李曉姣，趙圣國，鄭楠，程建波，王加啟

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細菌脲酶蛋白復合物及其活化機制

李曉姣1,2,3，趙圣國1,2，鄭楠1,2，程建波3，王加啟1,2

1 中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所 動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193 2 中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室，北京 100193 3 安徽農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，安徽 合肥 230036

脲酶能夠催化尿素分解生成氨，在農(nóng)業(yè)和醫(yī)學領域中具有重要的意義。細菌脲酶蛋白包括結構蛋白 (UreA、UreB和UreC) 和輔助蛋白 (UreD/UreH、UreE、UreF和UreG)，它們在脲酶活化過程中各自具有獨特的作用，結構蛋白形成脲酶活性中心，而輔助蛋白主要負責鎳離子的傳遞。文中綜述了細菌脲酶蛋白復合物的結構和功能，以及各蛋白之間如何相互作用完成其活化過程，以期為脲酶活性調(diào)控研究及脲酶抑制劑開發(fā)等提供理論指導。

細菌脲酶，結構蛋白，輔助蛋白，活化機制

脲酶 (尿素酶，EC 3.5.1.5) 廣泛存在于植物、動物、細菌、真菌和人體中，可以催化尿素水解形成氨和碳酸氫鹽[1]。尿素在自然界中大量存在，是生命過程主要的代謝物之一，通常情況下，尿素非常穩(wěn)定，極難水解。脲酶存在情況下，尿素的水解速率是無催化反應速率的1014倍。脲酶的主要作用是將尿素變成可供有機體使用的氮源，在自然界氮的新陳代謝過程中扮演著關鍵性的角色。

植物脲酶的主要作用是催化被植物體吸收的尿素的水解，使其作為可供吸收的氮源參與植物的生命過程，還可以參與植物防御系統(tǒng)中蛋白氮的轉運通路，履行對植物病原體的防御功能。在反芻動物生產(chǎn)中，飼喂尿素可以節(jié)約蛋白質(zhì)資源，降低飼料成本，尿素在瘤胃內(nèi)被瘤胃壁和瘤胃內(nèi)容物中主要來自于鏈球菌屬、埃希氏菌屬、乳酸桿菌屬等的微生物分解并釋放氨[2]，氨與酮酸結合被用于合成微生物蛋白，為機體提供優(yōu)質(zhì)氮源[3-4]。盡管脲酶的存在有著積極的意義，但也會造成不利影響。尿素水解過快會造成氨的非生產(chǎn)性揮發(fā)，當氨超出瘤胃微生物的利用能力，則易導致動物氨中毒[5]。此外，幽門螺桿菌、結核分枝桿菌、奇異變形桿菌等細菌脲酶與人和動物的許多發(fā)病機制相關，如幽門螺桿菌水解尿素產(chǎn)生的氨可以毒害胃粘膜的上皮細胞，因此醫(yī)學上通常使用脲酶活性測試實驗來確診幽門螺桿菌的感染。

由于脲酶獨特的生物學功能，其相關研究一直受到廣泛關注，包括不同來源脲酶的蛋白質(zhì)晶體結構及活化機制、脲酶的催化水解機理、脲酶抑制劑的研發(fā)應用等。脲酶的活性是影響尿素分解的主要因素，具有活性的脲酶屬于蛋白復合物，其活化需要各蛋白 (結構蛋白UreABC、輔助蛋白UreD/UreH、UreE、UreF和UreG等) 相互配合共同發(fā)揮作用將Ni2+傳遞至脲酶活性中心。此外，脲酶的活化還需要二氧化碳和GTP等的共同參與。文中重點介紹細菌脲酶蛋白質(zhì)的結構特性、促進脲酶金屬中心組裝的相關輔助蛋白的功能以及脲酶蛋白的活化路徑，以期為調(diào)控脲酶活性提供理論指導。

1 細菌脲酶基因簇結構

不同細菌來源的脲酶基因簇的結構有所不同，它們在基因的數(shù)量和順序上存在差異，包含結構基因 (、和)、輔助基因 (、、、、和等) 和調(diào)節(jié)基因 (等)[6]。如圖1，編碼產(chǎn)氣克雷伯氏菌脲酶的3個結構基因 () 的側翼是編碼輔助蛋白的4個基因 (位于上游，、和位于下游)。豆科根瘤菌的脲酶基因順序與產(chǎn)氣克雷伯氏菌相同，但有幾個未被注釋的開放閱讀框 (ORF) 插入其中[7]。除此之外，許多細菌位于之后，如嗜熱性芽孢桿菌sp. TB-90[8]。在胸膜肺炎放線桿菌中，簇前面含有編碼鎳轉運 (、、、、) 和尿素轉運的基因 ()[9]。幽門螺桿菌脲酶基因簇由、以及5個下游基因、、、和(與其他細菌的同源) 組成。還有一些微生物具有獨特的脲酶基因，如幽門螺桿菌除了含有完整的脲酶基因簇以外還具有第二組結構基因[10]?？莶菅挎邨U菌缺乏可識別的輔助蛋白基因[11]，這表明輔助蛋白不是體內(nèi)脲酶活化的必需因素。

圖1 細菌脲酶的基因簇組成[12]

2 細菌脲酶蛋白及其復合物

細菌脲酶蛋白包括結構蛋白和輔助蛋白。由結構基因、和編碼的γ、β和α亞基所形成的三聚體結構為脫輔基脲酶 (Apourease)，不具有脲酶活性。大多數(shù)細菌脲酶的活化需要至少4種輔助蛋白UreD/UreH、UreF、UreG和UreE的協(xié)助，分別由輔助基因/、、和編碼。此外，一些細菌在脲酶基因簇內(nèi)還包含有其他輔助基因，這些輔助基因編碼的蛋白質(zhì)可能具有ATP結合、尿素轉運、鎳離子轉運等功能，如HypA、HypB和UreI等。

2.1 結構蛋白

雖然不同來源的脲酶亞基數(shù)目、單體結構均有不同，但這些單體通常具有保守的氨基酸序列 (相似性超過50%)[12]。單體的活性區(qū)域均位于α亞基，每個亞基含有被氨基甲?；嚢彼針蚪拥碾p核鎳離子活性位點[13-14]。細菌脲酶通常由編碼的α亞基 (分子量在60–76 kDa)、編碼的β亞基 (分子量8–21 kDa) 和編碼的γ亞基 (分子量6–14 kDa) 組成 (αβγ)3三聚體結構，如產(chǎn)氣克雷伯氏菌脲酶 (圖2A) 和巴氏芽孢桿菌脲酶。幽門螺桿菌脲酶的單體α亞基 (編碼) 和β亞基 (編碼) 組成 ( (αβ)3)4雜聚體結構 (圖2B)，其UreA與產(chǎn)氣克雷伯氏菌的UreA-UreB融合體同源，UreB與產(chǎn)氣克雷伯氏菌的UreC同源。

2.2 輔助蛋白

2.2.1 UreD/UreH

在大腸桿菌中外源表達產(chǎn)生的UreD/UreH是不溶的，與麥芽糖結合蛋白融合時 (MBP-UreD)，產(chǎn)氣克雷伯氏菌的UreD是可溶的，并結合2當量的鎳離子[14]。在脲酶金屬中心組裝的過程中，UreD/UreH可能作為募集其他輔助蛋白的支架和鎳插入活性部位的直接促進劑，但其具體的鎳轉移方式仍不清楚。目前對于UreD的鎳轉移方式有2種推測，一種是UreD通過表面殘基轉移鎳離子，另外一種是鎳離子穿過UreD蛋白內(nèi)部通道進入脲酶活性中心[15]。此外，UreD/UreH對脲酶的活性具有重要意義，單獨添加鎳離子也可以在不存在UreE、UreF或UreG的情況下使脫輔基脲酶產(chǎn)生部分活性，但UreD/UreH不存在時無法激活脲酶[16]。

圖2 產(chǎn)氣克雷伯氏菌和幽門螺旋桿菌的脲酶結構蛋白[12]

2.2.2 UreF

產(chǎn)氣克雷伯氏菌外源表達的UreF蛋白也是不溶的，幽門螺桿菌UreF的天然形式是可溶的并且在單體和二聚體之間呈現(xiàn)平衡[17]。研究發(fā)現(xiàn)，UreF高度保守的C末端殘基在UreF:UreH復合物的形成中起重要作用，UreF:UreH復合物形成后，UreF的C末端殘基的排序發(fā)生改變，形成α螺旋 (殘基236–243)，其與UreH鏈15–17位的氨基酸殘基結合。在UreF不存在的情況下，UreH鏈15–17位上暴露的疏水性殘基可能會使蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，導致包涵體形成[18]。但是單獨的UreF的C末端殘基不足以與UreH形成可溶性復合物，還可能涉及UreF的其他殘基。此外，UreF和UreH之間的界面保守性較差，這可能是由于UreF和UreD/UreH序列內(nèi)的相似性較低的緣故。

2.2.3 UreG

UreG是一種可溶性蛋白，其金屬結合特性已經(jīng)從多種微生物中得到鑒定，包括產(chǎn)氣克雷伯氏菌[19]、巴氏芽孢桿菌[20]、結核分枝桿菌[21]和幽門螺桿菌[22]。產(chǎn)氣克雷伯氏菌的UreG是單體，結合1當量的鋅離子或鎳離子，巴氏芽孢桿菌和結核分枝桿菌的UreG蛋白質(zhì)是二聚體，2個單體通過二硫鍵連接，每個二聚體可以結合3個鋅離子和4個鎳離子[20]。幽門螺旋桿菌UreG蛋白的單體結合0.5當量鋅離子和2當量鎳離子[22]。

UreG是參與調(diào)控鎳供應的SIMIBI (信號識別顆粒MinD和BioD) 類的GTP酶[23-24]。SIMIBI GTP酶的生物功能通常由二聚化調(diào)控[25]。在GTP、鎳和碳酸氫鹽存在的條件下，UreG在單體和二聚體形式之間的轉換使其能夠動態(tài)組裝和拆卸金屬結合位點以將鎳遞送至目標脲酶。UreG的GTP酶活性還可通過調(diào)控UreF來提高脲酶金屬中心組裝的保真度[26]。研究表明，2個UreG的單體間的二聚體界面含有Cys66-Pro67-His68金屬結合基序，鋅的配位層是由來自UreG二聚體的每個單體的殘基Cys66和His68形成的，而UreG的Cys66和His68突變會導致其鎳離子結合能力喪失[27]。

2.2.4 UreE

UreE是金屬伴侶蛋白，在產(chǎn)氣克雷伯氏菌中，每個UreE同源二聚體結合6個鎳離子[28]。大多數(shù)鎳與UreE富含組氨酸的C末端 (HGHHHAHHDH HAHSH) 結合，但缺乏該區(qū)域的截短形式 (H144* UreE) 形成的同源二聚體仍然可以結合2個鎳離子[29]。幽門螺桿菌UreE蛋白在其C末端缺少富含組氨酸的區(qū)域，每個二聚體結合1個鎳離子[30]。

UreE可以與UreG相互作用成UreG:UreE復合物[31-33]。對于幽門螺旋桿菌，UreE二聚體與2個UreG單體結合，其結構可以通過鋅離子穩(wěn)定[34]。而來自產(chǎn)氣克雷伯氏菌的UreE二聚體與1個UreG單體結合后的結構，鋅離子或鎳離子均可使其達到穩(wěn)定狀態(tài)[35]。

2.2.5 其他輔助蛋白

HypA和HypB與細菌中[Ni,Fe]-氫化酶生物合成相關，它們對幽門螺桿菌和肝螺旋桿菌的脲酶活性具有重要作用[36]。氫化酶是一種與細菌能量來源相關的酶，HypA是一種鎳結合蛋白，被認為是氫化酶成熟的鎳伴侶蛋白[37]。UreE可與HypA形成三元復合物，由1個UreE二聚體和1個HypA單體組成。這種相互作用促進鎳從HypA向UreE的傳遞并增強脲酶活性[38]。幽門螺桿菌HypB不結合鎳，但其與UreG同源，具有氫化酶激活所需的GTP酶活性[39]。通常認為HypA和HypB通過形成HypA:HypB復合物將鎳插入到氫化酶的大亞基中，化學交聯(lián)研究表明HypA和HypB可形成異二聚體。在上述兩種螺桿菌中，和的突變幾乎消除了脲酶和氫化酶的活性[40]。

存在于胃和口腔細菌中，例如幽門螺桿菌和唾液鏈球菌，該基因編碼的蛋白被稱為尿素的轉運蛋白。UreI轉運蛋白是分子量為21.7 kDa的內(nèi)膜蛋白，其結構由6個亞基組成，每個亞基各自獨立運作并對應單一的功能通道[41]。UreI可以將尿素遞送至胞內(nèi)，隨后脲酶將尿素轉化為氨，UreI蛋白的活性對pH呈現(xiàn)很強的依賴性，其轉運作用在pH 6.0左右時關閉，在pH 5.0或更低時完全打開，使尿素迅速轉運至細胞質(zhì)內(nèi)[42]。

胸膜肺炎放線桿菌的、、、基因編碼的蛋白可能具有鎳轉運功能，用大腸桿菌表達基因及脲酶基因 ()，在普通LB培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下即可具有完整脲酶活性，而僅含脲酶基因 () 的細胞需要補充鎳離子以實現(xiàn)完整的脲酶活性[9]。假結核耶爾森菌脲酶基因簇中的5個基因 (、、、和) 也具有鎳轉運的功能，該區(qū)域的缺失會消除脲酶活性并降低微生物吸收鎳的速率[43]。唾液鏈球菌57.I 的脲酶基因簇的下游含有3個基因 (、和)，的插入失活會導致脲酶蛋白無法組裝鎳離子并喪失活性[44]。

3 細菌脲酶的活化過程

脲酶的活化實質(zhì)上是鎳離子與脲酶蛋白的金屬組裝過程，UreE將鎳離子傳遞給UreG[27,45]之后，攜帶鎳離子的UreG需要將鎳離子轉移給UreF，然后再穿過UreD/H通道進入脲酶，才能完成金屬中心的裝配[14,46-47]。化學交聯(lián)試驗表明，UreF與UreH的結合可以誘導脲酶的構象變化[48]，使鎳離子和二氧化碳進入活性位點[49]。

通過確定不同物種的脫輔基脲酶蛋白結構，發(fā)現(xiàn)脲酶的活性中心含有2個催化所必需的鎳離子，還有1個羧酸化的賴氨酸作為橋鍵，其羧基的2個氧原子分別與鎳離子配位[11]。在活化過程中，UreB是促進輔助蛋白與脲酶脫輔基蛋白相互作用的主要參與者，并指導鎳離子高效摻入 (UreC)新生活性位點[50]。有研究顯示，用含碳酸氫鹽與鎳離子的緩沖液孵育脲酶脫輔基蛋白，可產(chǎn)生約15%的活性脲酶蛋白；而先用鎳離子孵育脲酶脫輔基蛋白再加入碳酸氫鹽，則沒有檢測到脲酶活性，這一發(fā)現(xiàn)表明，CO2必須先于鎳與脲酶蛋白結合才能使其激活[51]。

目前提出的脲酶活化路徑有3種 (圖3)，差異主要體現(xiàn)在輔助蛋白與結構蛋白的結合方式以及輔助蛋白之間的結合順序上，但最后均需形成UreABC:UreD:UreF:UreG復合物，該復合物的形成被認為是鎳插入脲酶活性位點的關鍵步驟。此外，UreE-UreG的結合在脲酶的活化過程中也具有重要作用，將UreABC:UreD:UreF:UreG與純化的UreE混合，用生理濃度下的碳酸氫鹽、鎳和GTP孵育可將脲酶蛋白激活至野生型水平，但它們之間具體的分子機制還不完全清楚。

3.1 模式1：UreD、UreF和UreG依次與UreABC結合

UreD是產(chǎn)氣克雷伯氏菌脲酶體內(nèi)活化所必需的，UreD與編碼脲酶結構蛋白的基因過度表達時，可以得到純化的UreABC:UreD蛋白復合物[51,53]。MBP-UreD可以在細胞內(nèi)與UreABC聯(lián)合，但不能與UreAC (即脲酶缺失UreB) 聯(lián)合?；瘜W交聯(lián)研究結果表明，UreD緊鄰UreB和UreC[48]，而小角度X射線散射 (SAXS) 研究也證實了UreABC: UreD復合物中，UreD與UreABC復合物的UreB結合[49]。

圖3 脲酶活化機制與模式示意圖

UreF和UreD以及UreABC的高度表達可以形成UreABC:UreD:UreF復合物，但是僅表達UreF與UreABC無法形成復合物。將純化得到的UreABC:UreD:UreF復合物用天然凝膠的蛋白免疫印跡進行分析，發(fā)現(xiàn)每個 (UreABC)3脫輔基蛋白含有0–3個UreDF異二聚體[17]。小角度X射線散射實驗顯示UreD和UreF之間緊密接觸，2種輔助蛋白都結合在UreB附近[49]。化學交聯(lián)和蛋白水解片段的基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜進一步證明了UreF與UreD之間的關系，研究顯示，UreD抗體不能檢測到UreABC:UreD:UreF復合物，但是能檢測到UreABC:UreD復合物，這表明UreF與UreD抗原表位結合[17]。

將UreG與UreABC:UreD:UreF混合可以得到UreABC:UreD:UreF:UreG復合物，在標準激活條件下，該復合物可以得到60%的活性脲酶，使用高于生理水平的碳酸氫鹽和鎳離子孵育脲酶蛋白，會降低脲酶活性，但提高GTP的濃度會極大地促進脲酶活化[54]。將UreG的與GTP相關的作用位點進行突變，會極大地降低UreABC:UreD:UreF: UreG復合物脲酶的活性，說明UreG的GTP酶的作用對脲酶的活化具有重要意義。

3.2 模式2：UreD:UreF:UreG直接與UreABC結合

產(chǎn)氣克雷伯氏菌可以在體內(nèi)單獨表達UreD: UreF:UreG復合物，但其溶解性很差[19]。幽門螺桿菌的UreH:UreF:UreG復合物的結構顯示 (圖4)，UreF需要與UreH結合形成復合物引發(fā)構象變化后，UreF二聚體才具有結合2個UreG的能力。UreG先前被認為是一種特定的鋅離子結合伴侶，沒有鎳結合能力[40]，而UreG:UreF:UreH復合物的結構清楚地表明UreG可以結合鎳離子[55]。

MBP-UreD:UreF:UreG復合物具有很好的溶解性，并且可以與脫輔基脲酶結合[51]。在含有高濃度鎳和碳酸氫鹽的標準緩沖液中，異源三聚體UreG:UreF:UreH可以與脫輔基脲酶結合并促進脲酶活化，說明UreG:UreF:UreH復合物作為脲酶特異性分子伴侶發(fā)揮功能[56-57]。

圖4 幽門螺桿菌(UreH:UreF:UreG)2復合物的結構[53]

圖5 幽門螺桿菌UreE2/Ni的結構[30]

3.3 模式3：UreE:UreG與UreABC、UreD: UreF的結合

UreE被認為是脲酶活化過程中的鎳來源，UreE與鎳結合的結構位于2個UreE單體之間的界面處 (圖5)[30]。拉下實驗 (Pull-down assay) 表明，產(chǎn)氣螺桿菌UreG和UreE在鎳存在下形成復合物，它們之間通過蛋白質(zhì)相互作用進行鎳的轉移[35]。有研究提出，UreG與UreE之間的相互作用位置可能位于UreG鎳結合位點附近的蛋白質(zhì)表面，而這個位置被埋在(UreH:UreF:UreG)2復合物中[27,58]。GTP可以誘導UreG的構象變化，使(UreH:UreF:UreG)2復合物不穩(wěn)定，UreG從復合物中解離并與攜帶鎳荷電的UreE二聚體形成(UreE:UreG)2復合物[59]。

幽門螺桿菌中，UreG與UreE在GDP存在的條件下形成UreE2:UreG復合物，但在GTP存在的條件下則會形成 (UreE:UreG)2復合物，并接受來自UreE的鎳[27]。攜帶鎳離子的UreG二聚體可以與脫輔基蛋白和 (UreH:UreF)2形成具有活性的脲酶復合物[49]。這可能是由于GTP水解為GDP導致UreG的CPH基序的構象發(fā)生變化，破壞了由Cys66/His68組成的正方形平面構型，使 (UreE:UreG)2復合物釋放了攜帶鎳離子的UreG。而此時的UreG處于CDP約束狀態(tài)更傾向與 (UreH:UreF)2形成 (UreH:UreF:UreG)2復合物，該復合物繼續(xù)轉運鎳離子進一步促進脲酶活化[59]。

4 總結與展望

綜上所述，細菌脲酶的活化需要結構蛋白、輔助蛋白 (UreD/H、UreE、UreF和UreG)、鎳離子、GTP水解及碳酸氫鹽共同發(fā)揮作用。在活化過程中，UreD是第一個與結構蛋白結合的輔助蛋白；UreF可以與UreD結合增加UreD的可溶性，也可作為GTP酶的活化蛋白來調(diào)節(jié)UreG的功能。UreG是一種GTP酶，在脲酶活化中，將GTP替換為不可被水解的GTP類似物會抑制脲酶活化，表明UreG的GTP酶活性是脲酶活化所必需的。最后，UreE在GTP存在的條件下，將其募集的鎳離子轉移給UreG或結構蛋白與UreF2H2形成的復合物。脲酶活化是一個復雜的過程，目前研究較為廣泛的是產(chǎn)氣克雷伯氏菌和幽門螺旋桿菌細菌脲酶蛋白的功能性質(zhì)以及活化方式，但是還有許多基本問題未得到解答，各脲酶蛋白在活化過程中的確切功能仍然未知。此外，自然界中的微生物大部分都是未培養(yǎng)微生物，無法通過分離培養(yǎng)獲得菌株及其生理代謝特征，因此未培養(yǎng)微生物脲酶的基因結構與功能是否與可培養(yǎng)微生物類似值得深入研究?；谀壳暗难芯楷F(xiàn)狀，筆者認為，未來還應在以下幾個方面加強研究。

1) 本實驗室從事瘤胃尿素分解菌研究多年，包括瘤胃尿素分解菌的體外分離與培養(yǎng)、脲酶抑制劑的開發(fā)應用以及通過高通量測序確定了瘤胃中的脲酶優(yōu)勢分解菌群等。在尿素分解菌的體外培養(yǎng)方面，我們通過厭氧滾管和調(diào)整培養(yǎng)基等技術，從瘤胃液分離得到了溶糊精琥珀酸弧菌、布氏密螺旋體和白色瘤胃球菌，從瘤胃壁上分離獲得了地衣芽孢桿菌和奇異變形菌，共5種尿素分解菌[60]。為了抑制瘤胃脲酶活性，我們實驗室還對脲酶抑制劑乙酰氧肟酸的合成工藝進行了優(yōu)化，通過奶牛飼養(yǎng)實驗驗證了該產(chǎn)品顯著抑制了瘤胃尿素的分解。還運用自主研發(fā)的人工瘤胃模擬系統(tǒng)進行了體外發(fā)酵實驗，尿素和乙酰氧肟酸分別作為激活劑和抑制劑，利用高通量測序技術研究尿素分解菌16S rRNA 基因變化，揭示了瘤胃優(yōu)勢尿素分解菌為假單胞菌屬、鏈球菌屬、嗜血桿菌屬、芽孢桿菌屬、奈瑟氏菌屬、放線菌屬和琥珀酸弧菌科[5]。

但是我們對抑制劑抑制尿素分解菌的作用原理并不清楚，因此將研究方向進一步擴展為：找到瘤胃優(yōu)勢脲酶分解菌，研究該細菌脲酶的活化模式，繼而為開發(fā)新的脲酶抑制劑墊定基礎。由于目前對瘤胃中尿素分解菌的分布和多樣性知之甚少，而脲酶基因 () 是分析各種環(huán)境中的尿素分解菌的目標基因。我們通過尿素飼喂奶牛，收集瘤胃液相、固相和瘤胃壁的細菌樣品，使用Miseq進行基因的擴增和測序，多樣性分析表明，甲基球菌科、梭菌科、類芽孢桿菌科、螺桿菌科和嗜甲基菌科的基因豐度較高[4]。

隨著宏基因組學的快速發(fā)展，為研究未培養(yǎng)微生物種類與功能提供了重要研究方法，因此通過宏基因組技術獲得未培養(yǎng)微生物脲酶基因簇，開展結構分析、活化過程和影響因素研究，將是未來重點開展的研究方向。所以我們利用宏基因組測序技術將得到的基因片段進行拼接、Binning (分箱分析)、繪制基因草圖，得到了多個基因簇。再將這些基因簇與之前得到的優(yōu)勢細菌序列進行比對，最終獲得優(yōu)勢脲酶細菌的基因簇。將脲酶基因全長和結構基因在體外誘導表達，發(fā)現(xiàn)脲酶全長基因表達的蛋白的活性遠高于結構蛋白的活性，還需進一步研究該細菌脲酶蛋白的生物功能。

2) 輔助蛋白的功能研究：已有研究證明，帶鎳的UreG二聚體可以與UreF2H2和結構蛋白形成復合物，并且UreG和UreF2H2之間的相互作用對于脲酶活化至關重要，但是尚不清楚UreG二聚體是如何與結構蛋白和UreF2H2相互作用的。并且UreG可以與UreE形成UreE2G2復合物，該復合物中UreG是以單體的形式還是二聚體的形式與UreE2結合也未知。目前比較缺乏對UreD/UreH與UreF的研究，我們在實驗過程中也發(fā)現(xiàn)UreD與UreF相對于其他輔助蛋白穩(wěn)定性和可溶性均較差，而UreD/UreH與UreF是脲酶活化方面的關鍵輔助蛋白，所以UreF與UreD/UreH之間如何轉移鎳離子并傳遞至結構蛋白將是今后研究的重點。

3) 脲酶抑制劑的開發(fā)：先通過將具有活性的脲酶蛋白與抑制劑進行體外實驗，通過IC50等指標篩選出具有活性抑制作用的產(chǎn)品。之后利用等溫量熱或表面等離子共振等技術研究該抑制劑所抑制的關鍵功能蛋白，對新型脲酶抑制劑的開發(fā)應用具有重要意義。

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Progress in bacterial urease complexes and their activation mechanisms

Xiaojiao Li1,2,3, Shengguo Zhao1,2, Nan Zheng1,2, Jianbo Cheng3, and Jiaqi Wang1,2

1 State Key Laboratory of Animal Nutrition, Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China 2 Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Dairy Products of China Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China 3 College of Animal Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, Anhui, China

Urease decomposes urea to ammonia, and has application potential in agriculture and medical treatment. Urease proteins include structural proteins (UreA, UreB and UreC) and accessory proteins (UreD/UreH, UreE, UreF and UreG), each of them has its own unique role in urease maturation. The structural proteins form the active center of urease, and the accessory proteins are responsible for the delivery of nickel. We review here the structure and function of bacterial urease complexes, and how each protein interacts to complete the activation process. We hope to provide theoretical basis for the regulation of urease activity and the development of urease inhibitors.

bacterial urease, structural protein, accessory protein, activation mechanism

June 10, 2018;

October 11, 2018

National Natural Science Foundation of China (Nos. 31501981, 31430081), the Agricultural Science and Technology Innovation Program (No. ASTIP-IAS12), Modern Agro-Industry Technology Research System of China (No. CARS-37).

Shengguo Zhao. Tel: +86-10-62816069; Fax: +86-10-62897587; E-mail: zhaoshengguo@caas.cn

國家自然科學基金 (Nos. 31501981, 31430081)，中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程 (No. ASTIP-IAS12)，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系專項資金(No. CARS-37) 資助。

2018-11-21

10.13345/j.cjb.180239

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20181119.1735.001.html

(本文責編 陳宏宇)