范臻佳，金麗蘭，史 冊(cè)，劉 禹，蔡 剛

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200025)

急性髓系白血病(acute myelocytic leukemia，AML)是克隆性造血干細(xì)胞疾病的一類，是髓系造血干/祖細(xì)胞的惡性疾病。以骨髓和外周血中原始和幼稚的髓性細(xì)胞增生為主要特征，臨床表現(xiàn)為貧血、出血、感染、發(fā)熱、臟器浸潤(rùn)和代謝異常等，發(fā)病早期部分癥狀與陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH)的部分臨床表現(xiàn)較為相似，特別是血管內(nèi)溶血的相關(guān)表現(xiàn)[1]。這可能與AML患者外周和骨髓異常血細(xì)胞缺乏相關(guān)膜錨鏈蛋白有關(guān)。眾所周知，PNH是以膜錨鏈蛋白CD55和CD59缺乏致血管內(nèi)溶血為主要病理特征，其本質(zhì)是造血干細(xì)胞的GPI錨鏈合成障礙，導(dǎo)致包括CD55和CD59在內(nèi)的多種血細(xì)胞膜錨鏈蛋白缺乏。目前已有一些證據(jù)表明AML患者外周異常血細(xì)胞也存在CD59等相關(guān)膜錨鏈蛋白缺乏，但其是否也存在GPI鏈的缺乏，以及其表現(xiàn)是否與典型PNH相同，尚不清楚。嗜水氣單胞菌溶素變異體(fluorescent-labeled aerophilic plasminogen，F(xiàn)LAER)是一種可與GPI錨鏈特異性結(jié)合的物質(zhì)[2]，目前，通過流式細(xì)胞術(shù)采用熒光標(biāo)記的FLAER及膜錨鏈蛋白的單克隆抗體檢測(cè)GPI錨鏈及其錨定蛋白的缺乏是國際臨床流式細(xì)胞協(xié)會(huì)(international clinical cytometry society，ICCS)和歐洲臨床細(xì)胞分析學(xué)會(huì)(european society for clinical cell analysis，ESSCA)推薦的對(duì)患者粒細(xì)胞和單核細(xì)胞進(jìn)行PNH克隆診斷的確診方法[3]。ICCS/ESSCA也同時(shí)推薦檢測(cè)紅細(xì)胞表面CD59的表達(dá)水平，判斷其是否存在CD59部分缺陷(II型細(xì)胞)或完全缺陷(III型細(xì)胞)的細(xì)胞[4，5]。通過有核細(xì)胞與紅細(xì)胞共同確定患者是否存在PNH克隆。

基于ICCS/ESSCA推薦的PNH檢測(cè)方法，我們擬在本研究中，采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)不同類型的AML患者進(jìn)行外周血紅細(xì)胞CD59和有核細(xì)胞FLAER檢測(cè)，同時(shí)以確診的PNH患者作為對(duì)照，分析AML患者是否存在FLAER陰性的類PNH克隆及其特點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象 收集瑞金醫(yī)院2014年～2018年門診和住院患者57例，確診為PNH患者21例(其中伴有再生障礙性貧血的5例，男性8例，女性13例)；AML患者36例(其中M2 3例，M3 21例，M4 5例，M5 7例；男性17例，女性19例)。

1.2 儀器和試劑 美國BD公司CantoII流式細(xì)胞儀，anti-CD59- FITC，F(xiàn)LAER-ALEXA488，anti-CD33- APC，anti-CD14- Pacific Blue，anti-CD24- PE，anti-CD45-PC5等熒光標(biāo)記流式抗體及溶血素等均購自BD Pharmingen。

1.3 方法

1.3.1 外周血粒細(xì)胞和單核細(xì)胞FLAER檢測(cè) 根據(jù)ICCS/ESSCA指南，基于CantoII平臺(tái)，采用五色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。避光孵育30 min后加入溶血素裂紅，完全溶血后加入PBS洗滌細(xì)胞，并上機(jī)檢測(cè)，從而得到目的細(xì)胞亞群的百分?jǐn)?shù)。正常參考范圍：CD24-FLAER-細(xì)胞/CD45+粒細(xì)胞<1%，CD14-FLAER-細(xì)胞/CD33+單核細(xì)胞<1%。

1.3.2 外周血紅細(xì)胞CD59檢測(cè)：根據(jù)ICCS/ESSCA指南，基于CantoII平臺(tái)，采用單色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。將熒光素標(biāo)記的各種單克隆抗體加入到洗滌紅細(xì)胞中，與細(xì)胞膜上相應(yīng)的抗原結(jié)合，孵育后再次洗滌、重懸等步驟后，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析，從而得到表達(dá)缺陷細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。正常參考范圍：II型細(xì)胞和III型細(xì)胞比率均<1%。

2 結(jié)果

2.1 紅細(xì)胞CD59的表達(dá)水平 見圖1。AML組患者未檢出明顯的CD59表達(dá)缺陷的細(xì)胞，PNH組患者進(jìn)行檢測(cè)后CD59抗原表達(dá)出現(xiàn)不同程度缺失，AML組患者檢測(cè)結(jié)果與PNH組相比，各型紅細(xì)胞比例差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.41～6.43，均P<0.001)。

表1 AML組和PNH組外周血細(xì)胞抗原缺失率

圖1 健康對(duì)照、AML及PNH患者紅細(xì)胞CD59流式比較

2.2 粒系和單核系 見圖2。AML組患者和PNH組患者進(jìn)行檢測(cè)后粒細(xì)胞和單核細(xì)胞均出現(xiàn)了GPI雙陰性的缺失細(xì)胞。但AML組患者的缺失細(xì)胞的克隆比例與PNH組患者相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見表1。同時(shí)，可在AML患者中檢出不同數(shù)量的FLAER單陽性細(xì)胞，例如CD24-FLAER+的粒細(xì)胞和CD14-FLAER+單核細(xì)胞。

圖2 健康對(duì)照、AML及PNH患者粒細(xì)胞、單核細(xì)胞FLAER流式比較

3 討論

由于白血病細(xì)胞具有“異質(zhì)性”和“非同步性”，常伴有抗原表達(dá)紊亂現(xiàn)象[6]，并且其分化發(fā)育各個(gè)階段出現(xiàn)了不規(guī)律和調(diào)節(jié)紊亂，從而導(dǎo)致其膜抗原的表達(dá)異常[7]。既往已有研究發(fā)現(xiàn)，部分AML患者常伴有粒、單細(xì)胞的CD55或CD59缺陷，可能是導(dǎo)致這些患者并發(fā)血管內(nèi)溶血的重要原因。眾所周知，CD55和CD59是保護(hù)細(xì)胞免受異常補(bǔ)體激活殺傷的重要膜錨鏈蛋白[8]。AML患者這些CD55或CD59缺陷的細(xì)胞究竟是僅為膜錨鏈蛋白缺乏，還是也涉及糖基磷脂酰肌醇(glycosyl-phosphatidyl inositol，GPI)錨鏈的合成障礙，尚不完全清楚。由于GPI錨鏈合成障礙會(huì)導(dǎo)致包括CD55和CD59在內(nèi)的多種膜錨鏈蛋白缺乏，可能對(duì)AML患者血細(xì)胞的多種生物學(xué)功能產(chǎn)生影響。

在本研究中，我們的結(jié)果清晰的顯示，盡管AML患者粒細(xì)胞、單核細(xì)胞檢出的典型PNH克隆明顯小于PNH患者，但勿庸質(zhì)疑的是多種類型的AML病患都存在GPI膜錨鏈的合成障礙和/或錨鏈蛋白的缺失，不僅有典型的粒細(xì)胞、單核細(xì)胞PNH克隆出現(xiàn)，同時(shí)還存在不同數(shù)量的FLAER單陽性細(xì)胞，表明這些惡性干、祖細(xì)胞的相關(guān)抗原表達(dá)或蛋白合成明顯紊亂，這也與既往文獻(xiàn)報(bào)道AML患者粒細(xì)胞表面存在CD59表達(dá)異常的發(fā)現(xiàn)相一致[9]。值得注意的是，部分M3和M5患者均不僅有惡性細(xì)胞系的GPI錨鏈合成障礙，而且也存在其它有核細(xì)胞系的GPI錨鏈合成障礙，提示這部分患者骨髓的異常改變可能發(fā)生在造血細(xì)胞更原始的階段。但是，我們?cè)诩{入的AML患者中未檢出明顯異常的CD59缺陷克隆，一方面間接提示了AML患者粒細(xì)胞、單核細(xì)胞的惡性改變未在DNA水平明顯影響紅系細(xì)胞的發(fā)展；另一方面，這也有助于鑒別診斷AML患者是否伴有PNH，因?yàn)榈湫偷腜NH患者都有明顯的CD59缺陷的II型和/或III型細(xì)胞，表現(xiàn)為紅系及有核細(xì)胞系的多系造血細(xì)胞GPI錨鏈合成障礙[10]。由于本研究中未納入紅白血病患者，因此未能對(duì)該類型患者的紅系及有核細(xì)胞系進(jìn)行評(píng)估，觀察這類病人是否會(huì)同時(shí)出現(xiàn)紅系和粒細(xì)胞、單核細(xì)胞系的GPI錨鏈合成障礙，這需要在下次研究中予以澄清。

通過本項(xiàng)研究，我們了解到粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等有核細(xì)胞系GPI錨鏈合成障礙在AML患者中是一種常見現(xiàn)象，盡管檢測(cè)到的錨鏈缺陷克隆小于典型PNH患者。由于GPI錨鏈具有重要的生物學(xué)意義，因此，其缺陷對(duì)AML等疾病的病理生理有何影響值得深入地進(jìn)行研究；同時(shí)也表明，對(duì)AML患者檢測(cè)粒細(xì)胞、單核細(xì)胞的GPI錨鏈水平對(duì)于判斷病情及評(píng)估預(yù)后可能具有重要的臨床意義。