施 宏，陳書韻，楊 狄，任緒義

(杭州迪安醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，杭州 310000)

腸球菌屬(Enterococcus)細(xì)菌為兼性厭氧的革蘭陽(yáng)性球菌，目前至少由32個(gè)菌種[1]組成，廣泛分布于土壤、水和食物中，也是人、犬、禽、豬、馬等動(dòng)物胃腸道正常菌群之一。糞腸球菌是腸球菌屬中重要的院內(nèi)院外感染致病菌。在需氧革蘭陽(yáng)性球菌中僅次于葡萄球菌[2]，它不僅可引起尿路感染[3]、皮膚軟組織感染[4]，還可引起危及生命的菌血癥[5]、心內(nèi)膜炎等[6]。多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing，MLST)是一種基于核酸序列測(cè)定的細(xì)菌分型方法，通過PCR擴(kuò)增多個(gè)管家基因內(nèi)部片段并測(cè)定其序列，可以用于分析菌株的變異，適合全球不同實(shí)驗(yàn)室之間的流行菌株數(shù)據(jù)分析比較[7]。MLST對(duì)菌株進(jìn)行分型鑒定試驗(yàn)，檢測(cè)流行克隆株的傳播途徑，大范圍長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)追蹤病原菌的遺傳譜的變化具有顯著優(yōu)勢(shì)。對(duì)于細(xì)菌性疾病的監(jiān)測(cè)，了解傳染源、傳播途徑和預(yù)防暴發(fā)性傳染病的發(fā)生有著非常重要的科學(xué)意義[8]。本研究利用多位點(diǎn)序列分型(MLST)對(duì)浙江省臨床分離的74株糞腸球菌菌株進(jìn)行基因分型，了解浙江地區(qū)糞腸球菌的來源和相關(guān)的遺傳背景。探討糞腸球菌的流行變化趨勢(shì)、進(jìn)化特點(diǎn)及耐藥性特征，為本地區(qū)糞腸球菌感染的預(yù)防治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 連續(xù)收集2018年1～8月浙江省10個(gè)城市28家醫(yī)院臨床分離的糞腸球菌，總計(jì)74株。菌株在10個(gè)城市的分布如下：杭州27株，湖州5株，寧波6株，紹興2株，臺(tái)州3株，衢州1株，麗水2株，舟山6株，桐鄉(xiāng)8株，義烏5株，臨安9株。菌株經(jīng)VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析儀鑒定為糞腸球菌后即可采用。

1.2 試劑和儀器 PCR擴(kuò)增儀(杭州郎基科學(xué)儀器有限公司)，全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(上海培清科技有限公司)，Vitek-2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)(Biomérieux)，恒溫金屬浴(杭州博日科技有限公司)，PCR擴(kuò)增試劑盒(Takara)，細(xì)菌培養(yǎng)血平板(Biomérieux)。

1.3 方法

1.3.1 藥敏試驗(yàn)：參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)2018年標(biāo)準(zhǔn)，采用梅里埃Vitek-2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)對(duì)研究菌株進(jìn)行鑒定及藥敏實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)菌核酸抽提：在1.5 ml的EP管中加入300 μl的無菌水，挑取10個(gè)左右的單菌落于EP管內(nèi)，105℃金屬浴煮10 min，12 000 r/min離心3 min，取上清于新的離心管中作為細(xì)菌核酸模板，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 MLST基因檢測(cè)：糞腸球菌的7對(duì)管家基因(aroE，gdh，gki，gyd，pstS，xpt，yqiL)PCR擴(kuò)增所用的引物參照MLST網(wǎng)站(http：//www.mlst.net)提供的資料，設(shè)計(jì)引物后由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；PCR反應(yīng)體系為50 μl：上下游引物濃度均為0.5 pmol/μl，DNA模板為5 μl，10×buffer(含Mg2+)5 μl，dNTP(2.5 mmoL)4 μl，hotTraq酶0.3 μl，ddH2O 34.7 μl。PCR反應(yīng)條件：95℃變性5 min，然后94℃30 s，退火溫度設(shè)為51℃40 s，72℃60 s，共擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。最后72℃再延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后直接送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序采用雙向測(cè)通方法。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 將7個(gè)管家基因序列的測(cè)序結(jié)果在MLST網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得每一管家基因的等位號(hào)碼，綜合所有的等位號(hào)碼來確定序列型，同時(shí)將等位基因譜導(dǎo)入eBurst軟件，構(gòu)建親緣關(guān)系圖。另外，依據(jù)藥敏結(jié)果，分析糞腸球菌的耐藥與MLST的關(guān)聯(lián)性。

2 結(jié)果

2.1 MLST分型結(jié)果 見表1。

表1 74株糞腸球菌的MLST分型

備注：*表示新的型別，數(shù)據(jù)庫(kù)里不包含。

本次實(shí)驗(yàn)收集臨床分離糞腸球菌菌株中，74株萬古霉素敏感糞腸球菌菌株的MLST分型分為20個(gè)ST 型，有3個(gè)型別是新的型別(數(shù)據(jù)庫(kù)里不包含)，另外17個(gè)型別均是數(shù)據(jù)庫(kù)里已知的。在這20個(gè)ST型中，其中ST16總數(shù)最多，包含21株菌(占28.38%)；其次為ST179，包含20株菌(27.03%)；再次是ST4及ST6，各包含6株菌(占8.11%)；其余ST型只各包含1～3株菌。

2.2 MLST分型親緣關(guān)系分析 見圖1。通過MLST分析鑒定，并利用eBurst軟件構(gòu)建菌株進(jìn)化關(guān)系圖，發(fā)現(xiàn)74株菌株有3個(gè)克隆復(fù)合體。最普遍流行的克隆復(fù)合體是CC16，包含2種ST型(ST16，ST179，其中ST16為原始克隆株)，其次為CC4，包含2種ST型(ST4，ST585，其中ST4為原始克隆株)，再次為CC6，主要以ST6為主，其它的都是相對(duì)零散的克隆復(fù)合體。

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 見表2。本次實(shí)驗(yàn)收集的74株臨床分離糞腸球菌菌株中，暫未發(fā)現(xiàn)萬古霉素耐藥的菌株，除萬古霉素外，最為敏感的抗生素還有替考拉寧、氨芐西林、利奈唑胺及呋喃妥因，敏感率均為100%；耐藥程度高的抗生素主要是四環(huán)素及紅霉素，其耐藥率分別為89.2%和73.0%；其次是喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星和左氧氟沙星，其耐藥率分別為39.2%和36.5%，再次是高濃度的慶大霉素，耐藥率為32.4%；對(duì)利福平的耐藥率為16.2%，耐藥率較低的是青霉素，耐藥率為5.4%。

表2 糞腸球菌對(duì)抗生素藥敏試驗(yàn)結(jié)果

圖1 74株糞腸球菌的親緣關(guān)系圖

2.4 藥物敏感性與MLST分型的相關(guān)性 分析優(yōu)勢(shì)型別的ST型與藥物敏感性的關(guān)系，ST16主要是對(duì)四環(huán)素和紅霉素產(chǎn)生耐藥，分別是100%和90%，其次是利福平達(dá)33%，對(duì)高濃度慶大霉素及喹諾酮類耐藥，在20%左右；ST179的耐藥譜與ST16類似，主要也是對(duì)四環(huán)素和紅霉素產(chǎn)生耐藥，分別為100%和95%，其次是高濃度慶大霉素及喹諾酮類耐藥，約占35%，但ST179對(duì)利福平均表現(xiàn)為敏感。ST6與ST4雖收集的菌株數(shù)比較少，分別只有6株，但是6株ST6型菌株對(duì)四環(huán)素、喹諾酮類藥物及高濃度慶大霉素均全部耐藥，對(duì)紅霉素有1株表現(xiàn)為敏感；6株ST4型菌株對(duì)紅霉素表現(xiàn)為耐藥的有5株，對(duì)喹諾酮表現(xiàn)為耐藥的有4株，對(duì)四環(huán)素、高濃度的慶大霉素及青霉素表現(xiàn)為耐藥的各為3株，在本次實(shí)驗(yàn)中，僅發(fā)現(xiàn)ST4型的糞腸球菌會(huì)對(duì)青霉素產(chǎn)生耐藥。

3 討論

腸球菌為臨床較常見的一種致病菌。近年來腸球菌引起的醫(yī)院感染逐漸增多，造成其感染或暴發(fā)流行的原因復(fù)雜。利用病原細(xì)菌分離株的多位點(diǎn)序列分析(MLST)，可以發(fā)現(xiàn)或證實(shí)感染的來源，能夠針對(duì)一起暴發(fā)疫情追蹤到病原菌的精細(xì)傳播鏈，發(fā)現(xiàn)新的傳播模式和途徑等等，可以對(duì)疾病的預(yù)防及治療提供參考依據(jù)，但是目前國(guó)內(nèi)對(duì)糞腸球菌的基因分型研究相對(duì)較少。

本研究中收集了74株糞腸球菌進(jìn)行MLST分析，均來源于浙江地區(qū)的不同家醫(yī)院，有助于初步了解浙江地區(qū)糞腸球菌的遺傳背景資料。研究分析的74株糞腸球菌可以分為20個(gè)STs，其中優(yōu)勢(shì)型別為ST179和ST16，同屬于克隆復(fù)合體CC16。參考以往文獻(xiàn)，從CC16序列型感染和分布情況分析，ST16很可能是一種在不同地區(qū)、不同來源間流行的感染菌株，吳敏等[9]人在分析廣州地區(qū)多重耐藥糞腸球菌分離株的ST型，發(fā)現(xiàn)ST16最多；鄒紹偉等[10]人對(duì)包頭地區(qū)的58株糞腸球菌進(jìn)行了ST分析，發(fā)現(xiàn)ST179為該地區(qū)的優(yōu)勢(shì)菌株。趙娣等[11]人則在研究動(dòng)物來源糞腸球菌菌株之間的遺傳關(guān)系中發(fā)現(xiàn)豬病變內(nèi)臟、生鮮肉樣、豬糞、蜂猴和雞源中均有ST16的分布。另外，在歐洲多個(gè)國(guó)家及日本的醫(yī)院和社區(qū)分離的糞腸球菌研究[12-13]表明，亦是以CC16(ST16為主要代表)克隆群的多重耐藥糞腸球菌為主要感染菌株，在很多醫(yī)院和社區(qū)都有分布。

KUCH等[12]通過MLST分析歐洲收集的386株糞腸球菌分離株，發(fā)現(xiàn)由MLST分析和隨后的eBURST聚類確定的特定類型主要屬于六種克隆復(fù)合物(CC2，CC16，CC21，CC30，CC40和CC87)在醫(yī)院抗生素耐藥性的傳播中發(fā)揮著重要作用，并在一些國(guó)家促進(jìn)了更高的耐藥率，這說明糞腸球菌的耐藥性與ST之間有一定的相關(guān)性。本研究中屬于同一克隆復(fù)合體CC16的優(yōu)勢(shì)菌株ST179與ST16，其兩者的耐藥譜也很接近，區(qū)別僅在于對(duì)利福平的耐藥程度不一致，ST6型雖只有6株，但均表現(xiàn)為對(duì)四環(huán)素、喹諾酮類藥物及高濃度慶大霉素耐藥，這與尼日利亞GHEBREMEDHIN等[12，14]人在糞腸球菌人類分離株中發(fā)現(xiàn)高濃度的氨基糖苷類耐藥主要集中在ST6分型上的結(jié)論相符。ST4屬于CC4克隆株，該克隆株雖不屬于臨床大量出現(xiàn)的菌株，但是此克隆株曾在其他的亞太國(guó)家造成嚴(yán)重感染。在孫瑯等[14-15]人的研究中，僅有的一株萬古霉素耐藥糞腸球菌為ST4型。本研究未曾檢測(cè)出對(duì)萬古霉素、替考拉寧、氨芐西林耐藥的糞腸球菌菌株，但是發(fā)現(xiàn)對(duì)于青霉素耐藥的糞腸球菌只存在于ST4型中。

近年來，由于臨床抗生素的大量使用，腸球菌的耐藥性也逐漸增強(qiáng)，因此充分了解和掌握腸球菌的耐藥機(jī)制對(duì)防止和控制此類細(xì)菌感染的發(fā)生、傳播具有重要意義。MLST選用7個(gè)管家基因，通過基因序列分析的方法，揭示細(xì)菌各菌株之間的進(jìn)化關(guān)系，相比于其他分型方法如電泳帶型分析，其結(jié)果客觀、準(zhǔn)確，且重復(fù)性好，分辨率高。因此本研究課題期望在掌握該方法的同時(shí)，繼續(xù)收集樣本建立自己的糞腸球菌庫(kù)，同時(shí)對(duì)不同的ST型進(jìn)行更深一步的研究，比如通過基因組測(cè)序考察它們是否攜帶不同耐藥基因，通過質(zhì)譜儀分析相關(guān)代謝產(chǎn)物等，以便長(zhǎng)期、大范圍地觀察和研究糞腸球菌在不同條件下耐藥和致病方面發(fā)生的變化。