王霞，劉錄祥，喬利仙，隋炯明，姜德鋒，李冠，趙琳姝，王晶珊

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快中子輻照結(jié)合組織培養(yǎng)培育花生新品種宇花7號(hào)

王霞1，劉錄祥2，喬利仙3，隋炯明3，姜德鋒3，李冠3，趙琳姝2，王晶珊3

1 青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266109 2 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物科學(xué)研究所 國(guó)家農(nóng)作物基因資源與基因改良重大科學(xué)工程 國(guó)家農(nóng)作物航天誘變技術(shù)改良中心，北京 100081 3 青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院 山東省旱作農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109

王霞, 劉錄祥, 喬利仙, 等. 快中子輻照結(jié)合組織培養(yǎng)培育花生新品種宇花7號(hào).生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(2): 270–280.Wang X, Liu LX, Qiao LX, et al. Breeding peanut variety Yuhua 7 by fast neutron irradiation and tissue culture. Chin J Biotech, 2019, 35(2): 270–280.

為開(kāi)拓新的花生育種方法，對(duì)輻照誘變結(jié)合組織培養(yǎng)創(chuàng)造花生新種質(zhì)、培育新品種進(jìn)行了研究。以我國(guó)北方地區(qū)主栽花生品種魯花11號(hào)成熟種子為試材，經(jīng)快中子輻照處理后取種子胚小葉進(jìn)行組織培養(yǎng)，通過(guò)胚胎發(fā)生途徑獲得再生苗。再生苗經(jīng)嫁接馴化后移栽田間，83個(gè)單株獲得種子。后代按系譜法進(jìn)行選育，從83個(gè)再生植株后代中獲得了107份突變體，分別在主莖高、分枝數(shù)、莢果形狀和大小、種皮顏色、內(nèi)種皮顏色、含油率、蛋白含量等性狀上發(fā)生了明顯變異。從突變體后代中選育出了低油早熟耐澇大花生新品種宇花7號(hào)，其產(chǎn)量比親本魯花11號(hào)增產(chǎn)14%以上；其含油率 (47.0%) 比魯花11號(hào)低5.1個(gè)百分點(diǎn)。宇花7號(hào)2016年參加遼寧省新品種登記試驗(yàn)，比對(duì)照品種白沙1017平均增產(chǎn)13.8%。2018年通過(guò)了國(guó)家非主要農(nóng)作物品種登記，登記號(hào)為“GPD花生 (2018) 370105”。研究結(jié)果說(shuō)明，輻照結(jié)合組織培養(yǎng)是創(chuàng)造花生新種質(zhì)、培育新品種的有效方法。

花生品種，輻照誘變，離體培養(yǎng)，低油，早熟

花生是重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物之一[1-3]，除榨油外也廣泛用于食品加工或作為堅(jiān)果直接食用[4]?；ㄉ讶薁I(yíng)養(yǎng)豐富，有補(bǔ)脾潤(rùn)肺、補(bǔ)中益氣、開(kāi)胃醒脾的功效，又有強(qiáng)身健腦、駐顏延年之用，故又稱“長(zhǎng)生果”[5]。花生富含蛋白質(zhì)，必需氨基酸營(yíng)養(yǎng)全面，尤其是各類主食中所缺乏的賴氨酸含量較高，對(duì)人類膳食營(yíng)養(yǎng)具有重要的意義[6-7]。然而，隨著人們生活水平的提高和保健意識(shí)增強(qiáng)，營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩問(wèn)題深受關(guān)注。研究表明膳食脂肪的過(guò)量攝入會(huì)嚴(yán)重影響人類的健康[8-10]，低脂飲食是影響健康最主要的保護(hù)因素之一[11]。而一般花生品種含油率較高，目前花生育種者們提出優(yōu)質(zhì)專用作為花生品種選育目標(biāo)之一[12]。但花生遺傳基礎(chǔ)狹窄、多樣性差，通過(guò)雜交育種的手段選育出有突破性的花生新品種越來(lái)越困難[13-14]。誘變技術(shù)的應(yīng)用是創(chuàng)造種質(zhì)資源、加速品種改良進(jìn)程的重要手段之一[15-18]。與常規(guī)誘變育種相比，利用誘變結(jié)合組織培養(yǎng)進(jìn)行育種，能夠提高變異頻率，增加選擇幾率[19-21]。并且在植物組織培養(yǎng)中，通過(guò)體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑再生植株，通常被認(rèn)為是單細(xì)胞起源的，而突變也是一種單細(xì)胞事件，能夠克服突變體嵌合現(xiàn)象[22-23]。研究者們已在不同植物上開(kāi)展了離體誘變研究[24-27]，并利用突變體育成了新品種[28]。近年來(lái)研究者們開(kāi)展了花生離體誘變研究，Venkatachalam等利用離體誘變和定向篩選獲得了對(duì)黑斑病抗性明顯提高的植株[29]，Muthusamy等在花生離體誘變中獲得了葉片形狀變化及單株結(jié)果數(shù)和莢果重提高的突變體[19]。本課題組利用平陽(yáng)霉素作為誘變劑進(jìn)行離體誘變，分別獲得了耐鹽性和抗旱性明顯提高的花生突變體[20,30]，并從中育成了花生新品種[14]。

本研究利用快中子作為輻照源，對(duì)輻照處理后的花生種子胚小葉進(jìn)行組織培養(yǎng)，對(duì)再生植株后代農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀進(jìn)行測(cè)定分析，并培育出低油早熟耐澇大花生新品種宇花7號(hào)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料為花生品種魯花11號(hào)的成熟飽滿干種子，由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院保存。

1.2 方法

1.2.1 輻照處理及離體培養(yǎng)

選用魯花11號(hào)成熟飽滿的干種子在中國(guó)原子能科學(xué)研究院進(jìn)行快中子輻照處理，輻照能量為14 MeV，輻照劑量分別設(shè)置為0、9.7、14.0、18.0 Gy。

取每個(gè)輻照劑量照射后的種子8粒，去除子葉，取種胚進(jìn)行表面消毒。先用70%的酒精浸泡20 s，再用0.1%升汞浸泡10 min，最后用滅菌水漂洗3遍后，置于無(wú)菌水中浸泡10 h。將種胚置于培養(yǎng)皿中剝離胚小葉，隨即接種到體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MSB5(MS無(wú)機(jī)鹽+B5有機(jī)成分) 培養(yǎng)基，添加10 mg/L 2,4-D、3%蔗糖、0.8%瓊脂，pH值調(diào)至5.8。培養(yǎng)4周后，將外植體轉(zhuǎn)移到添加4 mg/L BAP、3%蔗糖、0.8%瓊脂的MSB5培養(yǎng)基 (pH值調(diào)至5.8) 上，誘導(dǎo)體細(xì)胞胚萌發(fā)成苗。每4周繼代培養(yǎng)1次，直到小苗長(zhǎng)到1.5 cm左右。培養(yǎng)條件均為 (25±1) ℃、13 h/d光照、光照強(qiáng)度3 000 lx。

1.2.2 再生苗的嫁接、移栽及其后代的選育

以體細(xì)胞胚萌發(fā)長(zhǎng)成的小苗 (1.5 cm以上) 作為接穗，無(wú)菌萌發(fā)的苗齡10–12 d的花生苗作為砧木，在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行無(wú)菌嫁接。嫁接苗在培養(yǎng)瓶中閉瓶培養(yǎng)2–3 d，促進(jìn)嫁接口愈合。打開(kāi)瓶口煉苗1–2 d后，將嫁接苗移栽于育苗基質(zhì)中，在馴化室內(nèi)培養(yǎng)3 周。之后移栽到青島農(nóng)業(yè)大學(xué)萊陽(yáng)試驗(yàn)基地。移栽初期2 周內(nèi)中午9點(diǎn)至下午4點(diǎn)加蓋遮蔭網(wǎng)，之后按田間種植方式管理。成熟后按單株收獲莢果。

選育方法采用系譜法，M2–M5代按株行種植，起壟單粒播種，每壟播種2 行，株距20 cm，以誘變親本魯花11號(hào)作為對(duì)照，選擇變異單株，其中優(yōu)良單株作為育種材料。優(yōu)良單株的選擇，是在出苗期和開(kāi)花期掛牌標(biāo)記出苗早、苗壯和開(kāi)花早、花期集中的單株，收獲期結(jié)合掛牌標(biāo)記，選擇產(chǎn)量高、結(jié)果整齊集中的單株作為育種選擇材料，并結(jié)合海南加代加快育種進(jìn)程；其他明顯變異的單株作為突變材料自交純合。

M5代從單株結(jié)果多、莢果整齊、抗逆性強(qiáng)、遺傳基本穩(wěn)定的株行中選擇優(yōu)良單株混收形成株系。2012年將選擇的優(yōu)良株系進(jìn)行產(chǎn)量鑒定試驗(yàn)，入選株系于2013至2014年進(jìn)行產(chǎn)量品比試驗(yàn)，試驗(yàn)分別在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)萊陽(yáng)實(shí)驗(yàn)基地和山東省招遠(yuǎn)市畢郭鎮(zhèn)進(jìn)行。起壟雙粒播種，每壟播種2行，每個(gè)小區(qū)面積為12.78 m2，重復(fù)3次，以親本魯花11號(hào)作為對(duì)照。按常規(guī)進(jìn)行田間管理，收獲曬干后進(jìn)行室內(nèi)考種，并稱重各小區(qū)莢果產(chǎn)量。

1.2.3 遼寧省非主要農(nóng)作物品種登記試驗(yàn)

選擇優(yōu)良品系于2016年參加遼寧省非主要農(nóng)作物品種登記試驗(yàn)，起壟雙粒播種，每壟播種2行，每個(gè)小區(qū)面積13.34 m2，重復(fù)3次，全省不同地域共設(shè)6個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)。

1.2.4 籽仁含油率和蛋白含量測(cè)定

采用德國(guó)BRUKER公司生產(chǎn)的型號(hào)為MATRIX-1近紅外光譜儀，測(cè)定分析籽仁含油率和蛋白含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 輻照處理的胚小葉離體培養(yǎng)及植株再生

經(jīng)輻照處理后的種子胚小葉外植體在添加10 mg/L 2,4-D的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)1周后，觀察到胚小葉展開(kāi)，并由原來(lái)的白色逐漸變?yōu)闇\綠色，之后部分外植體形成體細(xì)胞胚，而另外部分外植體形成了愈傷組織。培養(yǎng)4周后統(tǒng)計(jì)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率見(jiàn)圖1，隨輻照劑量的增加體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)率呈下降趨勢(shì)，未輻照的對(duì)照體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率為92.1%；輻照劑量為9.7 Gy時(shí)，體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率為65.7%；輻照劑量增加到14.0 Gy時(shí)，體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率降低到34.9%；當(dāng)輻照劑量增加到18.0 Gy時(shí)，體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率僅為25.1%。之后將形成體細(xì)胞胚的外植體轉(zhuǎn)移到添加4 mg/L BAP的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，體細(xì)胞胚萌發(fā)并長(zhǎng)成小苗。當(dāng)小苗長(zhǎng)到1.5 cm以上后，以再生苗作為接穗、無(wú)菌萌發(fā)的花生種子實(shí)生苗作為砧木進(jìn)行嫁接，嫁接苗經(jīng)馴化后移栽于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)萊陽(yáng)試驗(yàn)基地，最終83株嫁接的再生苗收獲了正常成熟的種子。

2.2 再生植株后代分離及選育過(guò)程

收獲的83個(gè)單株種子次年種成株行 (M2代)，以誘變親本魯花11號(hào)作為對(duì)照。生育期及收獲期觀察發(fā)現(xiàn)，9.7、14、19.8 Gy輻照組分別有9個(gè)、7個(gè)、8個(gè)M2代株行單株之間發(fā)生明顯分離，與親本相比表現(xiàn)出明顯的變異。收獲期選擇變異單株，M3代和M4代繼續(xù)按株行單粒播種，觀察發(fā)現(xiàn)，同一株行單株間仍有分離，直到M5代觀察已基本穩(wěn)定。

圖1 不同快中子輻照劑量對(duì)花生品種魯花11號(hào)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率的影響

分別將M5代同一株行的單株混收，作為突變材料或育種材料，共獲得107份突變體。其中9.7 Gy輻照組32份，14 Gy輻照組35份，18 Gy輻照組40份。這些突變材料在主莖高、分枝數(shù)、莢果大小、果形、種皮顏色、內(nèi)種皮顏色等方面與誘變親本不同，表現(xiàn)出明顯的變異。主莖高變異幅度較大，最高達(dá)162 cm (圖2A)，最矮僅為35 cm (圖2B)，而親本魯花11號(hào)主莖高為46.6 cm (圖2D)。突變體的分枝數(shù)也有變異，總分枝數(shù)最多28條 (圖2C)，而魯花11號(hào)總分枝數(shù)為10條 (圖2D)。

圖2 突變體植株變異

突變體莢果和籽仁大小的變異幅度較大，統(tǒng)計(jì)百果重和百仁重變異分布范圍 (圖3和圖4)。由圖3和圖4可以看出，百果重主要分布在200–300 g，百仁重主要分布在70–110 g，但有極大果和極小果變異，百果重最大為330.1 g，最小僅為176.6 g。百仁重最大為122.2 g，最小僅為66.2 g。而誘變親本魯花11號(hào)百果重為235.2 g，百仁重為89.1 g。

魯花11號(hào)莢果普通形，種皮顏色粉紅色，內(nèi)種皮白色，而突變體莢果形狀有不規(guī)則形 (圖5A)、蜂腰形 (圖5B) 等突變，種皮顏色有紫色突變，內(nèi)種皮顏色有桔黃色突變。

圖3 快中子輻照魯花11號(hào)突變體百果重變異分布

圖4 快中子輻照魯花11號(hào)突變體百仁重變異分布

圖5 突變體莢果形狀變異

采用近紅外測(cè)定籽仁成分，4份突變體蛋白含量超過(guò)30%，6份突變體含油率超過(guò)55%，分別達(dá)到高蛋白和高油標(biāo)準(zhǔn)，另有5份突變體含油率較低，在48%以下。而親本魯花11號(hào)含油率為52.1%，蛋白含量為27.2%。以上這些突變體可為育種、遺傳研究、基因挖掘等提供寶貴的材料。

選擇優(yōu)良株系作為育種候選材料，在M3代和M4代選擇的基礎(chǔ)上，M5代有8個(gè)株行結(jié)果較多、莢果整齊、抗病性較強(qiáng)。將這8個(gè)株行分別選擇最優(yōu)良單株混收莢果，海南繁種形成株系。2012年在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)萊陽(yáng)實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行產(chǎn)量鑒定試驗(yàn)，以親本魯花11號(hào)作為對(duì)照。收獲后稱重莢果產(chǎn)量，結(jié)果表明，9.7 Gy-1-4-7-3、9.7 Gy-3-2-4-6和14 Gy-4-2-2-3等3個(gè)株系莢果產(chǎn)量比魯花11號(hào)增產(chǎn)10%以上，將這3個(gè)株系升級(jí)為品系。

2.3 高產(chǎn)品系產(chǎn)量品比試驗(yàn)結(jié)果及性狀分析

2013–2014年分別在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)萊陽(yáng)實(shí)驗(yàn)基地和山東省招遠(yuǎn)市畢郭鎮(zhèn)進(jìn)行產(chǎn)量品比試驗(yàn)，并測(cè)定農(nóng)藝性狀，以親本魯花11號(hào)作為對(duì)照。農(nóng)藝性狀測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。親本魯花11號(hào)生育期為133 d，品系9.7 Gy-3-2-4-6與親本相同，14 Gy-4-2-2-3生育期稍長(zhǎng)，為135 d，而9.7 Gy-1-4-7-3生育期僅為120 d，比魯花11號(hào)早熟13 d。3個(gè)品系的主莖高、側(cè)枝長(zhǎng)、總分枝數(shù)、有效分枝數(shù)與魯花11號(hào)無(wú)明顯差異。但9.7 Gy-3-2-4-6和14 Gy-4-2-2-3的莢果較大，百果重分別為275.3 g和275.5 g，百仁重分別為104.7 g和117.0 g。而魯花11號(hào)百果重為235.2 g，百仁重為89.1 g。9.7 Gy-1-4-7-3百果重和百仁重略低于親本魯花11號(hào)，分別為231.3 g和88.2 g。14 Gy-4-2-2-3出米率最高 (75.4%)，9.7 Gy-3-2-4-6出米率最低(71.0%)，9.7 Gy-1-4-7-3出米率為72.6%，略低于魯花11號(hào)(73.1%)。9.7 Gy-1-4-7-3含油率最低，僅為47.0%，比魯花11號(hào) (52.1%) 降低了5.1個(gè)百分點(diǎn)，其他2個(gè)品系含油率與魯花11號(hào)無(wú)明顯差異。9.7 Gy-3-2-4-6蛋白含量較低 (25.9%)，其他2個(gè)品系蛋白含量與魯花11號(hào) (27.6%) 無(wú)明顯差異。2013年于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)萊陽(yáng)試驗(yàn)基地進(jìn)行產(chǎn)量品比試驗(yàn)，2013年萊陽(yáng)市雨水較多，尤其花生生育中后期降水較多，影響花生生長(zhǎng)和產(chǎn)量。觀察發(fā)現(xiàn)品系9.7 Gy-3-2-4-6、14 Gy-4-2-2-3及親本魯花11號(hào)均倒伏嚴(yán)重，并且有爛果，而9.7 Gy-1-4-7-3株型直立未觀察到倒伏發(fā)生，也未觀察到爛果，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐澇性和抗倒伏性 (表1)。成熟收獲曬干后，稱重各小區(qū)莢果產(chǎn)量，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可以看出，品系9.7 Gy-1-4-7-3莢果產(chǎn)量最高，平均每公頃莢果產(chǎn)量7 328 kg，比對(duì)照魯花11號(hào)增產(chǎn)23.99%，差異達(dá)到顯著水平。其他2個(gè)品系9.7 Gy-3-2-4-6和14 Gy-4-2-2-3平均莢果產(chǎn)量分別為每公頃6 507 kg和6 522 kg，分別比魯花11號(hào)增產(chǎn)10.10%和10.36%，但差異均未達(dá)到顯著水平。

表1 魯花11號(hào)和3個(gè)高產(chǎn)品系的性狀比較

表2 輻照再生植株后代品系產(chǎn)量品比結(jié)果 (2013年于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)萊陽(yáng)實(shí)驗(yàn)基地)

* Stand for significant difference at<0.05.

2014年繼續(xù)進(jìn)行產(chǎn)量品比試驗(yàn)，試驗(yàn)地點(diǎn)分別在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)萊陽(yáng)實(shí)驗(yàn)基地和招遠(yuǎn)市畢郭鎮(zhèn)進(jìn)行。青島農(nóng)業(yè)大學(xué)萊陽(yáng)實(shí)驗(yàn)基地試驗(yàn)結(jié)果列于表3，3個(gè)品系9.7 Gy-1-4-7-3、9.7 Gy-3-2-4-6和14 Gy-4-2-2-3平均莢果產(chǎn)量分別為每公頃6 821 kg、6 701 kg和6 791 kg，均顯著高于親本魯花11號(hào) (5 940 kg/hm2)，分別增產(chǎn)14.83%、12.81%和14.32%。

將2014年招遠(yuǎn)市畢郭鎮(zhèn)試驗(yàn)結(jié)果列于表4，品系9.7 Gy-1-4-7-3和14 Gy-4-2-2-3平均莢果產(chǎn)量分別為每公頃7 075 kg和7 089 kg，比魯花11號(hào)分別增產(chǎn)15.06%和15.29%，達(dá)到顯著水平。9.7 Gy-3-2-4-6莢果產(chǎn)量為每公頃6 806 kg，比魯花11號(hào)增產(chǎn)10.68%，但未達(dá)到顯著水平。

2.4 宇花7號(hào)區(qū)域試驗(yàn)結(jié)果和品種特性

根據(jù)2013年和2014年兩年3個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)試驗(yàn)結(jié)果，品系9.7 Gy-1-4-7-3產(chǎn)量均顯著高于親本魯花11號(hào)。2016年9.7 Gy-1-4-7-3參加遼寧省非主要農(nóng)作物品種登記試驗(yàn)，在全省不同地域6個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)平均莢果產(chǎn)量比對(duì)照白沙1017增產(chǎn)13.8%，命名為宇花7號(hào)。2017年申請(qǐng)國(guó)家非主要農(nóng)作物品種登記，并獲批登記，登記號(hào)為“GPD花生 (2018) 370105”。

宇花7號(hào)為低油早熟大花生品種，全生育期120 d，比親本魯花11號(hào)生育期縮短13 d。株型直立、疏枝，與親本魯花11號(hào)相似 (圖6)。但宇花7號(hào)莖枝韌性好 (圖6B)，抗倒伏性和耐澇性較強(qiáng)，葉斑病抗性和耐旱性中等。而魯花11號(hào)耐澇性較差，抗旱性較較強(qiáng)。宇花7號(hào)莢果普通形，籽仁橢圓形，種皮淺粉紅色，比魯花11號(hào)顏色稍淺 (圖7)。內(nèi)種皮桔黃色 (圖7B)，而魯花11號(hào)內(nèi)種皮為白色 (圖7A)。宇花7號(hào)百果重231.3 g，百仁重88.2 g，出米率72.6%，蛋白含量27.8%，含油率47.0%，比魯花11號(hào)含油率降低5.1個(gè)百分點(diǎn) (表1)。

表3 再生植株后代品系產(chǎn)量品比結(jié)果 (2014年于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)萊陽(yáng)實(shí)驗(yàn)基地)

* Stand for significant difference at<0.05.

表4 再生植株后代品系產(chǎn)量品比結(jié)果 (2014年于山東省招遠(yuǎn)市畢郭鎮(zhèn)試驗(yàn)田)

* Stand for significant difference at<0.05.

圖6 宇花7號(hào)(B) 與親本魯花11號(hào)(A)植株

圖7 宇花7號(hào)與親本魯花11號(hào)莢果、籽仁及內(nèi)種皮顏色

3 討論

輻照與植物組織培養(yǎng)相結(jié)合的誘變方法有助于得到豐富的變異體，增加選擇幾率，誘變材料不受季節(jié)限制，并且通過(guò)體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑再生植株，能克服突變體的嵌合現(xiàn)象[23]。快中子輻照是一種線性傳能密度和相對(duì)生物學(xué)效應(yīng)均較高的電離輻射，并能引起較高密度的次級(jí)電離，引起植物細(xì)胞的基因突變，且這種突變可穩(wěn)定遺傳，是一種有效的物理誘變因素[31]。本研究選用快中子為輻照源，以魯花11號(hào)干種子為試材，經(jīng)輻照處理后取種子胚小葉進(jìn)行離體培養(yǎng)，誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生。體胚萌發(fā)再生的植株，經(jīng)嫁接移栽田間后，83個(gè)單株獲得了種子，其中24個(gè)單株的M2代發(fā)生變異和分離，從這些變異植株后代中共獲得了各種各樣的突變體107份。突變體主莖高變異幅度(35–162) cm，百果重變異幅度為(176.6–330.1) g，百仁重變異幅度為(66.2–122.2) g，籽仁含油率變異幅度為46.62%–56.02%。其中6份突變體含油率超過(guò)55%，4份突變體蛋白含量超過(guò)30%，分別達(dá)到高油和高蛋白標(biāo)準(zhǔn)，另有5份突變體含油率較低，在48%以下。本研究結(jié)果表明快中子輻照與組織培養(yǎng)相結(jié)合是花生育種的一條有效途徑。

目前肥胖、營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩等問(wèn)題備受關(guān)注，低脂飲食深受歡迎。花生營(yíng)養(yǎng)豐富，但花生含油率較高，作為加工或直接食用品種，降低含油率是提高花生品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。一般花生品種的含油率在50%–52%[32]，本研究培育的花生品種宇花7號(hào)含油率為47.0%，比誘變親本魯花11號(hào)低5.1個(gè)百分點(diǎn)。宇花7號(hào)用于食品加工或作為堅(jiān)果直接食用將提高產(chǎn)品質(zhì)量，減少油脂的攝取。

我國(guó)南方花生生育中后期降水較多，為避開(kāi)汛期往往選用早熟的小?；ㄉ贩N，并且需耐澇性強(qiáng)。而一般大?；ㄉ漠a(chǎn)量高于小?；ㄉ?。本研究培育的宇花7號(hào)花生品種，生育期比魯花11號(hào)縮短13 d，為早熟大粒耐澇花生品種，2016年參加遼寧省區(qū)域試驗(yàn)，平均比對(duì)照魯花8號(hào)增產(chǎn)13.8%。2013年在山東省萊陽(yáng)市降水較多出現(xiàn)澇情的狀況下，宇花7號(hào)表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐澇性、抗倒伏性和高產(chǎn)性，莢果產(chǎn)量比親本魯花11號(hào)增產(chǎn)達(dá)23.99%。2017年花生生育中后期山東膠東半島降水多，青島農(nóng)業(yè)大學(xué)萊陽(yáng)實(shí)驗(yàn)基地2次被水淹，水深達(dá)50 cm以上，播種于基地的大部分花生材料爛果嚴(yán)重，而宇花7號(hào)爛果極少，比魯花11號(hào)增產(chǎn)35%以上，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐澇性。由于宇花7號(hào)早熟耐澇，適合在安徽省、江蘇省、河南省及山東省的魯西南地區(qū)夏直播或在遼寧省種植。

4 結(jié)論

本研究利用魯花11號(hào)干種子作為輻照誘變材料進(jìn)行快中子輻照后，取胚小葉進(jìn)行培養(yǎng)，從再生植株后代中獲得了各種各樣的突變材料107份，并直接育成了低油早熟耐澇花生品種宇花1號(hào)。宇花1號(hào)比親本魯花11號(hào)增產(chǎn)14%以上，比安徽省區(qū)試對(duì)照品種魯花8號(hào)增產(chǎn)13.08%。文中通過(guò)對(duì)輻照誘變結(jié)合組織培養(yǎng)進(jìn)行研究，開(kāi)拓了一條花生種質(zhì)創(chuàng)新和新品種培育的新途徑。

[1] Abuagela MO, Iqdiam BM, Baker IV GL, et al. Temperature-controlled pulsed light treatment: impact on aflatoxin level and quality parameters of peanut oil. Food Biopr Technol, 2018, 11(7): 1350–1358.

[2] Yin DM, Wang Y, Zhang XG, et al. Development of chloroplast genome resources for peanut (L.) and other species of Arachis. Sci Rep, 2017, 7(1): 11649.

[3] He LQ, Tang RH, Jiang J, et al. Rapid gene expression change in a novel synthesized allopolyploid population of cultivated×cross bycDNA-SCoT and HFO-TAG technique. J Integr Agric, 2017, 16(5): 1093–1102.

[4] Fu C, Zhang XJ, Yue FL, et al. Nutrition and quality analysis of special new peanut varieties. J China Agric Univ, 2017, 22(5): 32–38 (in Chinese). 付春, 張小軍, 岳福良, 等. 特色花生新品系營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)解析. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 22(5): 32–38.

[5] Lü JZ, Liang H, Zhang ZM, et al. Nutritional ingredients and health value of peanut seed. Food Nutri China, 2009, (2): 50–52 (in Chinese).呂巨智, 梁和, 張智猛, 等. 花生仁的營(yíng)養(yǎng)成分及保健價(jià)值. 中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng), 2009, (2): 50–52.

[6] Zhao GX, Chen X, Liu HF, et al. Advance in study on functional components and nutritive value in peanut and their development utilization. Anhui Agric Sci Bull, 2011, 17(12): 39–42 (in Chinese). 趙貴興, 陳霞, 劉昊飛, 等. 花生的功能成分、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及其開(kāi)發(fā)利用研究. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào), 2011, 17(12): 39–42.

[7] Yang QL, Zhang CS, Cao YL, et al. The correlation and path analysis between protein content and amino acids composition in peanut seed. Acta Agric Boreali-Sin, 2009, 24(S1): 72–74 (in Chinese). 楊慶利, 張初署, 曹玉良, 等. 花生種子蛋白質(zhì)含量與氨基酸組分相關(guān)和通徑分析. 華北農(nóng)學(xué)報(bào), 2009, 24(S1): 72–74.

[8] Guenther PM, Reedy J, Krebs-Smith SM, et al. Evaluation of the healthy eating index-2005. J Am Diet Assoc, 2008, 108 (11): 1896–1901.

[9] Shatenstein B, Nadon S, Godin C, et al. Diet quality of Montreal-area adults needs improvement: estimates from a self-administered food frequency questionnaire furnishing a dietary indicator score. J Am Diet Assoc, 2005, 105(8): 1251–1260.

[10] Woodruff SJ, Hanning RM. Development and implications of a revised Canadian Healthy Eating Index (HEJC-2009). Public Health Nutr, 2010, 13(6): 820–825.

[11] Guenther PM, Casavale KO, Reedy J, et al. Update of the healthy eating index: HEI-2010. J Acad Nutr Diet, 2013, 113(4): 569–580.

[12] Yu SL. Genetics and breeding of peanuts in China. Shanghai: Shanghai Science and Technology Press, 2011 (in Chinese).禹山林. 中國(guó)花生遺傳育種學(xué). 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 2011.

[13] Qiao LX, Sui JM, Zhao LL, et al. Agronomic traits of M2generation bymutagenesis with pingyangmycin in peanut. J Nucl Agric Sci, 2014, 28(6): 955–960 (in Chinese). 喬利仙, 隋炯明, 趙麗蘭, 等. 平陽(yáng)霉素離體誘變花生M2農(nóng)藝性狀分析. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2014, 28(6): 955–960.

[14] Li G, Wang X, Yin XB, et al. Breeding of peanut variety Yuhua 4 bymutagenesis. Chin J Biotech, 2017, 33(5): 766–774 (in Chinese). 李冠, 王霞, 尹秀波, 等. 利用離體誘變培育花生新品種宇花4號(hào). 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(5): 766–774.

[15] Wu LR, Li ZC, Qiu QS, et al. Application of mutation techniques in peanut breeding in China. J Nucl Agric Sci, 2002, 16(5): 334–336 (in Chinese). 吳蘭榮, 李正超, 邱慶樹(shù), 等. 我國(guó)花生誘變育種技術(shù)應(yīng)用研究概況. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2002, 16(5): 334–336.

[16] Wang JS, Qiao LX, Zhao LS, et al. Performance of peanut mutants and their offspring generated from mixed high-energy particle field radiation and tissue culture. Genet Mol Res, 2015, 14(3): 10837–10848.

[17] Zhao LS, Liu LX. Research progresses in irradiation-induced mutation breeding in crop. Acta Laser Biol Sin, 2017, 26(6): 481–489 (in Chinese). 趙林姝, 劉錄祥. 農(nóng)作物輻射誘變育種研究進(jìn)展. 激光生物學(xué)報(bào), 2017, 26(6): 481–489.

[18] Yu M, Zhou QF. Research advances on induced mutation breeding techniques of wheat. Biotechnol Bull, 2017, 33(3): 45–51 (in Chinese). 于沐, 周秋峰. 小麥誘發(fā)突變技術(shù)育種研究進(jìn)展. 生物技術(shù)通報(bào), 2017, 33(3): 45–51.

[19] Muthusamy A, Vasanth K, Sivasankari D, et al. Effects of mutagens on somatic embryogenesis and plant regeneration in groundnut. Biol Plant, 2007, 51(3): 430–435.

[20] Sui JM, Wang Y, Wang P, et al. Generation of peanut drought tolerant plants by pingyangmycin-mediatedmutagenesis and hydroxyproline-resistance screening. PLoS ONE, 2015, 10(3): e0119240.

[21] Wang JS, Zhao MX, Qiao LX, et al. Effects of fast neutron irradiation on plant regeneration in embryonic leaflet culture of peanut (L.). Chin J Oil Crop Sci, 2013, 35(2): 148–152 (in Chinese). 王晶珊, 趙明霞, 喬利仙, 等. 快中子輻照對(duì)花生種子胚小葉植株再生的影響. 中國(guó)油料作物學(xué)報(bào), 2013, 35(2): 148–152.

[22] Yu XL, Liu LX, Qiao LX, et al. Effects of mixed high energy particle field on embryonic leaflet culture and plant regeneration of peanut. J Nucl Agric Sci, 2012, 26(3): 433–438 (in Chinese). 于新玲, 劉錄祥, 喬利仙, 等. 高能混合粒子場(chǎng)輻照對(duì)花生胚小葉組織培養(yǎng)及植株再生的影響. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2012, 26(3): 433–438.

[23] Hong YH, Zhu ZH, Huang H, et al. On tissue culture and irradiation variation of chrysanthemum. J Hunan Agric Univ: Nat Sci, 2003, 29(6): 457–461 (in Chinese). 洪亞輝, 朱兆海, 黃璜, 等. 菊花組織培養(yǎng)與輻射誘變的研究. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2003, 29(6): 457–461.

[24] Zhao MX, Sun HY, Sui JM, et al.Selection for stress-resistant mutants and survey on offspring characteristics of peanut. J Nucl Agric Sci, 2012, 26(8): 1106–1107 (in Chinese). 趙明霞, 孫海燕, 隋炯明, 等. 離體篩選花生抗逆突變體及其后代特征特性研究. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2012, 26(8): 1106–1107.

[25] Latado RR, Adames AH, Neto AT.mutation of chrysanthemum (Tzvelev) with Ethylmethanesulphonate (EMS) in immature floral pedicels. Plant Cell Tissue Organ Cult, 2004, 77(1): 103–106.

[26] Li W, Sun ZH, Zhang WC, et al. Studies on screening freezing-resistant regen-erated plants from X-ray irradiated citrus protoplasts. Acta Botan Sin, 1998, 40(8): 729–733 (in Chinese). 李衛(wèi), 孫中海, 章文才, 等. 柑桔原生質(zhì)體輻射誘變篩選抗寒再生植株. 植物學(xué)報(bào), 1998, 40(8): 729–733.

[27] Jiang CY, Ning SX, Yang WX, et al. Selective breeding of a new breed of magnolia denudata from radiation-induced mutation of callus. Acta Horticult Sin, 2002, 29(5): 473–476 (in Chinese). 姜長(zhǎng)陽(yáng), 寧淑香, 楊文新, 等. 愈傷組織輻射誘變選育玉蘭新品系. 園藝學(xué)報(bào), 2002, 29(5): 473–476.

[28] Gao MW. Hezu 8, a new wheat variety developed withmutation technique. Trends Nucl Phys, 1992, 9(4): 45–46 (in Chinese). 高明尉. 世界上第一個(gè)小麥離體誘變新品種——核組8號(hào). 核物理動(dòng)態(tài), 1992, 9(4): 45–46.

[29] Venkatachalam P, Jayabalam N. Selection and regeneration of groundnut plants resistant to the pathotoxic culture filtrate ofthrough tissue culture technology. Appl Biochem Biotechnol, 1997, 61(3): 351–364.

[30] Zhao MX, Sun HY, Ji RR, et al.mutagenesis and directed screening for salt-tolerant mutants in peanut. Euphytica, 2013, 193 (1): 89–99.

[31] Qiu QS, Jing LH, Yang CD, et al. Effect of irradiation with 14 MeV fast neutron on contents of nucleic acids and soluble protein in wheat seedling. J Nucl Agri Sci, 1993, 7(3): 145–148 (in Chinese). 邱全勝, 敬蘭花, 楊成德, 等. 14MeV快中子輻照對(duì)小麥幼苗核酸和可溶性蛋白質(zhì)含量的影響. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 1993, 7(3): 145–148.

[32] Yu SL. Varieties and their pedigree of peanuts in China. Shanghai: Shanghai Science and Technology Press, 2008 (in Chinese).禹山林. 中國(guó)花生品種及其系譜. 上海: 上?？萍汲霭嫔? 2008.

Breeding peanut variety Yuhua 7 by fast neutron irradiation and tissue culture

Xia Wang1, Luxiang Liu2, Lixian Qiao3, Jiongming Sui3, Defeng Jiang3, Guan Li3, Linshu Zhao2, and Jingshan Wang3

1 College of Life Sciences, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, Shandong, China 2 National Center of Space Mutagenesis for Crop Improvement, National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement, Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China 3 Dry-land Farming Technology Laboratory, College of Agronomy, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, Shandong, China

Creating new germplasms and breeding new cultivars in peanut by radiation mutagenesis and tissue culture were conducted in this study, aiming to develop new breeding method of peanut. Mature seeds from Luhua 11, the most commonly grown peanut cultivar in Northern China, were treated by fast neutron irradiation. Then the embryo leaflets were separated from the irradiated seeds and inoculated on the media, and the regenerated seedlings were obtained through somatic embryogenesis pathway. The regenerated seedlings were grafted, acclimated and then transplanted into field and the selfed pods were harvested from 83 regenerated plants. The progenies were selected by the pedigree method, and 107 mutants were obtained from the progenies of the 83 regenerated plants. Different mutants showed obvious variation in many agronomic traits, including main stem height, branch number, pod shape and size, seed coat color, inner seed coat color, oil content and protein content etc. Yuhua 7, a new peanut variety with low oil content, early maturity and waterlogging tolerance was obtained. The yield of Yuhua 7 was over 14% higher than that of the mutagenic parent Luhua 11, and the oil content of kernels was 47.0%, lower than that of parent Luhua 11 with 52.1% oil content. Yuhua 7 had passed peanut variety regional multi-location trials in Liaoning Province in 2016 and its average yield was 13.8% higher than that of the control variety Baisha 1017. It had also passed national peanut variety registration, and the registration ID is “GPD peanut (2018) 370105”. The results show that irradiation mutagenesis combined with tissue culture is an effective method for creating new germplasm and breeding new varieties of peanut.

peanut variety, irradiation mutagenesis,culture, low oil content, early maturity

May 16, 2018;

August 13, 2018

National Natural Science Foundation of China (Nos. 31471524, 31571705).

Jingshan Wang. E-mail: jswang319@126.com

國(guó)家自然科學(xué)基金(Nos. 31471524，31571705) 資助。

2018-08-28

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20180827.1328.003.html

10.13345/j.cjb.180207

(本文責(zé)編 陳宏宇)