張雨欣，阮亞男，趙宸，薛敏敏，李博，王晶晶，劉洋，王凱璽，王紅艷

?

運(yùn)用MSAP技術(shù)測(cè)定谷子基因組DNA胞嘧啶甲基化水平

張雨欣1*，阮亞男1*，趙宸1，薛敏敏1，李博1，王晶晶1，劉洋1，王凱璽2，王紅艷1

1 遼寧大學(xué) 生命科學(xué)院 植物表觀遺傳與進(jìn)化實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng) 110036 2 遼寧省水土保持研究所，遼寧 朝陽(yáng) 122000

張雨欣, 阮亞男, 趙宸, 等. 運(yùn)用MSAP技術(shù)測(cè)定谷子基因組DNA胞嘧啶甲基化水平. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(2): 263–269.ZhangYX, Ruan YN, Zhao C, et al. Analysis of genomic DNA methylation level in foxtail millet by Methylation Sensitive Amplified Polymorphism. Chin J Biotech, 2019, 35(2): 263–269.

DNA甲基化是真核生物一種重要的表觀修飾形式。為了探討谷子基因組DNA胞嘧啶甲基化的水平和模式，以谷子的兩個(gè)品種朝谷58號(hào)和豫谷1號(hào)為實(shí)驗(yàn)材料，利用RⅠ和Ⅱ/Ⅰ雙酶切建立適合于谷子基因組的甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性 (MSAP) 分析體系。結(jié)果表明，從100對(duì)MSAP選擴(kuò)引物中，篩選出32對(duì)MSAP引物組合，在朝谷58號(hào)和豫谷1號(hào)中分別擴(kuò)增產(chǎn)生1 615、1 482條清晰可辨且可重復(fù)的DNA條帶，其中包括3種類型的甲基化條帶，朝谷58號(hào)和豫谷1號(hào)的基因組中CCGG序列胞嘧啶甲基化水平分別為6.93%和8.77%。這種谷子不同品種間甲基化水平和分布位點(diǎn)的差異為從表觀遺傳學(xué)的角度培育新品種提供了初步的理論依據(jù)和參考。

DNA甲基化，谷子，甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性 (MSAP)

DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳學(xué)修飾方式，與許多重要的生物過程相關(guān)，其中包括染色質(zhì)結(jié)構(gòu)維持、基因印記、細(xì)胞分化等[1]。DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶 (DNA methyltransferase)的催化作用下，將S-腺苷甲硫氨酸 (SAM) 上的甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的第5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶 (5-mC)[2]。植物細(xì)胞中，DNA甲基化主要發(fā)生在CG、CHG和CHH位點(diǎn)上 (H指A、C、T三種堿基)，由不同的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶調(diào) 控[3]。DNA甲基化主要分布于著絲粒區(qū)和重復(fù)序列中，其中轉(zhuǎn)座子常常被高度甲基化，使得植物的基因組保持相對(duì)穩(wěn)定[4]。植物的甲基化水平會(huì)因?yàn)槲锓N、器官、生長(zhǎng)時(shí)期不同而不同，并以此來調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育、器官分化甚至影響植物進(jìn)化[1,4-7]。隨著對(duì)DNA甲基化研究的不斷深入，已經(jīng)發(fā)展了很多方法來檢測(cè)DNA甲基化的水平，其中MSAP技術(shù)以其多態(tài)性高、信息量大、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于植物DNA甲基化檢測(cè)[7-10]。

甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性，即MSAP技術(shù) (Methylation sensitive amplified polymorphism) 是由AFLP (Amplified fragment length polymorphism) 技術(shù)發(fā)展而來的[5]。其原理是運(yùn)用限制性內(nèi)切酶Ⅱ和Ⅰ識(shí)別CCGG序列，限制性內(nèi)切酶RⅠ識(shí)別GAATTC序列，將Ⅱ和Ⅰ分別和RⅠ組合對(duì)基因組進(jìn)行酶切，再加上相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶的接頭，根據(jù)接頭序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)CCGG位點(diǎn)甲基化進(jìn)行特異性擴(kuò)增[6-7]。雖然Ⅱ和Ⅰ兩種限制性內(nèi)切酶識(shí)別的位點(diǎn)相同，但兩者對(duì)DNA甲基化敏感程度存在很大的差異，利用其敏感性的不同可以檢測(cè)出總甲基化水平，并區(qū)分DNA的全甲基化和半甲基化等甲基化狀態(tài)。已有眾多研究者采用這一方法取得了一系列的研究成果，王聰聰?shù)壤肕SAP技術(shù)分析不同單株葉籽銀杏DNA 甲基化水平與模式，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)不同單株DNA甲基化水平差異極顯著，正常銀杏DNA甲基化水平低于葉籽銀杏DNA甲基化水平[8]。Zheng等利用MSAP技術(shù)評(píng)估水稻兩個(gè)品種在幼苗期處于正常條件和干旱脅迫下的原代和第6代的DNA甲基化變化，發(fā)現(xiàn)29%干旱誘導(dǎo)的DNA甲基化變異位點(diǎn)在脅迫解除后仍然可以保持，并且在干旱條件下DNA甲基化的變異具有組織特異性，其中分蘗期比抽穗期和孕穗期的甲基化水平顯著下降[9]。李照令等利用MSAP技術(shù)研究不同濃度Cd處理對(duì)擬南芥幼苗基因組DNA甲基化水平的影響，發(fā)現(xiàn)3個(gè)處理組的DNA甲基化水平均高于對(duì)照，并且隨著處理濃度的增加，其甲基化水平隨之降低[10]。

谷子又稱為粟，是起源于我國(guó)的傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)作物之一，一直在北方大面積種植。由于谷子具有抗旱耐瘠、水分利用率高、適應(yīng)性強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)，近年來受到研究人員的重視[11]。谷子的測(cè)序工作在2012年完成，基因組大小約為515 Mb，基因組序列相對(duì)較小，富含重復(fù)序列，并且有一些轉(zhuǎn)錄組測(cè)序也已完成，為功能基因的研究提供了良好條件[12-15]。但在表觀遺傳學(xué)的研究領(lǐng)域，關(guān)于谷子的研究還處于剛剛起步的階段，谷子在正常生長(zhǎng)條件下全基因組甲基化的水平尚未深入研究。因此，本研究以兩個(gè)優(yōu)勢(shì)種——朝谷58號(hào)和豫谷1號(hào)為例，對(duì)谷子基因組DNA胞嘧啶甲基化水平進(jìn)行評(píng)估，以了解谷子在正常生長(zhǎng)條件下全基因組甲基化水平差異和模式特點(diǎn)，以期為進(jìn)一步從表觀遺傳學(xué)的角度培育谷子新品種提供初步的理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

朝谷58號(hào)和豫谷1號(hào)，分別由遼寧省水土保持研究所和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供。其中，豫谷1號(hào)是目前谷子遺傳研究中應(yīng)用最廣泛的品種，也是基因組測(cè)序的品種[15-16]；朝谷58是適應(yīng)遼西干旱半干旱地區(qū)自然條件的優(yōu)秀品種，抗逆性強(qiáng)，且豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，是谷子抗逆性狀基因挖掘的好材料[17]。兩個(gè)品種均播種于滅菌土壤中，并在自然光照條件下生長(zhǎng)，8周后選取葉片完全展開且長(zhǎng)勢(shì)一致的倒三葉、倒四葉葉片進(jìn)行采集，液氮冷凍后在?80 ℃冰箱中保存。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

采用改良的CTAB方法提取谷子葉片的基因組DNA[18]。所用試劑購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2.2 DNA甲基化敏感多態(tài)性分析

分別用RⅠ/Ⅱ、RⅠ/Ⅰ組合對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切，連接接頭 (表1)，實(shí)驗(yàn)所用酶購(gòu)買自NEB公司，所用引物序列由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成 (表2)。每對(duì)引物進(jìn)行5%的聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染后對(duì)清晰可辨、可重復(fù)的帶型進(jìn)行記錄，并對(duì)其位點(diǎn)進(jìn)行MSAP分析。實(shí)驗(yàn)根據(jù)泳道內(nèi)有無(wú)條帶，將清晰可重復(fù)的條帶記為“1”，同一位置沒有條帶記為“0”。統(tǒng)計(jì)每對(duì)引物擴(kuò)增出的總條帶數(shù)和其中的甲基化條帶數(shù)，每個(gè)引物組合做3次重復(fù)。

表1 MSAP接頭

表2 MSAP擴(kuò)增引物

Note:andrepresentRⅠandⅡ/Ⅰ, respectively.

酶切連接體系、預(yù)擴(kuò)、選擴(kuò)體系參照Wang等反應(yīng)體系進(jìn)行[19]。

PCR產(chǎn)物電泳及銀染：PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)5%聚丙烯酰胺凝膠電泳及硝酸銀染色后，統(tǒng)計(jì)凝膠上各種模式的片段[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選和DNA甲基化圖譜構(gòu)建

本研究是通過使用RⅠ和Ⅱ/Ⅰ的引物組合擴(kuò)增PCR片段，從而得到基因組甲基化“CCGG”位點(diǎn)的變異模式，引物組合由10個(gè)RⅠ引物和10個(gè)Ⅱ /Ⅰ引物自由組合而成，共100對(duì)組合。從中篩選出32對(duì)可以擴(kuò)增出條帶分布均勻、帶多清晰的引物組合完成選擇性擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，以朝谷58號(hào)為例，選用的32對(duì)引物組合及其擴(kuò)增條帶的統(tǒng)計(jì)情況見表3。

MSAP中Ⅱ和Ⅰ是兩種同裂酶，它們的酶切位點(diǎn)均為CCGG，但二者對(duì)酶切位點(diǎn)甲基化修飾的敏感性不同，其中Ⅱ可以識(shí)別并切開外側(cè)胞嘧啶半甲基化位點(diǎn)，Ⅰ可以識(shí)別并切開內(nèi)側(cè)胞嘧啶全甲基化位點(diǎn)[20]。因此DNA樣品經(jīng)RⅠ/Ⅱ () 和RⅠ/Ⅰ () 酶切擴(kuò)增后的產(chǎn)物在PAGE膠上會(huì)出現(xiàn)如下3種甲基化類型：Ⅰ型：+和+都有帶，表明CCGG位點(diǎn)未發(fā)生甲基化；Ⅱ型：+有帶，無(wú)帶，表明CCGG位點(diǎn)處于半甲基化狀態(tài)，即DNA甲基化只發(fā)生在一條鏈上，其互補(bǔ)鏈上沒有；Ⅲ型：+無(wú)帶，+有帶，表明CCGG序列中的內(nèi)側(cè)CG位點(diǎn)處于全甲基化狀態(tài)，即DNA甲基化同時(shí)發(fā)生在兩條鏈的內(nèi)側(cè)胞嘧啶上。圖1展示了朝谷58號(hào)和豫谷1號(hào)不同引物的選擇性擴(kuò)增圖譜，表4統(tǒng)計(jì)了朝谷58號(hào)和豫谷1號(hào)的胞嘧啶甲基化水平。

表3 朝谷58號(hào)32對(duì)引物組合及其擴(kuò)增條帶統(tǒng)計(jì)表

Note:andrepresentRⅠandⅡ/Ⅰ,respectively.

圖1 朝谷58號(hào) (A) 和豫谷1號(hào) (B) 不同引物組合選擇性擴(kuò)增圖

2.2 甲基化修飾水平分析

2.2.1 朝谷58號(hào)的甲基化水平

從100對(duì)MSAP 選擴(kuò)引物中，選出32對(duì)適合朝谷58號(hào)的MSAP引物組合，共擴(kuò)增產(chǎn)生1 615條清晰可辨且可重復(fù)的DNA條帶。從表4可以看出，遼寧省優(yōu)勢(shì)品種朝谷58在全基因組水平上CCGG位點(diǎn)胞嘧啶甲基化比例為6.93%，其中內(nèi)側(cè)全甲基化比例為4.27%，單鏈半甲基化比例為2.66%。從結(jié)果看出朝谷58號(hào)在CCGG位點(diǎn)上的胞嘧啶甲基化主要發(fā)生在內(nèi)側(cè)胞嘧啶上。

2.2.2 豫谷1號(hào)的甲基化水平

從100對(duì)MSAP 選擴(kuò)引物中，選出32對(duì)適合于豫谷1號(hào)的MSAP 引物組合，共擴(kuò)增產(chǎn)生1 482條清晰可辨且可重復(fù)的DNA條帶。在全基因組水平上CCGG位點(diǎn)的甲基化比例為8.77%，根據(jù)條帶類型統(tǒng)計(jì)，其中內(nèi)側(cè)胞嘧啶全甲基化比例為6.41%，半甲基化比例為2.36%，豫谷1號(hào)在CCGG位點(diǎn)上的胞嘧啶甲基化也主要發(fā)生在內(nèi)側(cè)胞嘧啶上。

2.2.3 朝谷58號(hào)與豫谷1號(hào)全基因組甲基化水平的比較分析

在計(jì)算全基因組CCGG位點(diǎn)上的胞嘧啶甲基化水平后 (表4)，發(fā)現(xiàn)朝谷58號(hào)的甲基化水平低于豫谷1號(hào)，這種甲基化水平的差異是由于兩個(gè)品種胞嘧啶內(nèi)側(cè)全甲基化位點(diǎn)差異造成的。同時(shí)，兩個(gè)品種的胞嘧啶內(nèi)側(cè)全甲基化水平均高于單鏈半甲基化水平，說明在谷子基因組中這種對(duì)稱性的胞嘧啶內(nèi)側(cè)全甲基化位點(diǎn)是甲基化修飾的主要形式。此外，單鏈胞嘧啶半甲基化水平在兩個(gè)品種中沒有明顯差異。儀治本等[21]在運(yùn)用MSAP技術(shù)研究玉米雜交種及其親本基因組DNA胞嘧啶甲基化水平中，其選用的第一組親本Mo 17與Suwan 5的全甲基化水平分別為17.1%和24.4%，第二組親本Suwan 1與太3221的全甲基化水平分別為24.6%和21.6%，與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果相同，說明同種作物的不同品種之間的全甲基化水平也不同。

表4 朝谷58號(hào)和豫谷1號(hào)的胞嘧啶甲基化水平

Note: total methylated rate (%) = [(Ⅱ+Ⅲ)/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ)]×100; fully methylated ratio(%) = [(Ⅲ)/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ)]×100; hemi methylated ratio(%) = [(Ⅱ)/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ)]×100; non methylated ratio(%) = [(Ⅰ)/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ)]×100.

3 討論

DNA甲基化在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要意義，甲基化的變化會(huì)影響農(nóng)作物的表型、花期和產(chǎn)量[22-23]。另外，Zhong等研究表明在番茄果實(shí)成熟過程中DNA甲基化的變化發(fā)揮重要作用[24]。本研究通過100對(duì)引物組合篩選獲得32對(duì)有效的引物組合，檢測(cè)兩個(gè)谷子品種在CCGG位點(diǎn)DNA甲基化水平。朝谷58號(hào)和豫谷1號(hào)分別檢測(cè)到1 615條和1 482條條帶，但由于MSAP技術(shù)使用的限制性內(nèi)切酶只能識(shí)別和切割CCGG序列，對(duì)其他位點(diǎn)的甲基化不能檢測(cè)，其檢測(cè)位點(diǎn)具有局限性，所以對(duì)于基因組中實(shí)際甲基化水平評(píng)估偏低[20]，即實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到朝谷58號(hào)和豫谷1號(hào)全基因組CCGG序列胞嘧啶甲基化所占的比例為6.93%和8.77%，要低于谷子兩個(gè)品種各自的甲基化水平。Xiong等在研究水稻雜交種及其親本的甲基化模式中發(fā)現(xiàn)，其中親本Zhenshan 97和Minghui 63的胞嘧啶甲基化水平基本相同為16.3%，而雜交后代的Shanyou 63的胞嘧啶甲基化水平低于兩種親本，說明其雜交后代和親本之間的甲基化水平也會(huì)存在差異[25]。谷子不同品種間的甲基化差異可能是其表型和性狀差異原因，這種差異可以為培育新型的谷子品種提供表觀遺傳學(xué)方向的思路。

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Analysis of genomic DNA methylation level in foxtail millet by Methylation Sensitive Amplified Polymorphism

Yuxin Zhang1*, Yanan Ruan1*, Chen Zhao1, Minmin Xue1, Bo Li1, Jingjing Wang1, Yang Liu1, Kaixi Wang2, and Hongyan Wang1

1 Laboratory of Plant Epigenetics and Evolution, School of Life Sciences, Liaoning University, Shenyang 110036, Liaoning, China 2 Liaoning Institute of Soil and Water Conservation, Chaoyang 122000, Liaoning, China

DNA methylation is an important type of epigenetic modification in eukaryotes. In order to research genome-wide methylation levels and patterns in foxtail millet (), the Methylation Sensitive Amplified Polymorphism (MSAP) analysis (employing double digestion withR I andIII) was established and applied in two foxtail millet cultivars (Chaogu 58 and Yugu 1). The results showed that 32 pairs of MSAP primers were selected from 100 MSAP primers, and 1 615 and 1 482 clearly distinguishable and reproducible bands were amplified from Chaogu 58 and Yugu 1 respectively, including 3 types of methylation patterns. Cytosine methylation levels of CCGG context in Chaogu 58 and Yugu 1 were characterized as 6.93% and 8.77% respectively. Such different genomic DNA methylation levels between two foxtail millet varieties may provide a preliminary reference for the cultivation of this crop from a novel epigenetic viewpoint.

DNA methylation, foxtail millet (), methylation-sensitive amplification polymorphism (MSAP)

May 25, 2018;

August 13, 2018

National Natural Science Foundation of China (No. 31100172), Program for Liaoning Excellent Talents in University (No. LJQ2013003), Guidance Program of Natural Science Fundation, Department of Science and Technology, Liaoning Province (No. 20180550686), and Project in Shenyang Science and Technology Bureau (No. F16-205-1-49).

Hongyan Wang. Tel: +86-24-62202232; E-mail: hongyan2003@126.com

10.13345/j.cjb.180220

*These authors contributed equally to this work.

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 31100172)，遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計(jì)劃 (No. LJQ2013003)，遼寧省科技廳自然基金指導(dǎo)計(jì)劃 (No. 20180550686)，沈陽(yáng)市科技局項(xiàng)目 (No. F16-205-1-49) 資助。

(本文責(zé)編 郝麗芳)