肥胖在全球有流行趨勢(shì),據(jù)估計(jì),全球超過(guò)11億成人超重,其中3.12億人屬于肥胖。肥胖不僅易引發(fā)心腦血管病變、2型糖尿病、腫瘤,近年來(lái)發(fā)現(xiàn)肥胖病人發(fā)生術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction, POCD)的風(fēng)險(xiǎn)增加[1]。α-硫辛酸(α-LA)具有降低血脂、抗炎及抗氧化作用,神經(jīng)保護(hù)作用也逐漸被報(bào)道,但具體機(jī)制尚不明確[2-3]。近些年,關(guān)于POCD的研究取得了很多的進(jìn)展[4-7]。然而,對(duì)于肥胖病人POCD發(fā)病機(jī)制及有效的防治手段一直沒(méi)有定論。本研究擬觀察α-LA對(duì)高脂飲食(HFD)誘導(dǎo)的肥胖小鼠術(shù)后空間學(xué)習(xí)記憶功能的影響,并探討可能的機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 一般資料 120只雄性C57BL/6小鼠(14周)購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[批號(hào)SCXK (京)-2011-0011]。飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房,室溫(24±1)℃,自由進(jìn)食飲水,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后苯巴比妥鈉處死。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 小鼠被隨機(jī)分為6組(對(duì)照組, 對(duì)照+手術(shù)組,對(duì)照+α-LA+手術(shù)組,HFD組, HFD+手術(shù)組,HFD+α-LA+手術(shù)組),每組20只。HFD、HFD+手術(shù)組和HFD+α-LA+手術(shù)組小鼠每日用高脂飼料(D12492, 60 kcal% Fat, Research diets, Inc, USA)喂養(yǎng),其他組普通飼料喂養(yǎng),持續(xù)12周。對(duì)照+α-LA+手術(shù)組和HFD+α-LA+手術(shù)組用α-LA(惠氏制藥有限公司, 蘇州) 100 mg/(kg·d)灌胃,持續(xù)12周,其他組等體積生理鹽水灌胃。手術(shù)模型采用50 mg/kg苯巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉,肝左葉及中葉切除。對(duì)照組和HFD組只接受麻醉處理。

1.3 行為學(xué)測(cè)試 術(shù)后第1～4天空間航行實(shí)驗(yàn)記錄逃避潛伏期和游泳速度,第5天空間探索實(shí)驗(yàn)記錄穿臺(tái)次數(shù)及原平臺(tái)象限滯留時(shí)間。

1.4 蛋白檢測(cè)及透射電鏡觀察 術(shù)后第5天行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后即刻取海馬,免疫熒光法檢測(cè)casepase 3、Bcl-2表達(dá)情況。透射電鏡觀察海馬神經(jīng)元、突觸結(jié)構(gòu),計(jì)算突觸密度、突觸界面曲率、突觸后活性區(qū)長(zhǎng)度、突觸間隙寬度和突觸后致密物質(zhì)(postsynaptic density,PSD)厚度。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 HFD組、HFD+手術(shù)組體質(zhì)量分別明顯高于對(duì)照組、對(duì)照+手術(shù)組(P<0.01)。HFD+α-LA+手術(shù)組高脂飲食后14～84 d體質(zhì)量明顯低于HFD組和HFD+手術(shù)組(P<0.01)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組高脂飲食期間體質(zhì)量變化比較注:與對(duì)照組比較,*P<0.01;與對(duì)照+手術(shù)組比較,#P<0.01;與HFD+手術(shù)組比較,△P<0.01

2.2 水迷宮結(jié)果 術(shù)后第1天定位航行實(shí)驗(yàn)中,對(duì)照+手術(shù)組、對(duì)照+α-LA+手術(shù)組、HFD+手術(shù)組和HFD+α-LA+手術(shù)組逃避潛伏期均明顯長(zhǎng)于HFD組和對(duì)照組(P<0.01),HFD+手術(shù)組和HFD+α-LA+手術(shù)組游泳速度明顯小于其他4組(P<0.01)。術(shù)后第2～4天,對(duì)照+α-LA+手術(shù)組逃避潛伏期明顯短于對(duì)照+手術(shù)組(P<0.01或P<0.05)；HFD+α-LA+手術(shù)組逃避潛伏期明顯短于HFD+手術(shù)組(P<0.01),長(zhǎng)于對(duì)照+α-LA+手術(shù)組(P<0.01)；HFD+手術(shù)組游泳速度明顯小于其他5組(P<0.01)。術(shù)后第3～4天，HFD+手術(shù)組逃避潛伏期明顯長(zhǎng)于對(duì)照+手術(shù)組。術(shù)后第5天空間探索實(shí)驗(yàn)中,對(duì)照+α-LA+手術(shù)組穿臺(tái)次數(shù)及原平臺(tái)象限滯留時(shí)間明顯多于對(duì)照+手術(shù)組(P<0.01),HFD+α-LA+手術(shù)組穿臺(tái)次數(shù)及原平臺(tái)象限滯留時(shí)間明顯多于HFD+手術(shù)組(P<0.01)。對(duì)照+α-LA+手術(shù)組和HFD+α-LA+手術(shù)組的穿臺(tái)次數(shù)及原平臺(tái)象限滯留時(shí)間組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2。

注: A、B為術(shù)后第1～4天定位航行實(shí)驗(yàn); C、D為術(shù)后第5天空間探索實(shí)驗(yàn)。與對(duì)照組比較,*P<0.01;與對(duì)照+手術(shù)組比較,&P<0.01;與HFD組比較,#P<0.01;與HFD+手術(shù)組比較,△P<0.01圖2 水迷宮結(jié)果

2.3 免疫熒光結(jié)果 術(shù)后第5天對(duì)照+α-LA+手術(shù)組海馬casepase 3、Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯低于對(duì)照+手術(shù)組(P<0.01);HFD+α-LA+手術(shù)組casepase 3、Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯低于HFD+手術(shù)組(P<0.01)。對(duì)照+α-LA+手術(shù)組與HFD+α-LA+手術(shù)組的casepase3、Bcl-2蛋白表達(dá)水平，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖3。

2.4 透射電鏡結(jié)果 術(shù)后第5天，對(duì)照組和HFD組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元胞漿和胞核染色質(zhì)分布均勻,細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則,核膜光滑；其他組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了不同程度的病理改變。對(duì)照+手術(shù)組和HFD+手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞核固縮,核膜凹陷、皺縮。對(duì)照+手術(shù)組突觸密度、活性區(qū)長(zhǎng)度、PSD厚度明顯小于對(duì)照+α-LA+手術(shù)組(P<0.01)；HFD+手術(shù)組突觸密度、活性區(qū)長(zhǎng)度、PSD厚度明顯小于HFD+α-LA+手術(shù)組(P<0.01)突觸密度，對(duì)照+α-LA+手術(shù)組和HFD+α-LA+手術(shù)組的活性區(qū)長(zhǎng)度、PSD厚度組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 各組透射電鏡下海馬突觸結(jié)構(gòu)比較(±s)

注:與對(duì)照+手術(shù)組比較,*P<0.01;與HFD+手術(shù)組比較,△P<0.01

注: A為術(shù)后第5天海馬casepase3表達(dá); B為術(shù)后第5天海馬Bcl-2表達(dá);與對(duì)照+手術(shù)組比較,*P<0.01;與HFD+手術(shù)組比較,△P<0.01圖3 術(shù)后第5天6組海馬casepase3、Bcl-2表達(dá)比較

3 討論

大量研究顯示,術(shù)后學(xué)習(xí)記憶功能下降與海馬神經(jīng)元及突觸數(shù)量減少、結(jié)構(gòu)改變有關(guān)[8]。肥胖病人術(shù)后認(rèn)知功能下降明顯[9],具體機(jī)制及有效防治措施尚不明確。本研究采用HFD造肥胖小鼠模型，肝部分切除術(shù)后1～5 d發(fā)現(xiàn)小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能明顯下降。

α-LA是已知天然抗氧化劑中效果最強(qiáng)的一種,近年來(lái),α-LA對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用取得很多研究者的認(rèn)同。已報(bào)道的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制包括抑制凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白(ASK1/DAXX)信號(hào)、激活PI3K/AKT或PI3K/ERK途徑等[10-11]。有研究發(fā)現(xiàn)α-LA調(diào)控突觸可塑性蛋白[12],通過(guò)線粒體途徑抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[13]。本研究結(jié)果顯示,α-LA干預(yù)12周可明顯改善HFD小鼠術(shù)后學(xué)習(xí)記憶功能,降低小鼠體質(zhì)量,降低海馬casepase 3、Bcl-2表達(dá)水平。

突觸界面結(jié)構(gòu)參數(shù)是反映突觸結(jié)構(gòu)可塑性的敏感性指標(biāo), 與突觸的功能狀態(tài)及神經(jīng)信息傳遞有重要的聯(lián)系。突觸界面曲率是突觸前后膜隔著突觸間隙相對(duì)應(yīng)界面的曲率, 既反映神經(jīng)遞質(zhì)釋放的狀況, 又是突觸后膜上受體蛋白分子構(gòu)像變化的標(biāo)志。突觸活性區(qū)是突觸前膜與聚集成簇的突觸小泡相接觸形成的區(qū)域, 代表神經(jīng)遞質(zhì)釋放的有效面積。突觸間隙是一個(gè)神經(jīng)元與另一個(gè)神經(jīng)元信息溝通的部位, 其大小與形態(tài)對(duì)突觸活動(dòng)的動(dòng)力學(xué)有重要影響。PSD由突觸后膜內(nèi)側(cè)胞漿中的蛋白復(fù)合體組成, 其中蛋白表達(dá)的改變就會(huì)引起PSD厚度的變化, 影響突觸的傳遞效率。PSD厚度越大, 越有利于神經(jīng)元之間的相互溝通[15]。本研究結(jié)果顯示，α-LA干預(yù)12周后，小鼠的海馬突觸密度、活性區(qū)長(zhǎng)度、PSD厚度明顯改善，說(shuō)明α-LA可維持小鼠神經(jīng)元、突觸正常結(jié)構(gòu)。

綜上所述,α-LA對(duì)HFD誘導(dǎo)的肥胖小鼠術(shù)后學(xué)習(xí)記憶功能有保護(hù)作用,其機(jī)制可能與抑制海馬神經(jīng)元凋亡,維持神經(jīng)元、突觸正常結(jié)構(gòu)有關(guān)。