張翠平，陳婷婷，王 成，于漢卿，張辰宇，張春妮

(1.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院，解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院臨床檢驗(yàn)科，南京 210002；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，南京 210008；3.南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210046)

原發(fā)性腎病綜合征(nephrotic syndrome，NS)是兒童期最常見的腎小球疾病，發(fā)病機(jī)制不清。目前多認(rèn)為是由腎小球基底膜通透性增高，大量血漿蛋白從尿中丟失導(dǎo)致，臨床主要表現(xiàn)為大量蛋白尿、低清蛋白血癥、水腫和高膽固醇血癥，易復(fù)發(fā)及并發(fā)感染等。若不及時(shí)治療，將有感染、血栓栓塞甚至發(fā)展為腎衰竭的危險(xiǎn)。外泌體(exosome)是細(xì)胞分泌的直徑約50～150 nm的膜性囊泡，內(nèi)含來源細(xì)胞特異性的蛋白、脂質(zhì)和核酸(包括miRNA，mRNA)等物質(zhì)，通過血液和體液循環(huán)，參與重要的細(xì)胞間交流和生物活性物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。外泌體miRNA不但可以反映來源細(xì)胞的病理生理狀態(tài)，而且在多種病理生理過程中發(fā)揮重要作用[1，2]。研究表明，血液和體液外泌體中的miRNA的豐度和穩(wěn)定性均高于游離的miRNA，提示外泌體中的miRNA作為標(biāo)志物將更為可靠[3]。有報(bào)道顯示，miR-23b-3p是一種高表達(dá)于足細(xì)胞的miRNA，其缺失將會(huì)引起蛋白尿以及腎小球和腎小管的損傷[4]。因此，本研究擬通過檢測miR-23b-3p在NS患兒尿液外泌體中的水平，探討其作為NS輔助診斷指標(biāo)的可能性。

1 材料和方法

1.1 研究對象 收集2017年3～11月在解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院(原南京軍區(qū)南京總醫(yī)院)兒科確診并住院的98例NS患兒治療前尿液標(biāo)本(晨尿)，其中男性71例，女性27例，平均年齡6.5±3.6歲。其中41例患兒同時(shí)收集其治療后尿蛋白轉(zhuǎn)陰的晨尿。NS患兒納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患兒年齡均<15歲，尿蛋白>50 mg/kg/day，排除先天性或繼發(fā)性腎病綜合征、其他腎臟疾病、尿路異?；蚋腥炯捌渌膊〉取Ｋ谢純壕邮芗に睾推渌Ｒ?guī)輔助治療，包括降壓藥、利尿藥等，部分使用環(huán)孢素、環(huán)磷酰胺、他克莫司及麥考酚嗎乙酯等。同期在南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院收集95例常規(guī)體檢正常的兒童為對照組，女性27例，男性68例，平均年齡5.7±3.1歲。兩組之間性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.893，0.382)。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，所有樣本的收集均獲得患兒父母知情同意。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 儀器：5418型高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；SAS67120型超純水機(jī)(美國Millipore公司)；2720型PCR儀(美國ABI公司)；LightCycler?96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)；7600型全自動(dòng)生化分析儀(日本Hitachi公司)。

1.2.2 試劑：ExoQuick尿液外泌體分離試劑盒(美國SBI公司)；Trizol試劑(美國Life Technologies公司)；分析純級別氯仿、異丙醇、無水乙醇(上海國藥集團(tuán)試劑公司)；DEPC水(美國Sigma-Aldrich公司)；miR-23b-3p逆轉(zhuǎn)錄引物、qRT-PCR引物及TaqMan探針(美國ABI公司)；逆轉(zhuǎn)錄體系和qRT-PCR體系所用試劑、miR-23b-3p成熟體(大連TaKaRa公司)；血清總蛋白(total protein，TP)和清蛋白(albumin，Alb)檢測試劑盒(北京Leadman公司)；血清總膽固醇(total cholesterol，TC)和三酰甘油(triacylglycerols，TG)檢測試劑盒(英國Randox公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本收集及處理：收集NS患兒入院治療前及健康對照者的晨尿8 ml，室溫下3 000×g離心10 min，除去細(xì)胞及細(xì)胞碎片，收集離心后的上清，于-80℃冰箱保存。

1.3.2 尿液外泌體提取：將尿液標(biāo)本在4℃，3 000×g離心30 min，取500 μl上清液，根據(jù)外泌體提取試劑盒說明書加入100 μl ExoQuick試劑，混勻離心提取外泌體。

1.3.3 外泌體總RNA提?。喊幢菊n題組前期建立的方法[5]，用Trizol法提取外泌體中的總RNA，使用20 μl的DEPC水溶解保存于-80 ℃待用。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)：基于TaqMan探針的qRT-PCR方法檢測尿液外泌體miR-23b-3p水平[6]。①逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)體系為10 μl：DEPC水3.5 μl，5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液2.0 μl，10 mmol/L dNTPs 1.0 μl，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μl，miR-23b-3p逆轉(zhuǎn)錄引物1.0 μl，RNA樣品2.0 μl。反應(yīng)條件為 16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min，4℃保存，每個(gè)反應(yīng)均為一個(gè)循環(huán)。②qRT-PCR反應(yīng)體系為20 μl：ddH2O 14.77 μl，10×PCR緩沖液2 μl，25 mmol/L MgCl21.2 μl，10 mmol/L dNTP 0.4 μl，rTaq酶0.3 μl，miR-23b-3p上下游引物和TaqMan探針0.33 μl，cDNA 1 μl。反應(yīng)條件為95℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。③標(biāo)準(zhǔn)曲線：將濃度為1 μmol/L的miR-23b-3p成熟體逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行一系列濃度梯度稀釋(1～109fmol/L)作為標(biāo)準(zhǔn)品與待測miR-23b-3p同時(shí)進(jìn)行qRT-PCR定量。通過儀器配套的LightCycler?96分析軟件對測定結(jié)果設(shè)定統(tǒng)一的閾值，分析獲得檢測的Ct值。然后，以一系列標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)為X軸，每個(gè)濃度檢測的Ct值為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每個(gè)待測樣本中外泌體miR-23b-3p的含量。每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果取均值。同時(shí)，以不含RNA模板的ddH2O作為陰性對照。

1.3.5 尿蛋白和血清學(xué)指標(biāo)測定：尿常規(guī)尿蛋白測定用干化學(xué)法；血清Alb，TP，TC，TG用日立7600型全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行定量檢測。

2 結(jié)果

2.1 尿液外泌體miR-23b-3p水平檢測 qRT-PCR結(jié)果顯示，NS患兒尿液外泌體中的miR-23b-3p水平為13.44(4.47，31.40)fmol/L，顯著高于健康對照組3.94(2.76，7.15)fmol/L，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=1 899，P<0.000 1)。見圖1。

***代表Mann-Whitney非參數(shù)檢驗(yàn)，P<0.001。

2.2 NS患兒治療前后尿液外泌體miR-23b-3p水平變化 利用qRT-PCR檢測41例NS患兒治療前和治療后(尿蛋白轉(zhuǎn)陰)尿液外泌體miR-23b-3p水平，并分析其變化特征。Wilcoxon matched pairs檢驗(yàn)結(jié)果顯示，治療后NS患兒尿液外泌體miR-23b-3p含量較治療前明顯下降[10.62(4.38，37.72)fmol/L vs 2.84(1.53，4.92)fmol/L]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(W=695，P<0.000 1)。

2.3 ROC曲線分析 ROC曲線分析顯示尿液外泌體miR-23b-3p能夠較好地區(qū)分NS患兒和正常對照，其AUC為0.796(95%CI：0.734～0.858)，見圖2A。當(dāng)cutoff值為4.26時(shí)，miR-23b-3p診斷NS的敏感度為84.7%，特異度為64.2%。此外，miR-23b-3p在區(qū)分治療緩解后患兒的AUC為0.830(95%CI：0.742～0.917)，見圖2B。在cutoff值為6.96時(shí)，其敏感度為65.9%，特異度為90.2%。

圖2 血清miR-23b-3p診斷NS患兒與正常對照(A)和NS患兒治療緩解后(B)的ROC曲線分析

2.4 單因素邏輯回歸分析 以健康對照為二分類參考變量，進(jìn)一步采用單因素邏輯回歸分析尿液外泌體miR-23b-3p與NS發(fā)病的相關(guān)性。結(jié)果顯示，miR-23b-3p是NS潛在的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)因子[OR=7.565(95%CI：2.784～20.555)，P<0.000 1]。

2.5 miR-23b-3p水平與NS患兒生化指標(biāo)的相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析顯示，NS患兒尿液外泌體miR-23b-3p水平與血清TP，Alb含量呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.377，P=0.000 1；r=-0.309，P=0.002)；與TC，TG含量呈顯著正相關(guān)(r=0.266，P=0.009；r=0.318，P=0.002)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與性別和年齡無相關(guān)性(r=-0.101，P=0.321；r=0.044，P=0.676)。

3 討論

目前，臨床上主要依靠腎組織活檢、尿蛋白和血清生化指標(biāo)對NS患兒進(jìn)行診斷和監(jiān)測隨訪。腎組織活檢是病理診斷NS的金標(biāo)準(zhǔn)，但卻是一種創(chuàng)傷性的手段，且有很多潛在的并發(fā)癥，不適用于兒童的連續(xù)監(jiān)測。尿蛋白定量受飲食、檢測方法等其他因素影響，血清生化指標(biāo)也會(huì)受到機(jī)體多種因素的干擾[7]。因此，亟需尋找和鑒定新的、具備較高臨床診斷價(jià)值的NS非侵入性指標(biāo)。

本課題組曾對NS患兒血液和尿液中的miRNA進(jìn)行測序及定量分析，發(fā)現(xiàn)NS患兒血清miR-30a-5p，miR-151-3p，miR-150，miR-191，miR-19b和尿液中的miR-30a-5p含量均明顯高于正常對照，可作為NS患兒診斷及預(yù)后的潛在指標(biāo)[8]。包裹在外泌體中的miRNA的穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于游離miRNA[3]，其與疾病的關(guān)系也更為密切，是目前疾病液體活檢領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，尿液中的外泌體均來源于腎組織，外泌體所包含的物質(zhì)能夠更早更準(zhǔn)確地反映腎臟疾病的狀態(tài)及進(jìn)展[9]，且尿液具有樣本量大、易收集、無創(chuàng)性等優(yōu)點(diǎn)，故尿液外泌體具有作為腎臟疾病診斷及療效監(jiān)測的潛能。MIRANDA等[10]研究發(fā)現(xiàn)，尿液外泌體所包含的RNA不僅穩(wěn)定，而且能夠反映腎組織和細(xì)胞的RNA表達(dá)情況及其生理病理變化。HUANG等[2]發(fā)現(xiàn)尿液外泌體miR-193a在局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥(focal segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS)患者中顯著升高，具有作為FSGS 潛在的新型生物學(xué)標(biāo)志物的潛能。LI等[11]也證實(shí)了在IV型狼瘡性腎炎患者尿液外泌體中miRNA表達(dá)譜(miR-3135b，miR-654-5p和miR-146a-5p)具有特異性。這些研究揭示了尿液外泌體中的miRNA可以輔助診斷不同類型的腎臟疾病。

目前，NS患兒尿液外泌體miRNA的研究才剛剛起步，miRNA檢測對于NS的臨床價(jià)值及其可能分子機(jī)制尚不完全清楚。大多數(shù)研究認(rèn)為NS的發(fā)病機(jī)制主要與足細(xì)胞的損傷或突變導(dǎo)致腎小球基底膜通透性增加以及免疫失調(diào)等因素有關(guān)[12-13]。HO等[4]發(fā)現(xiàn)miR-23b-3p在足細(xì)胞高表達(dá)，足細(xì)胞Dicer酶特異性敲除后miR-23b-3p的缺失將會(huì)引起蛋白尿以及腎小球和腎小管的損傷，提示miR-23b-3p具有維持腎小球基底膜完整性的功能。另有研究證明miR-23b-3p介導(dǎo)的信號(hào)通路能夠在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)靶基因Hes1的表達(dá)[14]，而Hes1參與腎單位的形成并且是腎形成過程中激活的Notch信號(hào)通路的下游靶點(diǎn)[15]，間接證明了miR-23b-3p的變化與腎小球疾病密切相關(guān)。為此，我們對NS患兒尿液外泌體中的miR-23b-3p進(jìn)行檢測分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-23b-3p在患兒尿液外泌體中的含量顯著升高，而在治療緩解后明顯降低。尿液外泌體miR-23b-3p水平與NS患兒血清TP和Alb含量呈顯著負(fù)相關(guān)，而與TC，TG含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，邏輯回歸分析揭示miR-23b-3p是NS潛在的危險(xiǎn)因子。這些結(jié)果提示，miR-23b-3p是兒童NS潛在的輔助指標(biāo)，若與現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)聯(lián)合檢測，將有助于提高該病的診斷和監(jiān)控能力。

miR-23b-3p在NS患兒尿液外泌體中升高的原因和機(jī)制尚不明確。我們推測可能與NS病人腎小球足細(xì)胞損傷有關(guān)，富含miR-23b-3p的足細(xì)胞在受到損傷后，導(dǎo)致以外泌體形式主動(dòng)分泌的miR-23b-3p增加，使得外泌體miR-23b-3p在尿液中含量升高。不過，這還需深入研究以證實(shí)。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)了NS患兒尿液外泌體中miR-23b-3p水平顯著增加，且隨著疾病的緩解而降低，可作為兒童NS潛在的液體活檢指標(biāo)。本研究為該病的診斷提供了新的手段和思路，也為探究尿液外泌體miRNA在腎小球疾病中的作用提供了線索。