沈鳳，楊鵬，陶曉靜，顏淵鴛，李丹，歐和生,2

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27nt-miRNA對間充質干細胞向血管平滑肌細胞分化的影響

沈鳳1，楊鵬1，陶曉靜1，顏淵鴛1，李丹1，歐和生1,2

1 廣西醫(yī)科大學 藥學院，廣西 南寧 530021 2 廣西中醫(yī)藥大學附屬廣西國際壯醫(yī)院，廣西 南寧 530001

沈鳳, 楊鵬, 陶曉靜, 等. 27nt-miRNA對間充質干細胞向血管平滑肌細胞分化的影響.生物工程學報, 2019, 35(2): 290–297.Shen F, Yang P, Tao XJ, et al. Effect of 27nt-miRNA on the differentiation of mesenchymal stem cells into vascular smooth muscle cells. Chin J Biotech, 2019, 35(2): 290–297.

為探討27nt-miRNA對間充質干細胞向血管平滑肌細胞分化影響，構建27nt-miRNA過表達、反義序列Anti-27nt-miRNA以及陰性對照的表達質粒，慢病毒包裝后分別轉染人臍帶間充質干細胞 (hUCMSC)，加入Ⅳ型膠原誘導hUCMSC定向分化為血管平滑肌細胞。四唑鹽 (MTT) 比色法檢測分化后細胞活力，免疫細胞化學染色法檢測分化后細胞SM22α (兔抗平滑肌22α，smooth muscle 22α) 的表達，Western印跡法和RT-PCR檢測分化后細胞內的SMA (兔抗平滑肌肌動蛋白，smooth muscle actin) mRNA、SM 22α mRNA及其蛋白質表達情況。經檢測，27nt-miRNA過表達分化組與陰性對照組相比，細胞活力下降20.48% (<0.05)，SMA mRNA、SM22α mRNA及其蛋白質表達量明顯升高 (<0.05)；而Anti-27nt-miRNA分化組細胞活力上升了18.07% (<0.05)，SMA mRNA、SM22α mRNA及其蛋白質表達量下降 (<0.05)。綜上所述，27nt-miRNA能夠促進間充質干細胞向血管平滑肌細胞分化，并且抑制分化后的細胞活力。

27nt-miRNA，間充質干細胞，血管平滑肌細胞，SM22α，SMA

血管組織工程是一門利用血管組織中相關細胞和對應的細胞外基質，通過人工制取并重建形成三維血管組織的科學，它為臨床心血管疾病的細胞治療、移植治療開辟了新的方向。獲取種子細胞、構建合適種子細胞支架并成功種植是血管組織工程的3個關鍵步驟。血管平滑肌細胞 (Vascular smooth muscle cells，VSMCs) 位于血管中膜，在血管舒縮功能的維持及血管相關疾病如高血壓、缺血性心腦血管疾病、動脈粥樣硬化等疾病的診療中發(fā)揮重要作用[1-2]。此外，VSMC是構建血管組織工程中的重要種子細胞[3]。目前，用于構建組織工程的VSMC主要來源自成體血管組織和成體干細胞[4]，但從成體血管分離的成熟血管平滑肌細胞體外增殖能力有限，很難滿足血管組織工程中的種子細胞數(shù)量。因此，可以高效分化為有功能的VSMC的干細胞，在血管組織工程具有良好的應用前景。

干細胞具有無限增殖能力、多分化潛能的優(yōu)點，成為血管組織工程的理想種子細胞來源。根據(jù)來源不同，干細胞大致分為胚胎干細胞和成體干細胞。間充質干細胞 (Mesenchymal stem cells，MSCs) 是成體干細胞中的一種，它來源中胚層，易于分離培養(yǎng)，增殖速度快，異體排斥反應小，具有多向分化潛能。在特定的誘導環(huán)境下，MSCs可以定向分化為骨細胞、脂肪細胞、內皮細胞、心肌細胞等。據(jù)報道，MSCs還可以分化為VSMC，成為研究VSMC分化的理想模型[5]。

微小RNA (MicroRNAs，miRNAs) 是真核生物中一類長度約為22個核苷酸的非編碼小分子RNA，它們在序列和結構上多樣化，參與基因轉錄后水平調控。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs通過調節(jié)基因的表達參與干細胞自我更新和分化過程的調控，在干細胞定向分化過程中起重要作用[6-7]，更重要的是某些miRNAs通過調節(jié)干細胞定向分化過程為心血管疾病治療提供新策略[8]。27nt-miRNA來源于內皮型一氧化氮合酶 (Endothelial nitric oxide synthase，eNOS) 基因第4內含子中的27堿基重復序列，它在心血管疾病的診療中已被廣泛研究，內含子源性27nt-miRNA可以抑制內皮細胞的增殖、遷移，同時可以調節(jié)內皮細胞代謝產物一氧化氮 (Nitric oxide，NO) 的產生和釋放[9]，但其在干細胞定向分化為VSMC的研究尚未見報道。因此，本研究的目的是探討27nt-miRNA對間充質干細胞向血管平滑肌細胞分化影響，其結果可能為干細胞在心血管相關疾病的預防和治療提供新依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人臍帶間充質干細胞hUCMSCs (上海華雅思創(chuàng)生物科技有限公司)；血清替代品(PALL，美國)；培養(yǎng)基 (LONZA，美國)；DMEM培養(yǎng)基 (Gibco公司)；胎牛血清 (Lonsera公司)；胰蛋白酶消化液 (Gibco公司)；Ⅳ型膠原 (Thermo Fisher)；四甲基偶氮唑鹽 (MTT) (索萊寶科技有限公司)；RNA提取試劑盒 (北京百泰克生物技術有限公司)；RT試劑盒 (MBI)；PCR試劑盒 (天根生化科技有限公司)；慢病毒載體 (上海吉凱基化學技術有限公司)；兔抗平滑肌22α單抗 (Smooth muscle 22α，SM22α)、內參GAPDH抗體(Proteintech)；兔抗平滑肌肌動蛋白單抗 (Smooth muscle actin，SMA) (Abcam，美國)；酶標二抗山羊抗兔IgG (Proteintech)；超敏ECL化學發(fā)光試劑盒 (碧云天)；免疫組化通用性試劑盒 (中杉)。

超凈工作臺 (新加坡藝思高科技有限公司)；倒置顯微鏡 (日本Olympus公司)；CO2飽和濕度培養(yǎng)箱 (美國Thermo Forma公司)；酶聯(lián)免疫檢測儀Model-450 (美國Thermo Forma公司)；低速離心機 (上海菲恰爾分析儀器有限公司)；立式壓力蒸汽滅菌鍋 (海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)；?80 ℃冰箱 (Haier公司)；蛋白電泳儀、蛋白質轉膜儀 ( Bio-Rad，美國)；Alpha化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)Fluor Chem HD2 (美國Protein Simple公司)；ABI7700熒光定量PCR儀 (ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1 27nt-miRNA病毒的構建和鑒定

以eNOS第4內含子中27堿基重復序列 (5′-GA AGTCTAGACCTGCTGCAGGGGTGAG-3′) 為設計根據(jù)，以Ubi-MCS-SV40-EGFP-IRES-puromycin為載體，用Ⅰ/Ⅰ進行酶切，轉染293FT細胞后，濃縮得到27nt-miRNA過表達慢病毒顆粒，同時根據(jù)發(fā)夾結構構建反義序列Anti-27nt-miRNA和陰性對照病毒NC。病毒載體上帶有綠色熒光并含有嘌呤霉素抗性，綠色熒光可用來識別慢病毒是否成功轉染，加入嘌呤霉素進行篩選，建立穩(wěn)定細胞株。

1.2.2 人臍帶間充質干細胞 (hUCMSC) 的培養(yǎng)和轉染

hUCMS用含2%血清替代品、2%谷氨酰胺和1%青霉素/鏈霉素的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，放置37 ℃、5% CO2恒溫飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞密度大于90%時，傾去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞。加入0.15%胰蛋白酶進行消化傳代。選擇生長狀態(tài)良好的第3–5代細胞轉染，按5×105細胞/孔的濃度接種6孔板，混勻后正常靜置培養(yǎng)24 h。3種慢病毒以MOI=70分別感染hUCMS，置于培養(yǎng)箱孵育48 h，在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況，加入嘌呤霉素 (8 μg/mL) 進行篩選。實驗分為3組：27nt-miRNA組、NC組、Anti-27nt-miRNA組。

1.2.3 hUCMSC分化

轉染后的3組細胞進行消化傳代，將吹打成單細胞的hUCMSC接種到Ⅳ型膠原 (5 g/mL) 包被的細胞培養(yǎng)瓶中，添加分化培養(yǎng)液 (含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基)，連續(xù)培養(yǎng)14 d，根據(jù)情況2–3 d換液。

1.2.4 MTT法檢測細胞活力

誘導分化14 d后的3組細胞，以每孔6×103個細胞接種到96孔板中，放置37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。12 h后更換無血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。于24 h后更換成含PDGF-BB (5 ng/mL)的5% FBS/DMEM培養(yǎng)24 h后加入MTT培養(yǎng)4 h，使用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長處測每孔值。

1.2.5 免疫組化檢測VSMC分化標志物SM 22α的表達

采用免疫組化檢測。將轉染成功的3組hUCMSC接種到Ⅳ型膠原包被的蓋玻片上進行分化培養(yǎng)。第14天時，取出玻片，PBS沖洗3次，中性樹脂粘片，4%甲醛固定。用Triton X-100 (10 min) 和3%過氧化氫 (30 min) 處理后雙蒸水沖洗3次，敷一抗、二抗后顯色劑顯色。顯微鏡觀察、拍照，并計算細胞陽性率。實驗重復3次，取平均值。

1.2.6 RT-PCR檢測細胞SM A mRNA、SM22α mRNA的表達

分化第14天時，收集3組細胞樣本，根據(jù)TRIzol試劑盒說明書提取各組細胞的總RNA，利用Primer Premier 5.0軟件設計合成SMA、SM22α和GAPDH的引物，見表1。分別取各組細胞RNA 1 μg，加入1 μL (0.5 g/L) Oligo(dT)18Primer，70 ℃變性5 min后立即放置冰上冷卻。加4 μL反應緩沖液 (5×)，1 μL Ribo LockTMRibonuclease Inhibitor (20 U/μL)，2 μL 10 mmol/L dNTP Mix，37 ℃溫育5 min，加入1 μL逆轉錄酶，42 ℃反應1 h，之后70 ℃孵育10 min終止反應，得到cDNA第一條鏈。PCR擴增反應：94 ℃預變性5 min后，開始30個循環(huán) (94 ℃ 30 s、56 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min)，最后72 ℃ 5 min，終止反應。取5 μL PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

表1 引物序列

1.2.7 Western blotting檢測細胞內SMA和SM 22α蛋白表達

分化第14天時，收集3組細胞樣本，分別用RIPA緩沖液裂解，12 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清。分別取各組的蛋白30 μg進行SDS-PAGE (10%) 分離并轉移到PVDF膜上。用脫脂奶粉封閉1 h后加入SMA (1∶1 000)、SM22α (1∶1 000)一抗?jié)窈羞^夜 (4 ℃)。第二天用TBST沖洗3次 (每次10 min)，然后加入酶標二抗山羊抗兔IgG (1∶2 000) 孵育2 h，重復用TBST沖洗3次 (每次10 min)。加入顯色劑，利用Alpha化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)分析。實驗重復3次，取平均值。

1.2.8 統(tǒng)計學方法

2 結果與分析

2.1 27nt-miRNA高表達、Anti-27nt-miRNA、NC轉染效果

分別將3種慢病毒以MOI=70分別感染hUCMS，48 h后在熒光電子顯微鏡下觀察轉染效率 (顯微鏡下觀察到的綠色熒光代表成功轉染慢病毒的細胞)，結果如圖1所示，3種慢病毒轉染效率達90%以上，用嘌呤霉素進行篩選，用于后續(xù)實驗。

2.2 27nt-miRNA對分化后VSMC的活力影響

各組細胞分化14 d后，用MTT法檢測27nt-miRNA對PDGF-BB誘導分化后細胞活力的影響 (圖2)。與陰性對照 NC組比較，27nt-miRNA組的值下降20.48% (0.66±0.06 vs. 0.83±0.03，<0.05)，而Anti-27nt-miRNA組升高18.07% (0.83±0.03 vs. 0.98±0.07，<0.05)。以上結果提示，27nt-miRNA抑制hUCMSC分化后細胞的活力。

圖1 顯微鏡下觀察到hUCMS的轉染情況

圖2 MTT檢測27nt-miRNA對細胞活力影響

2.3 27nt-miRNA對VSMC分化標志物SM22α表達的影響

用免疫細胞化學染色方法 (ICC) 檢測分化后各組細胞中的VSMC特異性蛋白SM22α的表達量，如圖3所示，SM22α蛋白主要表達于細胞胞漿，陽性染色呈棕黃色顆粒。運用IPP6.0軟件對SM22α蛋白表達量進行計算：平均光密度 (Mean optical density)越大，SM22α蛋白表達越高。與陰性對照NC組比較，27nt-miRNA組SM22α表達量增加63.64% (0.22±0.02 vs. 0.36±0.04，<0.05)；而Anti-27nt-miRNA組SM22α表達量下降36.36% (0.22±0.02 vs. 0.14±0.03，<0.05)。結果提示，27nt-miRNA促進了VSMC分化標志物SM22α表達。

圖3 免疫組化檢測27nt-miRNA對細胞SM22α蛋白表達的影響

圖4 PT-PCR檢測27nt-miRNA對SMA mRNA和SM22α mRNA表達的影響

2.4 RT-PCR檢測27nt-miRNA對SMA mRNA和SM22α mRNA的影響

用RT-PCR檢測分化后各組細胞的SMA mRNA、SM22α mRNA的表達水平 (圖4)。與陰性對照NC組比較，27nt-miRNA組的SM22α mRNA表達量增加31.40% (0.86±0.03 vs. 1.13±0.08，<0.05)、SMA mRNA表達量上升25.00% (0.72±0.03 vs. 0.90±0.03，<0.05)；而Anti-27nt-miRNA組SM22α mRNA表達量降低12.80% (0.86±0.03 vs. 0.75±0.04，<0.05)、SMA mRNA表達量下降27.78% (0.72±0.03 vs. 0.52±0.05，<0.05)。結果提示，27nt-miRNA促進了SMA mRNA、SM22α mRNA的轉錄。

2.5 Western blotting檢測27nt-miRNA對SMA、SM22α蛋白質表達的影響

用Western blotting檢測分化后各組細胞的SMA、SM22α蛋白質的表達水平，如圖5所示。與陰性對照 NC組比較，27nt-miRNA組的SM22α表達量增加28.33% (0.60±0.03 vs. 0.77±0.04，<0.05)、SMA表達量上升30.00% (0.40±0.02 vs. 0.52±0.04，<0.050)；而Anti-27nt-miRNA組SM22α表達量降低18.33% (0.60±0.03 vs. 0.49±0.03，<0.05)、SMA表達量下降22.50% (0.40±0.02 vs. 0.31±0.03，<0.05)。結果提示，27nt-miRNA促進SMA、SM22α的表達。

圖5 Western blotting檢測27nt-miRNA對SMA和SM22α蛋白表達的影響

3 討論

本研究通過向hUCMSCs分別轉染27nt-miRNA過表達、反義序列Anti-27nt-miRNA及陰性對照NC三種慢病毒后，定向分化為VSMCs，結果發(fā)現(xiàn)27nt-miRNA可以促進hUCMSCs向VSMCs分化，表現(xiàn)為VSMCs分化標志物SMA、SM22α表達增高，同時抑制分化后細胞的增殖。SMA是VSMCs最常用的分化標志物，但它特異性不強，在胚胎期的心肌、成纖維細胞、內皮細胞及多種腫瘤細胞中均有表達[10]。為提高研究的可信度，我們還增加了SM22α分化標志物，它的特異性比SMA高，僅表達于內臟平滑肌和VSMCs[11]。SMA、SM22α在27nt-miRNA過表達組均顯著提高，表明27nt-miRNA可特異性促進VSMCs分化。

干細胞的多向分化潛能及可塑性已經得到普遍的認可，是組織工程中的理想種子細胞。研究發(fā)現(xiàn)，干細胞在誘導條件下可以定向分化為神經樣細胞，在神經退行性疾病和神經細胞保護中發(fā)揮重要作用[12]；在一定條件下，干細胞定向分化為脂肪細胞，為自體脂肪移植的臨床應用提供新思路[13]；此外，干細胞還可以分化為成骨細胞，促使成骨細胞和破骨細胞趨于平衡[14]。更令人感興趣的是，干細胞在心血管疾病中也起了重要作用[15]。心血管疾病已成為威脅人類健康的重要疾病之一，高血壓、心肌梗死、先天性心臟病等心血管疾病發(fā)病率及病死率逐年升高。VSMCs、內皮細胞及心肌細胞的功能改變及其凋亡與這些疾病發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系，因此，找到理想的種子細胞是關鍵。來自于人類臍帶間充質干細胞 (MSCs) 可能是VSMCs新來源，因為它們表現(xiàn)出非常低的同種免疫反應和致瘤風險[16-17]。研究表明，間充質干細胞可以定向分化為內皮細胞[18]、心肌細胞[19]及血管平滑肌細胞[20]，其分化VSMCs的條件有TGF-β、PDGF-BB、Ⅳ型膠原、高濃度的血清等[21-22]。本研究中采用了Ⅳ型膠原作為誘導劑，MSCs分化過程中出現(xiàn)VSMCs分化標志物SMA、SM22α，表明分化成功。

miRNAs在心血管疾病和干細胞分化的關鍵調節(jié)作用獲得越來越多的關注，并被認為是治療心血管疾病的新靶點。Wu等[23]研究發(fā)現(xiàn)，miR-214通過靶向結合QKI蛋白促進胚胎干細胞分化為VSMCs；Gu等[5]研究發(fā)現(xiàn)miR503通過靶目標SMAD7促進間充質干細胞分化為VSMCs，而miR-222-5P通過ROCK2抑制VSMCs分化。這些miRNAs在干細胞定向分化VSMCs起到重要作用。據(jù)我們所知，27nt-miRNA在心血管系統(tǒng)發(fā)揮重要作用[9,24]，但是它的表達和生物功能在干細胞定向分化VSMCs中的調控作用尚不清楚。本研究中hUCMSCs定向分化VSMCs模型中分別轉染被病毒包裝的27nt-miRNA過表達、反義序列Anti-27nt-miRNA以及陰性對照NC質粒，分化14 d后發(fā)現(xiàn)27nt-miRNA過表達組的SMA、SM22α表達量明顯增高，表明27nt-miRNA可以促進hUCMSCs定向分化VSMCs，并且可能是通過調控SMA、SM22α基因從而影響VSMCs分化。但是VSMCs的分化機制十分復雜，涉及到多個不同層面的調節(jié)，包括表觀遺傳學修飾、基因轉錄和轉錄后水平、翻譯以及翻譯后調節(jié)等[25]，這些VSMCs分化機制問題有待今后深入探討。

綜上，本研究初步明確27nt-miRNA可以促進hUCMSCs定向分化VSMCs，并且能夠抑制PDGF-BB誘導的VSMCs增殖，這一作用對于組織工程血管的構建有重要意義，可能為其提供VSMCs種子細胞。但是，本研究也存在一些不足之處，例如，VSMCs分化是一個多因素調節(jié)的過程，不是單一分子或基因所調控，可能還通過其他通路起作用。此外，沒有明確分化成功VSMCs的表型，這些問題都有待進一步探討。

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Effect of 27nt-miRNA on the differentiation of mesenchymal stem cells into vascular smooth muscle cells

Feng Shen1, Peng Yang1, Xiaojing Tao1, Yuanyuan Yan1, Dan Li1, and Hesheng Ou1,2

1 College of Pharmaceutical Sciences, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi, China 2 The Affiliated Guangxi International Zhuang Hospital, Guangxi Traditional Chinese Medicine, Nanning 530001, Guangxi, China

To investigate the effect of 27nt-miRNA on the differentiation of mesenchymal stem cells into vascular smooth muscle cells. The highly expression plasmids of 27nt-miRNA and anti-27nt-miRNA, and negative control plasmids were constructed, packaged with lentivirus and transfected into human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUCMSCs). Collagen IV was added to induce hUCMSCs differentiation into blood vessel smooth muscle cells (VSMCs). The cell viability was measured by MTT assay. The expression of SMA, SM22α at mRNA and protein levels was determined by RT-PCR, immunocytochemical staining and Western blotting. Compared with the negative control group, the viability of the 27nt-miRNA overexpression group was decreased by 20.48% (<0.05), and the expression of SMA mRNA and SM22α mRNA and protein was significantly increased (<0.05); the viability of Anti-27nt-miRNA group was increased 18.07% (<0.05), and the expression of SMA mRNA and SM22α mRNA and protein was decreased (<0.05). In summary, 27nt-miRNA promotes mesenchymal stem cells differentiation into vascular smooth muscle cells and inhibits cells viability.

27nt-miRNA, mesenchymal stem cells, vascular smooth muscle cells, SM22α, SMA

June 16, 2018;

October 8, 2018

National Natural Science Foundation of China (No. 81373403).

Hesheng Ou. Tel: +86-771-3376878; E-mail: 2676611767@qq.com

10.13345/j.cjb.180243

國家自然科學基金(No. 81373403) 資助。

(本文責編 陳宏宇)