趙健楠，范 瑩，吳碩東

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院普外二科，沈陽 110004)

西方成年人群膽囊膽固醇結(jié)石(cholesterol gallstone，CG)的發(fā)病率為10%～15%[1]。中國(guó)人群CG的發(fā)病率為4.42%～11%，呈顯著上升趨勢(shì)[2]。CG的病因復(fù)雜，主要包括膽汁膽固醇過飽和、膽固醇晶體析出過程加速及膽囊動(dòng)力障礙等，其中膽囊動(dòng)力障礙是CG形成的關(guān)鍵因素。研究表明，膽囊運(yùn)動(dòng)障礙為膽汁析出和膽固醇結(jié)晶提供了空間與時(shí)間[3]。至今，對(duì)膽囊動(dòng)力調(diào)控的研究大多集中于對(duì)膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK)敏感性下降、膽囊平滑肌功能減退、CCK受體功能失調(diào)以及肝外膽道系統(tǒng)調(diào)節(jié)功能紊亂等方面。研究發(fā)現(xiàn)，消化道Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial Cajal cell，ICC)廣泛存在于人類及其他哺乳動(dòng)物消化道中[4-5]。有學(xué)者將消化道外器官分布的ICC命名為Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞(interstitial Cajal-like cell，ICLC)，另有學(xué)者為區(qū)別于其他間質(zhì)細(xì)胞，也將ICLC稱為特絡(luò)細(xì)胞[6]。Lavoie等[7]在豚鼠膽囊中發(fā)現(xiàn)了ICLC。Pasternak等[8]在人體膽囊組織中發(fā)現(xiàn)了ICLC，并認(rèn)為其與膽囊產(chǎn)生和傳播自發(fā)性節(jié)律有關(guān)。近年來，膽囊ICLC的功能及其與CG形成的關(guān)系成為研究熱點(diǎn)?，F(xiàn)就ICLC與CG形成的關(guān)系予以綜述，以期為深入研究ICLC功能以及CG的病因提供參考。

1 膽囊ICLC的概述

1.1膽囊ICC/ICLC的發(fā)現(xiàn) ICLC最早由西班牙神經(jīng)解剖學(xué)家Santiago Ramony Cajal在動(dòng)物消化道中發(fā)現(xiàn)，隨后有研究在膽囊組織中發(fā)現(xiàn)了類似細(xì)胞[7-8]。Sun等[9]采用透射電子顯微鏡成像、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)及蛋白質(zhì)印跡法等技術(shù)對(duì)鼠類膽囊的研究發(fā)現(xiàn)，鼠類膽囊中的ICLC呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且存在豐富的核周內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體、線粒體等。Lavoie等[7]利用免疫組織化學(xué)、透射電子顯微鏡及激光共聚焦影像技術(shù)在豚鼠膽囊及膽道系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)了與胃腸道ICC相似并沿膽囊平滑肌肌束和神經(jīng)纖維走行的ICLC，研究還發(fā)現(xiàn)膽囊肌層的自發(fā)性節(jié)律性電活動(dòng)可以被Kit受體酪氨酸激酶抑制劑阻斷，表明ICLC在膽囊肌層節(jié)律性興奮的產(chǎn)生和傳導(dǎo)中起重要作用。

1.2ICC/ICLC的特異性標(biāo)志物 對(duì)ICC的早期研究常采用甲基藍(lán)、嗜銀染色、Champy-Maillet法等方法觀察ICC形態(tài)和分布，但特異性不高[4]。近年來，ICC基因表達(dá)產(chǎn)物c-kit(CD117)成為目前公認(rèn)的ICC特異性標(biāo)志物[10]。通過特異性更高的c-kit抗體免疫組織化學(xué)染色法對(duì)其進(jìn)行深入研究。

1.3ICC/ICLC與干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)/c-kit信號(hào)通路的關(guān)系 ICC表達(dá)特異性標(biāo)志物酪氨酸激酶受體c-kit，其配體為SCF。SCF/c-kit信號(hào)通路在ICC的發(fā)育、分化及表型維持中起重要作用。c-kit發(fā)生自發(fā)性突變或應(yīng)用c-kit抗體阻斷c-kit的作用，均可引起c-kit活力顯著下降，導(dǎo)致ICC無法正常發(fā)生及發(fā)育。將c-kit中和抗體ACK-Ⅱ注射至新出生小鼠腹腔的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腸道正常位相收縮紊亂、慢波活動(dòng)消失，ICC缺失[11]。此外，ICC培養(yǎng)微環(huán)境中足量SCF對(duì)ICC的發(fā)生、發(fā)育及表型維持也至關(guān)重要[12]。

目前，主要研究的c-kit/SCF下游通路是SFK(Src家族激酶)途徑、磷脂酰肌醇-3-激酶途徑、磷脂酶C途徑、Ras/Raf-1/MAP途徑、Jak-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，以上途徑在ICC發(fā)育、表型維持和功能調(diào)控中的作用有待進(jìn)一步研究。

1.4ICC/ICLC的功能 ICC在消化系統(tǒng)中主要具有起搏平滑肌動(dòng)力、推進(jìn)電活動(dòng)傳播以及介導(dǎo)和調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)等功能[13]。研究發(fā)現(xiàn)，ICC/ICLC數(shù)量減少可能與多種疾病相關(guān)，如空腸節(jié)段性擴(kuò)張[14]、胃輕癱[15]、腹裂相關(guān)腸動(dòng)力障礙[16]等。

1.4.1起搏慢波電位 胃腸道平滑肌有慢波和功能性兩種電位，慢波電位又稱基本電節(jié)律。ICC作為胃腸道的節(jié)律起搏點(diǎn)，具有維持周期、自發(fā)性去極化及產(chǎn)生慢波電位等特點(diǎn)[17]。有研究顯示，移除ICC的平滑肌組織完全或幾乎完全失去慢波電位[18]。Balemba等[19]的研究表明，ICLC作為膽囊收縮節(jié)律的起搏細(xì)胞，參與慢波電位的產(chǎn)生。Fan等[20]發(fā)現(xiàn)，ICLC受損的膽囊肌條中，慢波的幅度和頻率均明顯下降，提示ICLC在膽囊平滑肌節(jié)律性興奮的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。

1.4.2慢傳導(dǎo)波電位 縫隙連接將ICC與神經(jīng)元及平滑肌細(xì)胞廣泛連接，構(gòu)成細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。移除小腸平滑肌遠(yuǎn)端ICC并保留近端ICC的研究顯示，近端可觀察到慢波電位，而遠(yuǎn)端慢波電位消失，提示ICC是慢波電位傳導(dǎo)的基礎(chǔ)，平滑肌細(xì)胞間不能傳導(dǎo)慢波電位[21]。目前認(rèn)為，慢波電位通過ICC網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)在平滑肌細(xì)胞間轉(zhuǎn)導(dǎo)，并可調(diào)節(jié)平滑肌的收縮[22]。

1.4.3介導(dǎo)神經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) ICC/ICLC可能還與神經(jīng)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，ICC位于自主神經(jīng)元末端與肌細(xì)胞之間，與外部神經(jīng)元形成類似于經(jīng)典突觸的連接，此結(jié)構(gòu)具有與興奮性神經(jīng)元釋放的速激肽配位的受體，并對(duì)抑制性神經(jīng)元釋放的一氧化氮敏感[23]。Faussone-Pellegrini[24]通過精確測(cè)量發(fā)現(xiàn)，ICC與平滑肌細(xì)胞以及神經(jīng)細(xì)胞之間的連接距離僅為20～30 nm，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于通常神經(jīng)-肌肉細(xì)胞的連接間隙(50～100 nm)，提示ICC可能在神經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。

2 膽囊ICLC變化與膽囊動(dòng)力障礙的關(guān)系

2.1ICLC丟失導(dǎo)致膽囊動(dòng)力障礙 膽囊ICLC數(shù)量減少可減弱其在膽囊動(dòng)力調(diào)節(jié)機(jī)制中的作用，導(dǎo)致膽囊動(dòng)力障礙。Pasternak等[25]的研究發(fā)現(xiàn)，與需手術(shù)切除膽囊的非膽囊結(jié)石患者相比，膽囊結(jié)石患者膽囊肌層ICLC數(shù)量顯著下降。臺(tái)劍熊等[26]的研究發(fā)現(xiàn)，與非膽囊結(jié)石人群相比，膽囊結(jié)石患者的膽囊收縮率及膽囊ICLC數(shù)量均顯著降低。Huang等[27]將30只豚鼠分為高膽固醇飲食的實(shí)驗(yàn)組和標(biāo)準(zhǔn)飲食對(duì)照組，CG形成過程中，膽囊頸至膽囊底部ICLC數(shù)量明顯減少，凋亡數(shù)量顯著上升，表明ICLC數(shù)量可能影響膽囊ICLC的功能。彭雅亞和譚宇彥[28]的研究顯示，膽囊結(jié)石患者平滑肌中ICLC的數(shù)量較正常人群明顯減少，但目前膽囊結(jié)石形成過程中ICLC減少的具體原因尚不確定。有研究認(rèn)為，膽囊結(jié)石形成過程中ICLC減少可能與ICC表型轉(zhuǎn)化有關(guān)[29]。目前認(rèn)為，氧化應(yīng)激反應(yīng)、c-kit/SCF通路抑制、膽汁組成成分變化以及炎癥反應(yīng)是CG形成過程中ICLC丟失的主要原因。

2.1.1氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致ICLC丟失 CG形成過程中，膽囊組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)可能導(dǎo)致ICLC凋亡，數(shù)量下降。譚宇彥和嵇振玲[30]通過構(gòu)建CG模型兔的研究發(fā)現(xiàn)，與正常飲食兔相比，CG模型兔膽囊ICLC數(shù)量明顯減少，且ICLC超微結(jié)構(gòu)改變，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞；進(jìn)一步將ICLC置于不同膽固醇濃度細(xì)胞培養(yǎng)液的研究發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)液膽固醇濃度的逐漸升高，ICLC抗氧化應(yīng)激指標(biāo)超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活力逐漸下降，各組ICLC凋亡率明顯升高，兩者均呈劑量依賴性。在相同膽固醇濃度培養(yǎng)液中加入不同濃度膽固醇清除劑發(fā)現(xiàn)，ICLC抗氧化應(yīng)激指標(biāo)超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活力逐漸升高，且 ICC凋亡率逐漸下降，提示CG形成過程中，膽固醇濃度升高可誘發(fā)膽囊組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，使ICLC不斷凋亡，導(dǎo)致膽囊ICLC數(shù)量顯著減少。但Kaji等[31]對(duì)于鼠類空腸ICC的研究顯示，由γ干擾素及脂多糖介導(dǎo)的ICC功能障礙在很大程度上由一氧化氮誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)所致，一氧化氮通路只降低ICC標(biāo)志物的表達(dá)，并不破壞ICC超微結(jié)構(gòu)，也不導(dǎo)致ICC凋亡。因此，氧化應(yīng)激反應(yīng)與膽囊動(dòng)力障礙的關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究。

2.1.2c-kit/SCF通路抑制導(dǎo)致ICLC丟失 高膽固醇濃度可抑制c-kit/SCF通路，影響ICLC發(fā)育，使ICLC數(shù)量下降。Tan等[32]測(cè)定18例行腹腔鏡膽囊切除術(shù)患者(試驗(yàn)組)和14例行手術(shù)治療胰頭腫瘤患者(對(duì)照組)術(shù)前超聲膽囊排空分?jǐn)?shù)的研究發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組膽囊排空分?jǐn)?shù)低于對(duì)照組；利用免疫組織化學(xué)法觀察膽囊標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組患者膽囊ICLC數(shù)量明顯降低；利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)及蛋白質(zhì)印跡法對(duì)膽囊標(biāo)本的研究發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組患者膽囊信使RNA及蛋白質(zhì)水平的c-kit/SCF表達(dá)均明顯下降，表明下調(diào)c-kit/SCF信號(hào)通路對(duì)減少膽囊ICLC數(shù)量具有關(guān)鍵作用。Fan等[20]研究發(fā)現(xiàn)，高膽固醇飲食動(dòng)物模型的c-kit及SCF表達(dá)水平均明顯下降，表明高膽固醇飲食可能通過影響ICLC發(fā)育致ICLC受損。Feng等[33]將45只豚鼠等分為標(biāo)準(zhǔn)飲食組、高膽固醇飲食組及茵陳蒿處理組的研究發(fā)現(xiàn)，與茵陳蒿處理組相比，高膽固醇飲食組 c-kit 表達(dá)及膽囊動(dòng)力均明顯下降，提示茵陳蒿可通過上調(diào)c-kit表達(dá)保護(hù)膽囊動(dòng)力。另有研究顯示，多能干細(xì)胞對(duì)消化系統(tǒng)受損ICC具有修復(fù)作用，并可促進(jìn)其發(fā)生、發(fā)育，有助于ICC功能恢復(fù)，為細(xì)胞學(xué)層面膽囊結(jié)石及消化道疾病的研究提供新的治療靶點(diǎn)[34]。

2.1.3膽汁組成成分變化導(dǎo)致ICLC丟失 不同膽汁組成成分可影響膽囊ICLC數(shù)量。Pasternak等[35]對(duì)30例因CG行腹腔鏡膽囊切除術(shù)患者(試驗(yàn)組)和25例因其他疾病切除膽囊患者(對(duì)照組)的研究發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組膽囊組織ICLC數(shù)量明顯低于對(duì)照組；此外，試驗(yàn)組膽汁甘膽酸和?；悄懰崴捷^對(duì)照組明顯降低，且ICLC數(shù)量與甘膽酸和?；悄懰崴匠烧?，提示膽汁中甘膽酸和牛磺膽酸對(duì)ICLC具有保護(hù)作用。在成石過程中，膽汁甘膽酸和牛磺膽酸水平降低，過飽和膽汁毒性作用使ICLC數(shù)量減少，可見膽汁組成成分對(duì)膽囊ICLC數(shù)量減少起關(guān)鍵作用。Pasternak等[36]對(duì)25例行腹腔鏡膽囊切除術(shù)CG患者(試驗(yàn)組)和15例行手術(shù)治療胰頭腫瘤患者(對(duì)照組)的研究發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組膽囊壁ICLC數(shù)量明顯低于對(duì)照組；進(jìn)一步分析膽汁成分發(fā)現(xiàn)，膽汁結(jié)晶患者膽固醇飽和指數(shù)(表示膽汁成石性)明顯升高，試驗(yàn)組患者膽囊甘膽酸和?；悄懰岬钠骄斤@著降低，且磷脂分?jǐn)?shù)中多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)的水平明顯升高，兩組患者ω-3 PUFA水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但試驗(yàn)組ω-6 PUFA水平及ω-6/ω-3 PUFA比率均明顯升高，提示膽囊固有肌層ICLC數(shù)量與總PUFA、ω-6 PUFA水平以及ω-6/ω-3 PUFA比率可能存在潛在關(guān)聯(lián)。

有研究顯示，高攝入量飽和脂肪酸及反式脂肪酸可導(dǎo)致膽囊結(jié)石的發(fā)生[37-38]，而高攝入量的PUFA及單不飽和脂肪酸則可降低膽囊結(jié)石的患病風(fēng)險(xiǎn)[39]。研究表明，膽囊結(jié)石患者膽汁ω-6 PUFA的升高是影響膽囊ICLC密度的重要因素，可能是CG發(fā)展的病理生理學(xué)因素之一。過飽和膽汁的毒性作用可能導(dǎo)致ICLC數(shù)量降低，而其他膽汁成分，如ω-3 PUFA、甘膽酸與?；悄懰岬葘?duì)ICLC具有保護(hù)作用，可能是影響膽囊及肝外膽管動(dòng)力調(diào)節(jié)機(jī)制的因素。

2.1.4炎癥反應(yīng)致ICLC丟失 膽囊壁的慢性炎癥過程可能是ICLC數(shù)量減少的重要機(jī)制之一。邱虎等[40]對(duì)急性膽囊炎模型的研究發(fā)現(xiàn)，與正常膽囊相比，急性膽囊炎模型膽囊各部位ICC的數(shù)量均減少。研究表明，與高膽固醇飲食組相比，可通過降低熊去氧膽酸處理組腫瘤壞死因子-α水平以及減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)保護(hù)膽囊ICLC，可見過飽和膽汁及疏水膽汁酸可促進(jìn)膽囊的炎癥作用，腫瘤壞死因子-α的釋放可激發(fā)腫瘤壞死因子-α/胱天蛋白酶8/胱天蛋白酶3的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)ICLC凋亡[41]。

Portincasa等[42]的研究提示，膽囊動(dòng)力受損是輕度炎癥作用的結(jié)果。炎癥因子通過影響ICC細(xì)胞的微環(huán)境改變其表型，Toll樣受體4、脂多糖及腫瘤壞死因子-α均參與其中[43-44]。此外，Pasternak等[36]發(fā)現(xiàn)，結(jié)石患者膽囊及其固有肌層中存在炎癥浸潤(rùn)，且炎癥浸潤(rùn)與肥大細(xì)胞數(shù)量顯著升高有關(guān)。但Pasternak等[25]的研究發(fā)現(xiàn)，ICLC細(xì)胞減少與炎癥級(jí)別或肥大細(xì)胞數(shù)量無關(guān)。因此，炎癥反應(yīng)與ICLC數(shù)量減少的相關(guān)性有待進(jìn)一步研究確定。

2.2ICLC起搏電位減弱導(dǎo)致膽囊動(dòng)力障礙 胞內(nèi)鈣離子紊亂及炎癥反應(yīng)可引起ICLC起搏電位減弱，最終導(dǎo)致膽囊動(dòng)力障礙。膽囊膽固醇結(jié)石形成過程中，細(xì)胞膜穴樣凹陷中過量的膽固醇可能降低細(xì)胞膜的流動(dòng)性，進(jìn)一步使胞質(zhì)內(nèi)鈣平衡紊亂[45]。有研究證實(shí)，鈣離子在單個(gè)ICC慢波產(chǎn)生中起重要作用，三磷酸肌醇受體在ICC中大量表達(dá)，通過調(diào)節(jié)鈣離子的釋放調(diào)控起搏電流[46]。大量鈣離子是ICLC產(chǎn)生自發(fā)電活動(dòng)的必需物質(zhì)，ICLC細(xì)胞膜與胞質(zhì)內(nèi)鈣平衡紊亂可導(dǎo)致ICLC膜電位擺動(dòng)障礙，影響ICLC的起搏功能[47]。此外，炎癥反應(yīng)也可影響ICC的起搏，Kaji等[31]對(duì)于鼠類空腸ICC的研究顯示，由γ干擾素和脂多糖介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可誘導(dǎo)炎癥前體細(xì)胞因子的表達(dá)，使ICC的起搏活性降低。

2.3ICLC對(duì)CCK反應(yīng)性降低導(dǎo)致膽囊動(dòng)力障礙 CG成石過程中，膽囊ICLC對(duì)CCK的低反應(yīng)性可導(dǎo)致膽囊動(dòng)力下降。Xu等[48]對(duì)豚鼠膽囊的研究表明，膽囊組織中ICLC表達(dá)CCK-A受體；在體外CCK激發(fā)實(shí)驗(yàn)中，膽囊組織對(duì)CCK-A具有明顯的收縮反應(yīng)；而相同條件下，去除ICLC的膽囊組織對(duì)CCK-A的收縮反應(yīng)明顯下降，表明ICLC可能介導(dǎo)CCK對(duì)膽囊組織的收縮作用。Fan等[20]研究證實(shí)，膽囊ICLC在CCK-8引起的膽囊收縮中起關(guān)鍵作用，而結(jié)石膽囊中ICLC數(shù)量下降可能影響CCK對(duì)膽囊組織的收縮作用，導(dǎo)致膽囊運(yùn)動(dòng)障礙。另有研究表明，高膽固醇膽汁可使膽囊CCK-A受體表達(dá)水平下降，提示高膽固醇膽汁可通過下調(diào)ICLC以及平滑肌CCK-A受體的表達(dá)降低膽囊平滑肌對(duì)CCK的反應(yīng)性，導(dǎo)致膽囊動(dòng)力障礙[49]。

3 小 結(jié)

目前，對(duì)CG成因的研究較廣泛，但具體機(jī)制尚未完全闡明[50]。CG的形成由多種因素引起，膽囊動(dòng)力下降是重要因素之一。高膽固醇飲食導(dǎo)致的膽囊動(dòng)力下降可在很大程度上下調(diào)SCF和ICLC表面受體c-kit的水平，導(dǎo)致膽囊ICLC網(wǎng)絡(luò)受損。但高膽固醇飲食調(diào)節(jié)SCF及c-kit表達(dá)的機(jī)制尚不清楚，ICLC數(shù)量減少的機(jī)制及其具體細(xì)胞生物學(xué)變化仍不清楚。CG形成過程中ICLC數(shù)量減少的具體機(jī)制，ICLC的數(shù)量與SCF/c-kit下游通路在分子水平的關(guān)系，ICLC與神經(jīng)調(diào)節(jié)及激素調(diào)節(jié)等具體的作用機(jī)制等均有待進(jìn)一步研究。對(duì)ICLC和CG關(guān)系的研究具有十分廣闊的學(xué)術(shù)前景，可為進(jìn)一步有效預(yù)防和治療CG提供新的切入點(diǎn)。