鐘俊杰，楊小燕，藍錦陽，霍筠婷，李旭洪，肖新玉

(佛山市南海區(qū)人民醫(yī)院 藥劑科，廣東 佛山 528200)

陳皮原名“橘柚”，始載于東漢《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，功效為“主胸中瘕熱，逆氣，利水谷，久服去臭，下氣”[1]。傳統(tǒng)認為橘皮以陳久者入藥最佳，故現(xiàn)今沿用陳皮為名。本品為蕓香科(Rutaceae)植物橘(CitrusreticulateBlanco) 及其栽培變種的干燥成熟果皮。其性溫，味苦、辛，歸脾、肺經(jīng)，具有理氣健脾、燥濕化痰之功效[2]。近現(xiàn)代學者對陳皮展開了系統(tǒng)深入的研究，越來越多的證據(jù)表明，陳皮在貯藏過程中由于物理變化、化學反應、微生物作用等使其藥用活性成分含量增加，非藥用活性物質(zhì)減少，即“陳久者良”。陳皮是常用大宗藥材，不但用量大，而且用途廣，僅2015年版《中華人民共和國藥典》一部中所收載的含陳皮的成方制劑就有100余種，古今專著收載的方劑含陳皮者更是數(shù)不勝數(shù)。近現(xiàn)代興起的食療保健熱更使市場對陳皮的需求日益增長，尤其以陳年陳皮供不應求。目前市場上的陳皮貯藏年限一般從1～3年至十年、十幾年甚至幾十年不等，貯藏年份越久價格越高。民間向來有“一兩陳皮一兩金”的說法，雖然有夸張的成分，但也證明了陳年陳皮價格之高?，F(xiàn)今陳皮陳化工藝大多是沿用傳統(tǒng)的自然陳化工藝，在自然條件下陳化陳皮時間較長，且不可控因素太多，不利于大規(guī)模標準化生產(chǎn)。因此根據(jù)中醫(yī)傳統(tǒng)理論指導，結(jié)合現(xiàn)有陳皮陳化機理研究成果尋找高效且標準化的陳化工藝勢在必行。本研究立足于陳皮陳化的相關(guān)研究成果，結(jié)合傳統(tǒng)陳皮陳化工藝，初步探討人工接種黑曲霉加速陳皮陳化的工藝，以期為深入研究陳皮加速陳化工藝提供參考。

1 陳皮之歷史淵源

1.1 歷史溯源

陳皮是我國傳統(tǒng)常用中藥材，其歷史源遠流長。本品最早以“橘柚”記載于東漢《神農(nóng)本草經(jīng)》，以果皮入藥，故亦名“橘皮”，列為上品。雖然當時《神農(nóng)本草經(jīng)》并沒有明確指出橘皮需陳用，但亦有“土地所處，真?zhèn)涡玛?，并有各法”的論述，提出藥物有新、陳之別，為后來橘皮陳用提供了理論依據(jù)。南北朝時期，陶弘景[3]著《本草經(jīng)集注》記載橘皮經(jīng)過陳化之后使用效果更佳，指出“橘皮療氣大勝，以陳久者良”。雷敩[4]著《雷公炮炙論》記載：“其橘皮，年深者最妙?！苯?jīng)過長期的臨床實踐，這個時期的醫(yī)家已經(jīng)充分認識到橘皮需要陳化方能有更好的功效。唐代孟詵[5]著《食療本草》中卷上橘篇中首次出現(xiàn)以陳皮稱謂陳年橘皮，至此陳皮因其需陳化使用而漸漸獨立成為一個新的中藥材品種。元代王好古[6]著《湯液本草》記載“橘皮以色紅日久者唯佳，故曰紅皮、陳皮。去白者曰橘紅也”，不但強調(diào)陳皮唯日久者佳，而且還將橘皮根據(jù)加工工藝不同分為了陳皮(紅皮)與橘紅。至明代，倪朱謨[7]著《本草匯言》記載：“沈則施曰：它藥貴新，唯橘皮貴陳?！标惼ぷ鳛橐粋€獨立的中藥材品種，陳化使之區(qū)別于其他藥材，成為判斷其質(zhì)量好壞的一個重要標準。至此后世醫(yī)家均沿用陳皮這一稱謂到近現(xiàn)代。新中國成立后，從1953年版《中國藥典》開始都是以陳皮作為正名一直沿用。

1.2 歷代各家對“陳久者良”的論述

傳統(tǒng)上認為陳皮“陳久者良”主要是去其燥性。唐代孫思邈[8]著《千金食治》中認為“入藥以陳久橘皮辛辣氣稍和為佳”，已經(jīng)開始認識到久陳可以緩和橘皮辛辣之氣，無耗氣之虞。明代李中梓[9]在《雷公炮制藥性解》中解析道：“陳皮辛苦之性，能泄肺部……采時性已極熱，如人至老成，則酷性漸減，收藏又復陳久，則多歷梅夏而烈氣全消，溫中而無燥熱之患，行氣而無峻削之虞?！鼻宕舭篬10]著《本草備要》也指出“陳則烈氣消，無燥散之患”。由此可見古人認為陳皮陳化的主要作用是減少陳皮辛燥之氣，避免由于峻烈之性而耗傷元氣。

2 陳皮現(xiàn)代研究

2.1 陳皮的主要有效成分及藥理作用

現(xiàn)代研究表明，黃酮類、揮發(fā)油類、生物堿類物質(zhì)及微量元素是陳皮的主要有效成分。

2.1.1 黃酮類 陳皮含有多種黃酮類活性成分，主要以糖苷或苷元的形式存在，包括橙皮苷(hesperidin)、橙皮素(tangeretin)、新橙皮苷(neohesperidin)、川橙皮素(neobiletin)、二氫川陳皮素(citromitin)、5,6,7,8,4′-五甲氧基黃酮(5,6,7,8,4′-pentamethoxyflavone)等。

2.1.2 揮發(fā)油 陳皮含有大量揮發(fā)油成分，含量為1.9%～3.5%，包括右旋檸檬烯(d-limonene)、α-蒎烯(α-pinene)、β-月桂烯(β-myrcene)、α-水芹烯(α-phellandrene)、α-羅勒烯(α-ocimene)等。

2.1.3 其他成分 陳皮中還含有多種活性成分，其中有生物堿類對羥福林(syneprine，辛弗林)，多糖類陳皮多糖、果膠，微量元素鉀、鈉、鈣、鎂、銅、鋅、鐵、鍶、錳等，還有肌醇、β-谷甾醇、麝香草酚等。

2.1.4 藥理作用 大量研究表明陳皮提取物具有促進消化[11-12]、強心[13]、抗血栓[14]、抗氧化[15]、抗腫瘤[16]等多種藥理作用。其中對羥福林(syneprine，辛弗林)現(xiàn)代藥理研究比較明確，研究表明其對α受體，β受體皆有興奮作用，可以增強心肌收縮力，增加心輸出量，改變心臟泵血功能，在靜脈給藥途徑下還能收縮血管，升高血壓，具有抗休克作用[17]。此外，對羥福林可以刺激β-3腎上腺素受體而發(fā)生脂質(zhì)分解及發(fā)揮生熱作用，閆晗等[18]研究表明對羥福林對營養(yǎng)型肥胖大鼠有減肥效果，揭示了其具有減肥的藥理作用。

2.2 陳皮“陳久者良”的現(xiàn)代科學闡釋

目前“陳久者良”的現(xiàn)代研究大多著眼于不同貯藏年份黃酮類與揮發(fā)油成分含量變化上。

2.2.1 黃酮類 大多數(shù)研究結(jié)果顯示陳皮儲存時間越長，黃酮類成分含量越高。羅瓊[19]研究表明陳皮的貯藏時間越長，橙皮苷的含量越高。林林等[20]比較不同年份新會陳皮總黃酮和橙皮苷含量，發(fā)現(xiàn)貯藏時間越長，總黃酮與橙皮苷含量越高。曹臣等[21]認為橙皮苷是一種黃酮類苷，由蕓香糖與陳皮苷元結(jié)合組成，存放時間越長，陳皮內(nèi)含的蕓香糖與橙皮苷原形成的橙皮苷越多，因此含量隨存放時間的增加而增加。張鑫等[22]研究發(fā)現(xiàn)無菌新鮮橘皮接種黑曲霉培養(yǎng)后可使其黃酮類總量增加，提示微生物在陳皮陳化過程中具有重要作用。也有研究表明，黃酮類活性成分不會隨著貯藏時間的增加而一直增加。張鑫等[23]在模擬加速試驗中發(fā)現(xiàn)總黃酮與橙皮苷的含量在實驗過程中呈現(xiàn)先增后減的趨勢，由此推論在實際陳化過程中黃酮類活性成分并非一直隨時間增加而增加，提示陳化的時間并不一定是越久越好。

2.2.2 揮發(fā)油 大多數(shù)研究結(jié)果顯示陳皮儲存時間越長，總揮發(fā)油成分含量越低。羅瓊[19]研究表明隨著陳皮貯藏時間的增加，揮發(fā)類成分含量逐漸降低。易侖朝等[24]通過研究新鮮及陳舊陳皮樣品中揮發(fā)性成分發(fā)現(xiàn)，各低沸點成分，如檸檬烯等隨著貯藏時間的增加，含量均有所下降，而高沸點成分含量下降緩慢?，F(xiàn)代藥理學研究表明，陳皮的“辛辣之氣”主要是揮發(fā)性物質(zhì)的作用，而經(jīng)過長期貯藏，其所含的揮發(fā)油自然揮發(fā)，含量下降，起到了“烈氣消”的作用。易侖朝等[24]認為正是由于檸檬烯等成分逐漸減少，陳皮氣味隨之香醇。此外，張鑫等[22]研究發(fā)現(xiàn)無菌新鮮橘皮接種黑曲霉培養(yǎng)后可以使其揮發(fā)油總含量降低，而揮發(fā)油的種類增加，提示微生物在陳皮陳化過程中具有重要作用。

2.2.3 陳皮陳化過程中的微生物作用 劉素娟等[25]首先從陳年陳皮分離得到真菌并證明其在陳化過程中對陳皮藥效物質(zhì)產(chǎn)生影響。后續(xù)研究中首次將從陳皮中分離得到的黑曲霉返接種到無菌陳皮樣品中，在恒溫恒濕培養(yǎng)后測定發(fā)現(xiàn)，陳皮總黃酮含量增加，揮發(fā)油含量降低，但發(fā)揮油的種類增加[22]。該研究揭示了黑曲霉與陳皮陳化作用的相關(guān)性，證實了陳化過程中微生物的作用，為“陳久者良”研究提供了新思路。

3 黑曲霉菌概述及相關(guān)應用

3.1 黑曲霉菌概述

黑曲霉(Aspergillus niger)是一種常見的真菌，屬于半知菌亞門，絲孢子綱，絲孢子目，叢梗孢科，曲霉屬，廣泛存在于自然界中。黑曲霉具有生長旺盛、發(fā)酵周期短、不易產(chǎn)生毒素等特點，是美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)認證的安全菌種[26-27]。

3.2 黑曲霉的現(xiàn)代應用

黑曲霉是現(xiàn)代工業(yè)的重要發(fā)酵微生物，其可以生產(chǎn)淀粉酶、酸性蛋白霉、纖維素酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶等多種酶制劑，因而在工業(yè)酶制劑、有機酸發(fā)酵、生物發(fā)酵等方面應用廣泛。自上世紀90年代以來，分子生物學的進步率先揭開了全面研究黑曲霉細胞工廠運作機制的序幕，2007年黑曲霉基因組的公布更是將黑曲霉的研究引入后基因組時代，其基因組數(shù)據(jù)的公布為功能基因組學的深入研究奠定了基礎(chǔ)，轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組方面的數(shù)據(jù)很快得到了發(fā)表，使細胞工廠設計和代謝工程研究變得更加便捷，也為通過工程手段提高工業(yè)生產(chǎn)菌株性能提供了新的思路和方法[28]。

4 傳統(tǒng)陳皮產(chǎn)地加工與陳化工藝簡介

筆者曾赴廣陳皮核心產(chǎn)區(qū)新會天馬產(chǎn)區(qū)實地考察，通過走訪當?shù)仃惼しN植戶與陳皮加工作坊初步了解了陳皮的產(chǎn)地加工方法及傳統(tǒng)陳化工藝。

廣陳皮一般從立秋開始采收，分為立秋至秋分、秋分至立冬、立冬至冬至三個時期。果實的成熟程度不同產(chǎn)生了新鮮橘皮外觀顏色上的差異，傳統(tǒng)上形象地分別稱之為“青皮、二紅皮、大紅皮”。當?shù)貍鹘y(tǒng)上認為三者制成陳皮的功效是有所差別的，青皮味較辛澀，一般藥用為主；大紅皮味道較醇厚但陳化條件要求苛刻，價格較高，一般作為茶飲或者高級食材調(diào)料；二紅皮則介于兩者之間，使用范圍最廣。

采收后的鮮果首先進行分級，然后采用“對稱二刀法”或“正三刀”法剝皮，得到三瓣的果皮。選擇晴朗的天氣，將其置于陽光下使鮮皮自然失水萎蔫質(zhì)地變軟后翻皮，使橘白向外。新會當?shù)丶彝プ顐鹘y(tǒng)的做法是將經(jīng)過自然生曬至完全干燥的果皮穿成一串吊在房前屋后或者灶臺上方自然陳化，隨用隨拿，并無特意加工。而現(xiàn)今作坊普遍是用黃麻袋裝好進入專門的陳化倉庫進行陳化。陳化倉庫環(huán)境要求通風、干爽，用袋裝好的陳皮要離墻、離地、離頂，環(huán)境溫度常溫即可。

陳皮陳化前5年都要適時翻曬，待5年之后狀態(tài)基本穩(wěn)定后可用罐子密封保存，通常2～3年就可以上市售賣，但由于溫度、濕度、微生物條件等不可控條件較多，各批次的陳皮質(zhì)量往往難以一致，加之陳化耗時較長，占用地方較多，成為了目前制約陳皮產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素。

5 加速陳化工藝的設想及可行性分析

5.1 陳皮加速陳化工藝的設想

5.1.1 黑曲霉菌株的篩選 優(yōu)良的菌株是陳皮陳化過程中藥效活性成分轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。分別在5年、10年、20年陳皮上分離黑曲霉菌菌株，通過實驗篩選具有明顯促進陳皮藥效物質(zhì)轉(zhuǎn)化作用且培養(yǎng)條件合適的菌株，篩選出的菌株進行大規(guī)模培養(yǎng)，生產(chǎn)大量優(yōu)良黑曲霉菌株孢子，供陳皮接種使用。

5.1.2 黑曲霉接種 使用輻射滅菌法對完全干燥好的新鮮橘皮(新會茶枝柑)進行滅菌。滅菌后噴灑黑曲霉孢子懸浮液，用黃麻袋裝好后置于加速陳化倉庫中進行陳化。

5.1.3 建立加速陳化倉庫 加速陳化倉庫采用非層流型空氣系統(tǒng)取代自然通風，引入恒溫恒濕設備使陳化過程中倉庫溫度保持在30 ℃，濕度保持在75%，使陳皮在恒定的溫濕度下進行55天的加速陳化。

5.1.4 陳皮粉發(fā)酵陳化工藝 取完全干燥的新鮮橘皮制成粗粉，進行輻射滅菌后加入黑曲霉孢子懸浮液，充分混合后放入30 cm×30 cm×10 cm的小型黃麻袋中，稍稍壓緊后在溫度30 ℃，濕度90%的條件下發(fā)酵陳化20天。

5.2 可行性分析

5.2.1 陳化環(huán)境優(yōu)化 陳皮陳化過程中藥效物質(zhì)的轉(zhuǎn)化與陳化環(huán)境溫度、濕度和微生物息息相關(guān)。傳統(tǒng)上陳皮陳化是在自然通風環(huán)境下進行，溫度與濕度受天氣的影響較大，難以長期保持陳化的最佳溫濕度而導致耗時延長，加之微生物等條件也難以控制，共同造成了不同批次陳化的陳皮質(zhì)量難以一致，難以達到現(xiàn)代醫(yī)療的質(zhì)量要求。針對這個問題，新工藝優(yōu)化了陳化倉庫的通風系統(tǒng)，采用非層流空氣系統(tǒng)取代了自然通風，這樣不僅使倉庫內(nèi)部環(huán)境不會直接受外界天氣影響，還能一定程度減少外界微生物進入，為陳化過程中的陳皮提供一個相對穩(wěn)定且較為潔凈的環(huán)境。采用恒溫恒濕系統(tǒng)則使陳化過程的溫度與濕度保持在合適范圍。倉庫內(nèi)不受外界溫度、濕度等影響，每一批次的陳皮陳化過程中酶促反應與微生物作用都是在最優(yōu)化的條件下進行，與傳統(tǒng)工藝相比可使陳化效率更高、耗時更短。張鑫等[23]研究表明在模擬加速陳化實驗中，廣陳皮(茶枝柑)的各藥效成分轉(zhuǎn)化最佳天數(shù)為55天左右。

5.2.2 微生物條件優(yōu)化 成都中醫(yī)藥大學的團隊已經(jīng)證實了陳皮陳化過程中黑曲霉的重要作用。新工藝通過篩選優(yōu)良的黑曲霉菌株，再人工接種到經(jīng)過消毒的新鮮橘皮(茶枝柑)上，這樣不僅可以避免陳化過程中多種微生物共同作用帶來的質(zhì)量不可控問題，還能一定程度上加快藥效成分的轉(zhuǎn)化效率而使陳化耗時縮短。

5.2.3 陳皮(打粉)陳化新思路分析 陳皮是常用大宗藥材，其作為原料大量應用于中成藥中，因此制藥產(chǎn)業(yè)的需求量尤為巨大。制藥企業(yè)應用陳皮大多采用粉碎后提取有效成分或直接打粉混合制成膠囊使用，對飲片的外觀要求不高。新工藝設計采用橘皮粗粉接種黑曲霉進行加速發(fā)酵陳化，經(jīng)過粉碎后的橘皮會有更大的表面積，各種酶促反應可以更充分地進行。粉碎后的橘皮在人工接種黑曲霉孢子時可更好地混合，使其作用效率更高。新工藝在整片陳皮陳化的基礎(chǔ)上制成粗粉發(fā)酵陳化，更能縮短陳化時間，提高陳皮生產(chǎn)效率，滿足制藥工業(yè)的巨大需求。

6 討論

陳皮作為傳統(tǒng)中藥材應用已有兩千余年歷史，無論是歷代本草文獻還是現(xiàn)代研究均支持“陳久者良”的觀點。然而陳化多長時間才算久陳？什么樣的質(zhì)量標準才能判斷為良？上述問題一直沒有明確答案。藥效活性成分含量是評價中藥飲片質(zhì)量的重要依據(jù)，2015年版《中國藥典》(一部)中陳皮項下只有橙皮苷的含量標準，顯然單一測定橙皮苷含量不能全面評價陳皮的質(zhì)量優(yōu)劣。傳統(tǒng)認為陳年陳皮氣味更加醇厚，但從氣味等方面判斷質(zhì)量未免過于主觀，難以得到直觀反映質(zhì)量水平的量化數(shù)據(jù)。因此，筆者認為制定合理的陳皮質(zhì)量評價標準勢在必行。通過現(xiàn)代中藥指紋圖譜技術(shù)，結(jié)合現(xiàn)代藥理學研究制定出科學全面的陳皮質(zhì)量評價標準，在此標準下進行“陳久者良”研究與陳化工藝改進，才可以為陳皮陳化研究奠定堅實的基礎(chǔ)。

本研究通過查閱資料對黑曲霉加速陳化陳皮工藝進行了前期設計，但這僅僅是一個前期設想，很多具體方面都需要漫長的探索與復雜的研究過程。例如良種黑曲霉的篩選就是一個龐大的系統(tǒng)工程，甚至在改良黑曲霉的過程中還要引入基因工程技術(shù)對黑曲霉進行分子生物學改造；陳化倉庫的溫度濕度條件設置也需要通過大量的實驗進行摸索；加速陳化工藝中陳皮原植物的選擇、采收時間與干燥程度等也都需要通過大量的實驗進行探索。綜上所述，本設計雖仍有諸多問題尚未明確，但仍以期為陳化陳化工藝的研究提供一定參考。