潘 虹

(遵義醫(yī)學院，貴州 遵義 563099)

檳榔(Areca nut)為櫚科植物檳榔(Areca catechu L.)的干燥成熟果實，是繼煙草、酒精和咖啡因之后的世界四大嗜好品之一，特別流行于南亞和東南亞地區(qū)，如印度、馬來西亞，以及國內的湖南、海南、臺灣等地區(qū)[1]，全世界有超過6億檳榔癖好者。盡管研究發(fā)現(xiàn)咀嚼檳榔具有抗寄生蟲、抗抑郁、抗疲勞、抗氧化、抗菌以及抗高血壓等藥理作用[2]，但是也有文獻報道咀嚼檳榔與肝硬化、口腔黏膜下纖維化和其他毒理學效應的發(fā)生具有密切關系[2]。國際癌癥研究協(xié)會(The International Association of Research on Cancer, IARC)在2004年已將檳榔列為人類致癌物[3]。檳榔堿是檳榔中主要的生物堿類活性成分，也是主要的毒性成分[4]，因此在含檳榔制劑的質量控制或食用檳榔后在生物基質中準確定性和定量分析檳榔堿都是非常必要的，是對檳榔進行進一步藥效和毒性研究的基礎。隨著分析技術的迅猛發(fā)展，從檳榔中提取檳榔堿的方法和測定檳榔堿含量的方法也日益增多。本研究主要介紹檳榔堿提取方法和測定檳榔堿含量的國內外標準和文獻方法，希望為檳榔的質量控制和評價提供參考。

1 提取方法

1.1 加熱回流提取法

加熱回流提取法(heating reflux extraction)是使用水或乙醇等有機溶劑從天然植物中提取活性成分的傳統(tǒng)方法，具有設備簡單、操作簡便和能耗低等優(yōu)點，但是需要消耗大量有機溶劑，且一般需6～8h才能提取完全，也不適合用于熱不穩(wěn)定化合物的提取。加熱回流提取法通常是通過正交試驗法優(yōu)化提取溶劑、提取時間、提取次數(shù)以及提取溫度，獲得目標產物的最佳得率。羅士數(shù)等[5]通過加熱回流提取法萃取檳榔中的檳榔堿，以乙醇作為提取溶劑，以L9(34)正交試驗優(yōu)化提取溫度、次數(shù)、時間和料液比，結果當提取溶劑是乙醇(85%，v/v)、提取溫度為85 ℃、料液比1∶14(g/mL)、提取次數(shù)3次，每次提取1 h時，檳榔堿的得率最高。另外，還將提取液堿化至pH=8，呈弱堿性的提取液一方面使得與檳榔中鞣酸結合的檳榔堿游離出來，同時避免了檳榔堿在強堿性條件下被水解，此時的檳榔堿得率為(0.251±0.03)%。

1.2 超聲波提取法

超聲波提取法(ultrasound assisted extraction, UAE)與傳統(tǒng)的加熱回流相比，儀器中的超聲波能夠增加提取液與提取溶劑的接觸面積，加快提取液中分子運動速率，并利用空化作用使細胞壁破裂[6]，從而提高了提取效率。羅士數(shù)等[7]運用超聲輔助加熱回流提取法從檳榔中提取檳榔堿，與其同課題組優(yōu)化的傳統(tǒng)方法相比[5]，在40 kHz超聲波頻率和300 W超聲功率條件下，料液比減少42.8%，提取溫度從85 ℃下降至83 ℃，提取時間從1 h減少為20 min，而提取率基本能夠達到傳統(tǒng)方法的得率(0.1987%)，說明超聲波提取法能夠在一定程度上提高提取效率，減少時間和經濟成本。

1.3 亞臨界水提取法

亞臨界水提取法(subcritical water extraction, SCWE)是近年來新發(fā)展起來的綠色萃取方法。由于水在不同溫度和壓力下會呈現(xiàn)不同的極性，可以通過控制溫度和壓力人為改變其極性，使得天然植物中的水溶性或脂溶性活性成分被連續(xù)萃取出來[8]。由于在整個提取過程中都不使用酸、堿等催化劑或有機溶劑，因此此項技術既綠色環(huán)保又經濟實用。康麗如等[9]采用SCWE法對檳榔中的檳榔堿進行萃取，優(yōu)化出的最佳工藝為提取時間43 min，料液比35∶1，提取溫度144 ℃，結果表明在此條件下，檳榔堿的提取率為0.425%，高于超聲波提取法。

1.4 超臨界CO2流體萃取

超臨界CO2流體萃取(supercritical CO2extraction，SFE)與SCWE技術類似，都是通過改變超臨界流體CO2的壓力和溫度來改變其溶解能力，當處于不同壓力和溫度條件下的超臨界CO2流體與混合成分中不同沸點、極性和分子量的物質接觸時，就能夠選擇性地將其目標成分萃取出來[10]，此方法在整個萃取過程不消耗有機溶劑，較為環(huán)保，特別適合于提高極復雜成分的萃取效率。張春江等[11]采用SFE法萃取檳榔中的檳榔堿，并優(yōu)化了萃取溫度、時間和壓力等條件，還在研究中添加了氨水作為堿化劑來使與酸性成分結合的檳榔堿游離出來，并使用了改進劑(乙醇)來改善萃取效果，在72 ℃、57MPa下萃取26min，檳榔堿得率為(25.85±0.41)%。

2 分析方法

2.1 滴定法

滴定法(titration)是傳統(tǒng)的化學分析方法，其基本原理是將標定好的已知濃度的滴定液逐滴加入到未知濃度的溶液中，直到加入的滴定液的量與未知物化學反應完全為止，根據(jù)所消耗的滴定液的體積和濃度，得出待測物的濃度。通常是利用添加在未知溶液中的指示劑或溶液本身的顏色變化來判斷滴定終點。劉蕊等[12,13]采用兩步滴定法測定檳榔堿的含量，即首先加入硫酸滴定劑，再加入氫氧化鈉滴定劑進行滴定；劉蕊等通過滴定法考察了檳榔花果中檳榔堿含量隨著時間發(fā)生變化的過程，以及在檳榔果制備過程中，烘干溫度與時間對檳榔堿的含量影響。但是滴定法本身存在專屬性低、檢測限高和誤差大的缺點。

2.2 分光光度法

分光光度法(spectrophotometry)基本原理是測定待測物質在某一個特定波長處(或波長范圍內)產生的吸光度，此吸光度在一定范圍內與待測定物質的濃度成正比。高敏等[14]采用可見光分光光度法測定檳榔中檳榔堿的含量，其原理是檳榔堿會和澳甲酚綠形成離子對，用氯仿萃取，最后再往氯仿層加入堿性溶液，嗅甲酚綠就會重新游離出來，再在可見光618 nm波長下測其吸光度，此方法最低定量下限為19.5 μg/mL。分光光度法操作簡便，儀器比較常見，但是靈敏度較低，不能滿足檳榔堿的痕量分析。

2.3 色譜法

當流動相流經固定相時，待測混合物會在兩相之間進行分配，利用不同成分的分配性質不同，其遷移速度也就不同，最終達到分離的效果，此法稱為色譜法(chromatography)。目前，色譜法在醫(yī)藥學和化工領域已被廣泛應用，儀器普及度較高，操作越來越智能化，同時具有高靈敏度、高通量、用樣量少、準確性和重復性好的優(yōu)點。

2.3.1 薄層色譜掃描法 薄層色譜掃描法(thin layer chromatography, TCL)是將待測物及其對照品在薄層板上點樣，用流動相展開后，對比它們的比移值，主要適用于化學成分的鑒別和雜質檢查。2015版中國藥典一部中就采用了TLC法進行檳榔藥材和飲片的鑒別[15]：采用硅膠G薄層板，展開劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯-濃氨試液(7.5∶7.5∶0.2)，展開缸預先用氨蒸汽飽和，經過展開后，取出薄層板，再放置在碘蒸氣中熏至斑點清晰。盧英翠和林勵等[16-17]還建立了TLC測定檳榔中檳榔堿含量的測定方法。

2.3.2 毛細管電泳法 毛細管電泳(capillary electrophoresis,CE)是一類新型液相分離技術，已普遍應用于醫(yī)藥分析中，其原理是以毛細管為分離通道，再加上高壓電場，是一種利用復雜樣品中各組分因遷移率不同而達到分離作用的分析方法[18]，具有靈敏度高、用樣量少的優(yōu)點。袁煒[19]建立了CE法測定檳榔中檳榔堿和檳榔次堿的含量，此方法不僅優(yōu)化出了合適的電解質溶液(pH=3.2的25mmol/L磷酸-25mmol/L酸二氫鈉緩沖溶液)，成功使檳榔堿和檳榔次堿達到色譜分離，還優(yōu)化出了最佳分析條件：工作溫度29 ℃，電壓20 kV，虹吸進樣20 s，檢測波長為185 nm，最低定量下限均為2 μg/mL。也有國外文獻[20,21]報道了使用CE法測定檳榔堿的含量，此方法能夠在1 min之內完成對檳榔堿的檢測，檳榔堿在20～1 500 μM范圍內線性關系良好。

微流控芯片(Microfluidicchip)非接觸電導法是在CE基礎上發(fā)展起來的一種分析方法，此法將樣品制備、分離和檢測等各項技術集成到一塊芯片上，實現(xiàn)了一體化技術平臺，被認為是當今分析方法的前沿技術之一。楊秀娟等[22]采用此方法測定檳榔飲片中的檳榔堿含量，采用的分析條件為：以2 mmol·L-1醋酸+2mmol·L-1醋酸鈉(pH=4.7)作為緩沖溶液，分離電壓2.5 kV，進樣時間10 s，結果檳榔堿在10～200 μg·ml-1濃度范圍內線性關系良好。

2.3.3 高效液相色譜法 高效液相色譜法(High performance liquid chromatography, HPLC)主要用于多成分復雜混合物的分離和分析，80%左右的化合物都可以使用此方法進行含量測定，應用范圍十分廣泛，分離效率高。2015版中國藥典一部記載使用高效液相色譜法對檳榔進行質量控制，并以檳榔堿的含量作為質量控制與評價的指標[15]，方法是采用強陽離子交換鍵合硅膠色譜柱，流動相為乙腈-磷酸溶液(2→1000，pH值調至3.8)(55∶45)，在紫外波長為215nm處檢測檳榔堿的含量?？滋m芬等[23]建立了超高效液相色譜法測定檳榔提取液中檳榔的含量，分析條件為：C18色譜柱，乙腈-甲醇-0.1%冰醋酸溶液(25∶20∶55)為流動相，梯度洗脫，檢測波長為215 nm，最低定量下限為0.013 mg/mL。COX等[24]采用HPLC法測定人唾液中檳榔堿的含量，檢測波長為215 nm。陳浩桉等[25]采用陽離子型(SCX)高效液相色譜柱，流動相為乙睛一磷酸(氨調pH至3.8)(60∶40)，檳榔堿在0.05～0.30 mg/mL范圍成線性。除此之外，國內外也有較多文獻[26-31]記載了使用HPLC法測定檳榔堿的含量。HPLC法與滴定法、分光光度法和薄層法等相比，靈敏度更高、精密度和重復性更好，已成為檳榔堿含量測定的最常用方法之一。但是由于檳榔堿結構缺乏共軛基團，紫外吸收較弱，所以此方法的靈敏度還有待提高。

2.3.4 液相色譜質譜聯(lián)用技術 隨著質譜技術的飛速發(fā)展，液相色譜-質譜聯(lián)用技術(liquid chromatography-mass spectrography, LC/MS)在醫(yī)藥領域的應用日益廣泛，已成為當今醫(yī)藥學和化工領域中最強有力的分析工具之一。筆者課題組就在前期研究中建立了LC-MS/MS法測定大鼠血漿中檳榔堿的濃度[32]，采用C18色譜柱，選擇甲醇-水(含0.1%甲酸)(5∶95)作為流動相，監(jiān)測離子對為156.2→53.2(檳榔堿)和256.1→152.1(內標更昔洛韋)，結果發(fā)現(xiàn)大鼠血漿中檳榔堿在1～1 000ng/mL濃度范圍內成線性，此方法大大提高了分析靈敏度；在研究中還發(fā)現(xiàn)檳榔堿由于含有羧酸酯鍵，在大鼠體內會被高表達的羧酸酯酶水解生成檳榔次堿，造成了其體內暴露量的低下。HU等[33]采用LC-MS法測定了人咀嚼檳榔后包括檳榔堿在內的5個代謝物的含量。FENG等[34]采用基質輔助激光解吸飛行時間質譜儀測定檳榔中檳榔堿等小分子化合物的含量。同時，也有較多國外文獻[35-40]報道了采用LC-MS法測定比格犬血漿、檳榔、人唾液、頭發(fā)、乳汁以及含檳榔中藥制劑中檳榔堿的含量。研究結果均表明采用LC-MS法測定檳榔堿的含量重復性好、準確度高、專屬性好、靈敏度高，十分適合檳榔堿的痕量測定，特別適合于體內檳榔堿的濃度測定。

3 結語

總的來說，檳榔堿的幾種提取方法各有優(yōu)缺點，建議實驗者在有條件的情況下采用更加綠色環(huán)保安全的提取方法。就檳榔堿的分析方法而言，滴定法技術成熟，操作簡單，成本較低，但是專屬性較差，且檳榔提取物中含有許多生物堿成分，會極大干擾檳榔堿的準確測定，一般情況下，不建議使用該法；分光光度法、毛細管電泳法等也具有較為獨特的優(yōu)缺點，可根據(jù)實驗條件進行選擇；而高效液相色譜法作為2015版中國藥典收錄的對于檳榔藥材及其飲片含量測定的標準方法具有高效、靈敏度高和選擇性好等特點；而LC-MS法的靈敏度以及專屬性則比高效液相色譜法更高，已成為測定生物基質或非生物基質中檳榔堿含量的最強有力的分析方法。