肥胖在全球有流行趨勢,據估計,全球超過11億成人超重,其中3.12億人屬于肥胖。肥胖不僅易引發(fā)心腦血管病變、2型糖尿病、腫瘤,近年來發(fā)現(xiàn)肥胖病人發(fā)生術后認知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction, POCD)的風險增加[1]。α-硫辛酸(α-LA)具有降低血脂、抗炎及抗氧化作用,神經保護作用也逐漸被報道,但具體機制尚不明確[2-3]。近些年,關于POCD的研究取得了很多的進展[4-7]。然而,對于肥胖病人POCD發(fā)病機制及有效的防治手段一直沒有定論。本研究擬觀察α-LA對高脂飲食(HFD)誘導的肥胖小鼠術后空間學習記憶功能的影響,并探討可能的機制。

1 對象與方法

1.1 一般資料 120只雄性C57BL/6小鼠(14周)購于北京維通利華實驗動物有限公司[批號SCXK (京)-2011-0011]。飼養(yǎng)于SPF級動物房,室溫(24±1)℃,自由進食飲水,實驗結束后苯巴比妥鈉處死。

1.2 實驗方法 小鼠被隨機分為6組(對照組, 對照+手術組,對照+α-LA+手術組,HFD組, HFD+手術組,HFD+α-LA+手術組),每組20只。HFD、HFD+手術組和HFD+α-LA+手術組小鼠每日用高脂飼料(D12492, 60 kcal% Fat, Research diets, Inc, USA)喂養(yǎng),其他組普通飼料喂養(yǎng),持續(xù)12周。對照+α-LA+手術組和HFD+α-LA+手術組用α-LA(惠氏制藥有限公司, 蘇州) 100 mg/(kg·d)灌胃,持續(xù)12周,其他組等體積生理鹽水灌胃。手術模型采用50 mg/kg苯巴比妥鈉腹腔內注射麻醉,肝左葉及中葉切除。對照組和HFD組只接受麻醉處理。

1.3 行為學測試 術后第1～4天空間航行實驗記錄逃避潛伏期和游泳速度,第5天空間探索實驗記錄穿臺次數及原平臺象限滯留時間。

1.4 蛋白檢測及透射電鏡觀察 術后第5天行為學測試結束后即刻取海馬,免疫熒光法檢測casepase 3、Bcl-2表達情況。透射電鏡觀察海馬神經元、突觸結構,計算突觸密度、突觸界面曲率、突觸后活性區(qū)長度、突觸間隙寬度和突觸后致密物質(postsynaptic density,PSD)厚度。

2 結果

2.1 一般資料 HFD組、HFD+手術組體質量分別明顯高于對照組、對照+手術組(P<0.01)。HFD+α-LA+手術組高脂飲食后14～84 d體質量明顯低于HFD組和HFD+手術組(P<0.01)。見圖1。

圖1 各組高脂飲食期間體質量變化比較注:與對照組比較,*P<0.01;與對照+手術組比較,#P<0.01;與HFD+手術組比較,△P<0.01

2.2 水迷宮結果 術后第1天定位航行實驗中,對照+手術組、對照+α-LA+手術組、HFD+手術組和HFD+α-LA+手術組逃避潛伏期均明顯長于HFD組和對照組(P<0.01),HFD+手術組和HFD+α-LA+手術組游泳速度明顯小于其他4組(P<0.01)。術后第2～4天,對照+α-LA+手術組逃避潛伏期明顯短于對照+手術組(P<0.01或P<0.05)；HFD+α-LA+手術組逃避潛伏期明顯短于HFD+手術組(P<0.01),長于對照+α-LA+手術組(P<0.01)；HFD+手術組游泳速度明顯小于其他5組(P<0.01)。術后第3～4天，HFD+手術組逃避潛伏期明顯長于對照+手術組。術后第5天空間探索實驗中,對照+α-LA+手術組穿臺次數及原平臺象限滯留時間明顯多于對照+手術組(P<0.01),HFD+α-LA+手術組穿臺次數及原平臺象限滯留時間明顯多于HFD+手術組(P<0.01)。對照+α-LA+手術組和HFD+α-LA+手術組的穿臺次數及原平臺象限滯留時間組間比較差異無統(tǒng)計學意義。見圖2。

注: A、B為術后第1～4天定位航行實驗; C、D為術后第5天空間探索實驗。與對照組比較,*P<0.01;與對照+手術組比較,&P<0.01;與HFD組比較,#P<0.01;與HFD+手術組比較,△P<0.01圖2 水迷宮結果

2.3 免疫熒光結果 術后第5天對照+α-LA+手術組海馬casepase 3、Bcl-2蛋白表達水平明顯低于對照+手術組(P<0.01);HFD+α-LA+手術組casepase 3、Bcl-2蛋白表達水平明顯低于HFD+手術組(P<0.01)。對照+α-LA+手術組與HFD+α-LA+手術組的casepase3、Bcl-2蛋白表達水平，組間比較差異無統(tǒng)計學意義。見圖3。

2.4 透射電鏡結果 術后第5天，對照組和HFD組小鼠海馬區(qū)神經元胞漿和胞核染色質分布均勻,細胞核形態(tài)規(guī)則,核膜光滑；其他組小鼠海馬區(qū)神經元的超微結構發(fā)生了不同程度的病理改變。對照+手術組和HFD+手術組神經細胞核固縮,核膜凹陷、皺縮。對照+手術組突觸密度、活性區(qū)長度、PSD厚度明顯小于對照+α-LA+手術組(P<0.01)；HFD+手術組突觸密度、活性區(qū)長度、PSD厚度明顯小于HFD+α-LA+手術組(P<0.01)突觸密度，對照+α-LA+手術組和HFD+α-LA+手術組的活性區(qū)長度、PSD厚度組間比較差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 各組透射電鏡下海馬突觸結構比較(±s)

注:與對照+手術組比較,*P<0.01;與HFD+手術組比較,△P<0.01

注: A為術后第5天海馬casepase3表達; B為術后第5天海馬Bcl-2表達;與對照+手術組比較,*P<0.01;與HFD+手術組比較,△P<0.01圖3 術后第5天6組海馬casepase3、Bcl-2表達比較

3 討論

大量研究顯示,術后學習記憶功能下降與海馬神經元及突觸數量減少、結構改變有關[8]。肥胖病人術后認知功能下降明顯[9],具體機制及有效防治措施尚不明確。本研究采用HFD造肥胖小鼠模型，肝部分切除術后1～5 d發(fā)現(xiàn)小鼠的學習記憶功能明顯下降。

α-LA是已知天然抗氧化劑中效果最強的一種,近年來,α-LA對神經細胞的保護作用取得很多研究者的認同。已報道的神經保護機制包括抑制凋亡信號調節(jié)激酶1/死亡結構域相關蛋白(ASK1/DAXX)信號、激活PI3K/AKT或PI3K/ERK途徑等[10-11]。有研究發(fā)現(xiàn)α-LA調控突觸可塑性蛋白[12],通過線粒體途徑抑制神經元細胞凋亡[13]。本研究結果顯示,α-LA干預12周可明顯改善HFD小鼠術后學習記憶功能,降低小鼠體質量,降低海馬casepase 3、Bcl-2表達水平。

突觸界面結構參數是反映突觸結構可塑性的敏感性指標, 與突觸的功能狀態(tài)及神經信息傳遞有重要的聯(lián)系。突觸界面曲率是突觸前后膜隔著突觸間隙相對應界面的曲率, 既反映神經遞質釋放的狀況, 又是突觸后膜上受體蛋白分子構像變化的標志。突觸活性區(qū)是突觸前膜與聚集成簇的突觸小泡相接觸形成的區(qū)域, 代表神經遞質釋放的有效面積。突觸間隙是一個神經元與另一個神經元信息溝通的部位, 其大小與形態(tài)對突觸活動的動力學有重要影響。PSD由突觸后膜內側胞漿中的蛋白復合體組成, 其中蛋白表達的改變就會引起PSD厚度的變化, 影響突觸的傳遞效率。PSD厚度越大, 越有利于神經元之間的相互溝通[15]。本研究結果顯示，α-LA干預12周后，小鼠的海馬突觸密度、活性區(qū)長度、PSD厚度明顯改善，說明α-LA可維持小鼠神經元、突觸正常結構。

綜上所述,α-LA對HFD誘導的肥胖小鼠術后學習記憶功能有保護作用,其機制可能與抑制海馬神經元凋亡,維持神經元、突觸正常結構有關。