD-L1在腫瘤中的高表達與腫瘤細胞的增殖分化、侵襲轉移及不良預后有顯著的相關性。

目前針對PD-1/PD-L1相關靶點的藥物已進入臨床治療階段，并且越來越多的PD-1/PD-L1免疫檢查點抑制劑進入了臨床試驗階段。在非小細胞肺癌、黑色素瘤、腎細胞癌、宮頸癌、膀胱癌、皮膚鱗狀細胞癌等疾病中，PD-1/PD-L1免疫檢查點抑制劑療效顯著，且安全性良好。目前已經上市的PD-1/PD-L1單克隆抗體有Nivolumab、Atezolizumab、Pembrolizumab、Avelumab、Durvalumab，以及近期上市的Cemiplimab，尚未上市的有KN035、M7824等單抗。

2 PD-L1表達水平與EBV感染相關腫瘤

2.1EBV相關鼻咽癌 研究表明，EBV相關惡性腫瘤中PD-L1的表達水平升高[25]。鼻咽癌是EBV感染相關性惡性腫瘤之一，與其他頭頸部腫瘤相比，鼻咽癌具有較高的轉移潛能[25]。Fang等[25]發(fā)現，PD-L1在EBV感染的鼻咽癌中表達上調，PD-L1的蛋白及基因表達水平與EBV-DNA拷貝數呈正相關，這與在乙型肝炎病毒相關性肝癌[26]、人乳頭瘤病毒陽性頭頸鱗狀細胞癌[27]等感染相關性腫瘤中的研究結果相似。以上研究提示，感染相關性腫瘤可通過上調PD-L1的表達幫助腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視。

2.2EBV相關霍奇金淋巴瘤 經典型霍奇金淋巴瘤(classic Hodgkin lymphoma，cHL) 是一種具有不同亞型、不同臨床特征及病理特征的惡性腫瘤。在組織學上，cHL可分為淋巴細胞消減型、混合細胞型、結節(jié)硬化型和富于淋巴細胞型，EBV感染常見于混合細胞型(約75%)、結節(jié)硬化型(10%～40%)[28]。在cHL中，EBV參與支持腫瘤細胞生長和存活的慢性炎性微環(huán)境。研究表明，EBV陽性cHL中PD-L1的表達水平較EBV陰性cHL更高，提示病毒感染上調了PD-L1的表達[29]。在EBV相關cHL中，腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞包括大量的CD4+CD25+調節(jié)性T細胞，PD-L1表達的增高可參與促進調節(jié)性T細胞的生成[30]，PD-L1不僅有助于腫瘤細胞逃避免疫系統(tǒng)的攻擊，還為腫瘤細胞的生長和存活提供支持。研究發(fā)現，與EBV無關cHL腫瘤微環(huán)境相比，EBV相關cHL腫瘤微環(huán)境中巨噬細胞的數量更多[31]。

2.3EBV相關胃癌 腫瘤基因組圖譜將胃癌分為EBV感染型、基因組穩(wěn)定型、微衛(wèi)星不穩(wěn)定型和染色體不穩(wěn)定型4型。EBV感染型胃癌約占所有胃癌的10%，50%以上的EBV感染型胃癌中存在PD-L1的過表達[32]。在EBV感染型胃癌中，PD-L1陽性者預后較陰性者差[33]。EBV感染型胃癌中多見浸潤性淋巴細胞，且大部分存在CD8+T細胞在腫瘤組織的浸潤，而CD8+T細胞浸潤現象與PD-L1的表達相關[33]。有研究認為，EBV感染型胃癌患者的總體預后較好與淋巴細胞浸潤增多有關[34]。

2.4EBV相關其他惡性腫瘤 移植后淋巴細胞增殖性疾病(post-transplantation lymphoproliferative diseases，PTLD)是器官移植或造血干細胞移植后因機體免疫缺陷而引起的淋巴細胞異常增殖性疾病，患者預后較差，其發(fā)病機制與EBV感染導致的B細胞異常增殖及轉化等相關[35]。Green等[36]研究發(fā)現，70%以上的EBV相關PTLD的惡性B細胞上表達PD-L1。在嚴重免疫功能低下的人群中，EBV是腫瘤生長的主要驅動因素。自然殺傷/T細胞淋巴瘤(natural killer/T-cell lymphoma,NKTCL)是一種與EBV相關的高侵襲性淋巴瘤。Bi等[37]研究發(fā)現，NKTCL中PD-L1基因和蛋白的表達水平與EBV基因的表達產物潛伏膜蛋白1(latent membrane protein 1，LMP-1)的表達呈正相關，且腫瘤組織中PD-L1的表達水平及血清可溶性PD-L1的水平與早期NKTCL患者的生存期相關，PD-L1的過表達會對早期NKTCL患者的生存產生負面影響。

3 EBV相關腫瘤中PD-L1表達調控機制

在EBV相關惡性腫瘤中，PD-L1的表達上調，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，且與患者預后相關。因此，研究PD-L1在EBV相關腫瘤中表達調控的機制，對于闡明EBV相關腫瘤免疫逃逸的機制以及尋找腫瘤免疫治療的新途徑具有重要意義。

3.1LMP-1調控PD-L1的表達 研究表明，EBV通過將病毒成分分泌到外泌體中，介導腫瘤微環(huán)境的改變，包括促血管生成、免疫抑制及促進腫瘤細胞生長等[38]。EBV感染相關的鼻咽癌中，腫瘤細胞所產生的外泌體中含有EBV基因表達的產物LMP-1，鄰近細胞的關鍵信號通路可被LMP-1激活，提示經由病毒修飾后的外泌體可能具有信使的作用[39-40]。LMP-1基因是EBV重要的致癌基因，可促進細胞的增殖、遷移，參與介導細胞的惡性轉化[29]。

在EBV感染相關的鼻咽癌中，LMP-1參與PD-L1的調控。LMP-1水平升高可顯著增加STAT3、NF-κB和核轉錄因子激活蛋白1的活性，改變參與細胞增殖、抗凋亡以及誘導侵襲的關鍵蛋白的表達水平，最終導致腫瘤的發(fā)生。PD-L1在EBV陽性鼻咽癌細胞系中的表達與LMP-1表達呈正相關，而且無論是外源性LMP-1的過度表達還是誘導內源性LMP-1的表達均能顯著增加PD-L1的表達[25]。JAK3抑制劑CP-690550能夠抑制JAK3的磷酸化，使STAT3磷酸化水平下調，導致LMP-1誘導的PD-L1表達水平明顯下降[41]。以上研究表明JAK3/STAT3通路在LMP-1介導的PD-L1表達中起關鍵作用。

在EBV相關cHL中，LMP-1可通過激活多種信號通路如NF-κB、JAK/STAT和PI3K/Akt等保證腫瘤細胞的存活[30]，而在惡性腫瘤中這些信號通路的異常激活參與介導PD-L1表達的上調。LMP-1可誘導B細胞內膠原受體、酪氨酸激酶受體以及盤狀結構域受體1(discoidin domain receptor 1，DDR1)表達。DDR1與膠原結合后，DDR1磷酸化激活下游信號通路NF-κB[42]，DDR1激活信號通路參與腫瘤的發(fā)生和炎癥浸潤的發(fā)展。在EBV相關的cHL中，LMP-1上調DDR1，并與活化的DDR1和腫瘤細胞CD40信號一起調控NF-κB信號通路[43]。

在EBV相關cHL和PTLD中，LMP-1可通過核轉錄因子激活蛋白1和JAK/STAT途徑使PD-L1的表達上調。激活蛋白1由c-Jun和c-Fos組成，是胞外信號調節(jié)激酶1/2下游重要的靶信號分子。在cHL中腫瘤細胞高表達c-Jun，而特異性抑制c-Jun的活性則降低了PD-L1的表達[36]。在NKTCL中，EBV感染可能通過LMP-1抗原上調PD-L1在腫瘤細胞上的表達，從而誘導免疫耐受，促分裂原活化的蛋白激酶和NF-κB通路可能參與LMP-1誘導的 PD-L1表達上調[37]。

3.2γ干擾素調控PD-L1表達 在EBV相關惡性腫瘤中，除LMP-1外還發(fā)現了PD-L1上調的另一機制。既往研究發(fā)現，通過抗腫瘤和(或)抗病毒免疫反應上調了炎癥因子的水平，腫瘤細胞本身可能利用這些免疫反應逃避免疫監(jiān)視，在這些炎癥因子中，γ干擾素是調節(jié)PD-L1表達最常見的因子[44]。

γ干擾素通過JAK/STAT信號途徑啟動干擾素調節(jié)因子-1(interferon regulatory factor-1，IRF-1)的合成，從而在轉錄水平調節(jié)PD-L1的表達，IRF-1是一種在PD-L1啟動子上有兩個結合位點的轉錄因子[2]。研究發(fā)現，鼻咽癌患者血清γ干擾素的水平與EBV負荷呈正相關，γ干擾素可顯著增加鼻咽癌腫瘤細胞上PD-L1的表達，而與LMP-1無關；用γ干擾素處理的鼻咽癌細胞株PD-L1的表達水平升高[25]。另一種調控PD-L1表達的轉錄后機制涉及miR-513，其與PD-L1基因的3′非編碼區(qū)互補，γ干擾素治療可降低miR-513的水平，從而上調PD-L1 信使RNA的表達[45]。在EBV感染型胃癌中，γ干擾素也可通過激活JAK2/STAT1/IRF-1信號通路進而導致PD-L1的過表達[32]。此外，γ干擾素誘導的IRF-1可與EBV感染型胃癌細胞中PD-L1啟動子的IRF-1α序列結合[32]。

以上研究提示，LMP-1致癌途徑介導的固有免疫反應和γ干擾素等炎癥信號參與的適應性免疫反應是調節(jié)PD-L1在EBV相關惡性腫瘤中表達的兩種協(xié)同作用的機制。

3.3EBV核抗原1(EBV nuclear antigen 1，EBNA1)調控PD-L1表達 EBNA1是維持EBV基因組所必需的一種病毒核蛋白，其作用是阻止細胞毒性T淋巴細胞對表達EBNA1的腫瘤細胞的免疫識別[46]。研究發(fā)現，EBNA1幾乎在所有EBV感染型胃癌中表達，PD-L1的表達與EBNA1相關[32]。EBNA1通過上調和激活JAK2，增強γ干擾素介導的PD-L1表達，EBNA1 基因敲除后降低了JAK2的轉錄和蛋白水平，進而降低了STAT1/IRF-1/PD-L1通路的信號轉導，從而降低了γ干擾素誘導的PD-L1啟動子活性[32]。

3.49p24.1基因擴增調控PD-L1的表達 EBV感染可增強9號染色體上p24.1基因片段的擴增(9p24.1擴增)，這是霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、小細胞肺癌等腫瘤的重要遺傳機制[47-48]。染色體9p24.1的最短擴增片段是770 kb，其上包括PD-L1、PD-L2及JAK2等基因。由于9p24.1拷貝增加，PD-L1 和PD-L2在多數腫瘤患者中高表達，JAK2蛋白表達增加及JAK/STAT信號轉導通路異常激活又進一步使PD-L1的表達增高[49]，PD-L1、PD-L2參與介導腫瘤細胞逃避機體免疫監(jiān)視，推測可能與EBV的致癌作用密切相關。

在cHL中，9p24.1基因擴增可調控PD-L1的表達。9p24.1擴增區(qū)也包括JAK2位點，JAK2擴增可增強JAK2的表達、增強JAK/STAT信號及相關的PD-L1啟動子活性和轉錄[36]。PD-L1所在的基因改變與預后相關，一項納入108例初診霍奇金淋巴瘤患者的研究顯示，97%的患者基因拷貝增加或基因擴增調控PD-L1所在的基因狀態(tài)，并與PD-L1 蛋白的過表達相關，9p24.1擴增的患者疾病無進展生存期縮短[47]。

3.5磷脂酰肌醇3-激酶催化亞單位α(phosphatidy-linositol 3-kinase catalytic subunit alpha,PIK3CA)基因突變調控PD-L1表達 EBV感染型胃癌中PIK3CA基因突變率較高[50]，攜帶PIK3CA基因突變的EBV感染型胃癌病變部位多位于胃體中部[51]。研究表明，PIK3CA基因突變可能發(fā)生在機體感染EBV前，在EBV感染機體后，EBV蛋白產物增強之前突變的PIK3CA基因使PI3K/Akt信號通路異常激活，導致PD-L1表達上調，從而有助于腫瘤細胞免疫逃逸，進而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[52]。

4 小 結

PD-L1是免疫檢查點中關鍵的負性調控分子，其表達上調有助于腫瘤細胞的免疫逃逸，以促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。近年來研究發(fā)現[25,29,32]，在EBV感染相關的多種惡性腫瘤中，PD-L1的表達水平進一步上調，提示PD-L1表達上調可能與EBV感染相關，推測EBV相關腫瘤在免疫檢查點抑制劑治療中可能更易獲益，但目前研究免疫檢查點抑制劑在EBV相關與非EBV相關惡性腫瘤中存在療效差異的報道較少見。未來應進一步深入研究PD-L1在EBV相關腫瘤中的具體調節(jié)機制，以期為EBV相關腫瘤患者的治療提供新思路及篩選免疫治療獲益人群。