，，

(1.北部灣大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，廣西 欽州535011；2.湖南芷蘭生態(tài)環(huán)境建設(shè)有限公司, 湖南 長(zhǎng)沙410000;3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院草業(yè)科學(xué)系,湖南 長(zhǎng)沙 410128)

草坪和草坪草在現(xiàn)代城市發(fā)展和人們?nèi)粘Ｉ钪邪l(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。溫度是影響草坪草生長(zhǎng)發(fā)育的重要環(huán)境因子，在南方亞熱帶過(guò)渡性氣候區(qū)6-8月份氣溫長(zhǎng)期高達(dá)35～38 ℃, 而對(duì)于大多數(shù)的冷季型草坪草種和品種來(lái)說(shuō)都存在難以越夏的問(wèn)題。多年生黑麥草(Loliumperenne)是庭園和城市園林綠化以及足球場(chǎng)運(yùn)動(dòng)草坪建植中常用的冷季型草坪草種，因其具有草坪質(zhì)量?jī)?yōu)良、分蘗性能好、成坪迅速等優(yōu)點(diǎn)而常用作草坪建植的先鋒草種。黑麥草的最適生長(zhǎng)溫度為15～25 ℃，當(dāng)氣溫長(zhǎng)時(shí)間高于35 ℃時(shí)草坪的生長(zhǎng)發(fā)育受阻而造成草坪質(zhì)量下降甚至死亡[1-2]。

光合作用是植物對(duì)外界環(huán)境條件最為敏感的生理反應(yīng)之一。光合作用的各個(gè)環(huán)節(jié)包括光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)換等光反應(yīng)過(guò)程、CO2氣體交換及固定和還原等暗反應(yīng)過(guò)程常受到高溫脅迫的影響[3]。高溫脅迫下植物光合作用的下降，既有氣孔因素的限制，同時(shí)也受高溫脅迫下植物細(xì)胞內(nèi)PSⅡ電子傳遞和反應(yīng)中心結(jié)構(gòu)等受損、Rubisco羧化效率和RuBP再生速率下降等非氣孔因素的限制[4]。糖是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的重要能量提供者，同時(shí)也對(duì)植物的抗逆性具有重要調(diào)控作用。植物體內(nèi)非結(jié)構(gòu)性糖既是植物細(xì)胞內(nèi)代謝的重要底物，也是光合與生長(zhǎng)利用之間主要的中間貯存產(chǎn)物[5]?？扇苄蕴遣粌H可作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，還可以作為抗氧化劑以維持和保護(hù)逆境條件下植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性[6]。高溫脅迫下植物葉片光合能力降低，光合產(chǎn)物減少，從而糖代謝發(fā)生改變，而蔗糖合成酶(sucrose synthase，SS)、蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase，SPS)和轉(zhuǎn)化酶(invertase，INV)是糖代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，對(duì)細(xì)胞內(nèi)蔗糖、葡萄糖和果糖的合成與分解起著關(guān)鍵性的作用[7]。

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一種在動(dòng)植物體內(nèi)均有分布的四碳非蛋白質(zhì)氨基酸，可作為外源小分子物質(zhì)參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫調(diào)控[8]。當(dāng)植物受到水分、溫度、鹽堿等一些逆境脅迫時(shí)，植物體內(nèi)GABA的含量大量增加而抗逆性提高[9]。外源GABA 既可作為臨時(shí)氮庫(kù)，還可以清除活性氧和自由基、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的pH和滲透壓等作用以提高植物的抗逆性[10]。已有研究表明，外源GABA 能夠提高番茄(Lycopersiconesculentum)[10-11]、網(wǎng)紋甜瓜(Cucumismelo)[12]、小麥(Triticumaestivum)[13]、玉米(Zeamay)[14]、白三葉(Trifoliumrepens)[15]、黃瓜(Cucumissativus)[16]等植物的抗旱、耐鹽、耐寒等抗逆能力。Li 等[17]研究發(fā)現(xiàn)外源施用GABA可通過(guò)調(diào)控氨基酸、有機(jī)酸的代謝水平而提高冷季型草坪草匍匐剪股穎(Agrostisstolonifera)的耐旱和耐熱能力，但是關(guān)于外源GABA 能否通過(guò)調(diào)控光合和葉綠素?zé)晒馓匦约疤妓衔锎x水平來(lái)提高黑麥草耐高溫能力的研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以耐熱性弱的黑麥草品種為試驗(yàn)材料，通過(guò)噴施和澆灌外源GABA，研究了外源GABA對(duì)高溫脅迫下黑麥草的生長(zhǎng)、光合作用、葉綠素?zé)晒馓匦?、碳水化合物含量及其代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響，為解析外源GABA增強(qiáng)植物的抗逆性和多年生黑麥草的抗逆機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

采用耐熱性弱的多年生黑麥草品種‘頂峰’(L.perennecv. Pinnacle)為材料[18]于2017年9-11月進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理

黑麥草品種‘頂峰’種子經(jīng)發(fā)芽試驗(yàn)確定發(fā)芽率，然后將種子播種于裝有栽培基質(zhì)的塑料花盆中(上口徑15 cm×下口徑10 cm×高15 cm)，培養(yǎng)基質(zhì)為泥炭土和河砂(1∶1，體積比)，然后置于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)科研試驗(yàn)溫室中培養(yǎng)。幼苗長(zhǎng)至高約8 cm時(shí)進(jìn)行修剪，修剪高度保持約6 cm，每周每盆澆一次1/2濃度的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，每次澆200 mL。

將在溫室中培養(yǎng)至冠層和根系基本建成(約45 d)的各盆栽材料轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件設(shè)為晝/夜溫度為25 ℃/20 ℃，65%～75%的相對(duì)濕度，12 h光照時(shí)間和400 μmol·m-2·s-1的光照強(qiáng)度。前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)5 mmol·L-1GABA對(duì)黑麥草緩解高溫脅迫具有最好的效果。盆栽材料在生長(zhǎng)箱預(yù)培養(yǎng)3 d后，用5 mmol·L-1的GABA溶液每盆噴施100 mL并同時(shí)澆灌150 mL，2 d后開(kāi)始進(jìn)行高溫處理。對(duì)照晝夜溫度設(shè)為25 ℃/20 ℃，高溫處理晝夜溫度設(shè)為35 ℃/30 ℃，其余培養(yǎng)條件跟預(yù)培養(yǎng)相同。試驗(yàn)完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，每個(gè)處理設(shè)4次重復(fù)(4盆)。隔天澆水一次以保持土壤濕潤(rùn)。在高溫脅迫處理后的第4、12、24 h和第5、15天取倒數(shù)第3～5片功能葉片,液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱用于基因表達(dá)分析；在高溫處理后的第5 和15天進(jìn)行冠層高度、葉片電導(dǎo)率、葉綠素?zé)晒夂凸夂献饔脺y(cè)定，同時(shí)取倒數(shù)第3～5片功能葉片,液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱用于丙二醛和碳水化合物測(cè)定分析。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1)冠層高度：在高溫處理前和高溫處理的第5和15天用直尺測(cè)定各盆栽材料的冠層高度(cm)。

2)細(xì)胞膜穩(wěn)定性：用電導(dǎo)率表示，根據(jù)Hu等[19]的方法進(jìn)行測(cè)定。

3)丙二醛含量(MDA)：采用pH 7.8的磷酸緩沖液提取，然后根據(jù)Hu等[19]的方法用分光光度計(jì)(UV7500，上海)進(jìn)行測(cè)定。

4)葉綠素含量：葉片經(jīng)二甲基亞砜在室溫避光條件下浸提后采用分光光度計(jì)法進(jìn)行測(cè)定[20]。

5)葉綠素?zé)晒猓喝~片經(jīng)暗適應(yīng)30 min后，采用德國(guó)WALZ公司生產(chǎn)的PAM 2500葉綠素儀進(jìn)行最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、光化學(xué)猝滅系數(shù)(qP)、非光化學(xué)淬滅系數(shù)(NPQ)、光合電子傳遞速率(ETR)、PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)效率(ΦPSⅡ)等葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定。

6)光合作用：參考Hu 等[21]的方法，在上午9: 00-11: 00，采用Li-6400光合儀直接測(cè)定葉片凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)、蒸騰速率(Tr)和CO2響應(yīng)曲線(Pn-CO2)；測(cè)定光合作用時(shí)設(shè)定光強(qiáng)為600 μmol·m-2·s-1，CO2濃度為400 μmol·mol-1，溫度為25 ℃；用直線回歸法求得Pn-CO2響應(yīng)曲線的初始斜率，即為CO2羧化效率(CE), 根據(jù)Pn-Ci曲線計(jì)算氣孔限制度(Ls)：Ls=100%×(Aca-Aci)/Aca(ca 為大氣CO2濃度)，同時(shí)用Photosynthesis Assistant軟件計(jì)算最大光合速率(Amax)、CO2補(bǔ)償點(diǎn)(CP)、Rubisco最大羧化速率(Vcmax)和RuBP再生速率(Jmax)。

7)碳水化合物測(cè)定：樣品烘干后研磨過(guò)0.425 mm篩，用92%的乙醇提取后按王正文[22]的方法用HPLC測(cè)定果糖、葡萄糖、蔗糖和淀粉的含量。

8)基因表達(dá)分析：總RNA采用Trizol試劑盒參考說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取，經(jīng)Nanodrop 2000檢測(cè)濃度和純度以及用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性后，根據(jù)Fermentas cDNA synthesis 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。參考TaKara 公司的SYBR System操作手冊(cè)，采用ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。基因特異性引物序列參考表1進(jìn)行合成[23]，以YT521-B基因?yàn)閮?nèi)參。根據(jù)得到的Ct值，利用2-ΔΔCT法，分別計(jì)算目標(biāo)基因在不同處理下的相對(duì)表達(dá)量。

表1 試驗(yàn)中所用基因及其引物序列Table 1 Genes and primers used in the experiment

SPS: 蔗糖磷酸合成酶Sucrose phosphate synthase；SS: 蔗糖合成酶Sucrose synthetase； INV: 轉(zhuǎn)化酶Invertase; invertin；YT521-B: 看家基因House-keeping gene；F: 正面Forward; R: 反向Reverse.

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

圖1 外源GABA對(duì)高溫脅迫下黑麥草冠層高度的影響Fig.1 Effect of exogenous GABA on the canopy height in perennial ryegrass under heat stress 圖中豎線表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，不同小寫字母表示在同一處理時(shí)間內(nèi)不同處理間差異顯著(P<0.05)，下同。Vertical bars indicate means±standard error (SE). Different lowercase letters indicate significant difference among treatment at a given day of treatment, the same below.

采用SAS 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，然后采用Duncan’s多重比較檢測(cè)處理間的差異顯著性(P<0.05)，采用Sigmaplot 12.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 GABA對(duì)高溫脅迫下黑麥草冠層高度的影響

由圖1可以看出，高溫脅迫下黑麥草生長(zhǎng)顯著受到抑制，冠層高度在高溫處理的第5 和15天時(shí)比對(duì)照低,分別為27%和38%。但是外源施用GABA顯著緩解了高溫脅迫對(duì)黑麥草生長(zhǎng)的抑制，在高溫處理第5 和15天時(shí)施用GABA的處理冠層高度比未施GABA的處理分別了提高了16%和20%。

2.2 GABA對(duì)高溫脅迫下黑麥草葉片電導(dǎo)率的影響

由圖2可知，在高溫脅迫下黑麥草葉片的相對(duì)電導(dǎo)率顯著升高，在脅迫的第5和15天時(shí)電導(dǎo)率分別提高了31%和78%；但是高溫脅迫下外源施用GABA后，黑麥草葉片電導(dǎo)率顯著降低，與高溫脅迫下未施用GABA的處理相比，在高溫處理的第5和15 天分別下降了30%和28%。

2.3 GABA對(duì)高溫脅迫下黑麥草葉綠素含量的影響

從圖3可以看出，高溫脅迫下黑麥草葉片的葉綠素含量顯著下降，與對(duì)照相比，在脅迫處理的第5和15天時(shí)的含量分別下降了9%和37%；外源施用GABA后則顯著緩解了因高溫而造成的葉綠素含量的下降，在高溫處理后的第5和15天，施用外源GABA的處理比未施GABA的處理葉綠素含量則分別提高了9%和23%。

2.4 GABA對(duì)高溫脅迫下黑麥草葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

從表2可以看出，正常溫度下施用外源GABA短期內(nèi)(5 d)提高了黑麥草的ETR，但對(duì)Fv/Fm、ΦPSⅡ、qP和NPQ無(wú)顯著影響，但較長(zhǎng)時(shí)間(15 d)后對(duì)ETR、Fv/Fm、ΦPSⅡ、qP和NPQ均無(wú)顯著影響。短時(shí)間高溫(5 d)對(duì)黑麥草葉片的Fv/Fm無(wú)顯著影響，較長(zhǎng)時(shí)間高溫(15 d)下黑麥草Fv/Fm顯著下降；高溫脅迫下黑麥草葉片的ETR、qP和ΦPSⅡ顯著降低，而NPQ顯著升高；但高溫脅迫下施用外源GABA不論是在短期(5 d)還是較長(zhǎng)時(shí)間(15 d)內(nèi)均顯著提高了黑麥草葉片的Fv/Fm、ETR、qP和ΦPSⅡ，而降低了NPQ；與高溫下未施用GABA相比，在處理5 d時(shí)，ETR、qP和ΦPSⅡ分別提高了26%，9%和13%，而NPQ則降低了25%；但到高溫處理15 d，F(xiàn)v/Fm、ETR、qP和ΦPSⅡ則分別提高了17%，50%，21%和18%，而NPQ則降低了32%。

圖2 外源GABA對(duì)高溫脅迫下黑麥草葉片電導(dǎo)率的影響Fig.2 Effect of exogenous GABA on the leaf electrolyte leakage in perennial ryegrass under heat stress

圖3 外源GABA對(duì)高溫脅迫下黑麥草葉綠素含量的影響Fig.3 Effect of exogenous GABA on the leaf chlorophyll content in perennial ryegrass under heat stress

注：同列中不同小寫字母表示同一處理時(shí)間不同處理間在P<0.05水平上差異顯著，下同。

Note: Means in a column marked with different lower-case letters indicate significant difference among treatment at a given day of treatment atP<0.05 level, the same below.

2.5 GABA對(duì)高溫脅迫下黑麥草葉片光合參數(shù)的影響

由表3可知，施用外源GABA對(duì)正常溫度下黑麥草的Pn、Gs、Ci和Tr均無(wú)顯著影響。高溫脅迫下除了較長(zhǎng)時(shí)間(15 d)處理下Ci外，黑麥草葉片的Pn、Gs和Tr顯著降低，在處理5 d時(shí)，分別降至對(duì)照的64%，52%和67%，到處理15 d時(shí)，則分別僅為對(duì)照的35%，37%和55%；高溫下黑麥草葉片的Ci在短期內(nèi)(5 d)顯著降低，而較長(zhǎng)時(shí)間(15 d)處理下則與對(duì)照沒(méi)有顯著性差異。高溫脅迫下施用外源GABA顯著提高了黑麥草葉片的Pn、Gs和Tr，與未施GABA的處理相比，在5 d時(shí)分別提高了31%，45%和18%，在處理15 d時(shí)則分別提高了73%，45%和34%；與高溫脅迫下未施GABA的處理相比，施用外源GABA在5 d時(shí)顯著提高了黑麥草葉片的Ci，而在處理15 d時(shí)則顯著降低了葉片Ci。

表3 外源GABA對(duì)高溫脅迫下黑麥草葉片光合作用的影響Table 3 Effect of exogenous GABA on leaf photosynthesis in perennial ryegrass under heat stress

由表4可知，在短期(5 d)處理?xiàng)l件下，高溫脅迫和施用外源GABA對(duì)黑麥草葉片的CE、Vcmax和Jmax均無(wú)顯著影響；處理較長(zhǎng)時(shí)間(15 d)時(shí)，高溫脅迫顯著降低了黑麥草葉片的CE、Vcmax和Jmax，但是施用外源GABA則顯著緩解了高溫條件下CE、Vcmax和Jmax的下降，比未施用GABA的處理分別提高了70%，31%和23%。高溫脅迫顯著提高了黑麥草葉片的Ls和CP，降低了Amax，但是施用外源GABA則顯著緩解了因高溫脅迫而造成Amax的下降以及Ls和CP的升高。

表4 外源GABA對(duì)高溫脅迫下黑麥草葉片光合特性的影響Table 4 Effect of exogenous GABA on leaf photosynthetic traits in perennial ryegrass under heat stress

2.6 GABA對(duì)高溫脅迫下黑麥草葉片碳水化合物含量的影響

從表5可以看出，在短期(5 d)處理?xiàng)l件下，高溫脅迫和施用外源GABA對(duì)黑麥草葉片的果糖含量無(wú)顯著影響；處理較長(zhǎng)時(shí)間(15 d)時(shí)，高溫脅迫顯著降低了黑麥草葉片的果糖含量，但是施用外源GABA則顯著緩解了高溫條件下果糖含量的下降。高溫脅迫處理顯著降低了黑麥草葉片的葡萄糖、蔗糖和淀粉含量，在高溫處理5 d時(shí)，分別降低至對(duì)照的76%，79%和73%，在處理15 d時(shí)則分別降低至對(duì)照的66%，64%和53%；高溫處理下施用外源GABA顯著提高了黑麥草葉片葡萄糖、蔗糖和淀粉的含量，與未施GABA處理相比，在處理5 d時(shí)，分別提高了17%，18%和19%，在處理15 d時(shí)，則分別提高了24%，22%和40%。

表5 外源GABA對(duì)高溫脅迫下黑麥草葉片碳水化合物含量的影響Table 5 Effect of exogenous GABA on leaf carbohydrates content in perennial ryegrass under heat stress (mg·g-1 DW)

2.7 GABA對(duì)高溫脅迫下黑麥草葉片糖代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響

圖4 外源GABA對(duì)高溫脅迫下黑麥草葉片蔗糖磷酸合成酶基因表達(dá)的影響Fig.4 Effect of exogenous GABA on the expression level of SPS genes in leaves of perennial ryegrass under heat stress

由圖4和圖5可知，高溫誘導(dǎo)了黑麥草葉片蔗糖磷酸合成酶基因(SPS)和蔗糖合成酶基因(SS)的上調(diào)表達(dá)，并且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)水平呈顯著上升趨勢(shì)，在高溫處理24 h時(shí)達(dá)到頂峰，隨后呈緩慢下降趨勢(shì)，在處理15 d時(shí)表達(dá)量降至對(duì)照水平；在正常生長(zhǎng)條件下，外源施用GABA對(duì)SPS和SS基因的表達(dá)水平?jīng)]有顯著影響；但在高溫脅迫條件下，與未施用GABA的處理相比，外源施用GABA則顯著誘導(dǎo)和提高了黑麥草葉片SPS和SS基因的表達(dá)水平，在15 d的處理時(shí)間內(nèi)均顯著高于正常對(duì)照和高溫下未施用GABA的處理。

圖5 外源GABA對(duì)高溫脅迫下黑麥草葉片蔗糖合成酶基因表達(dá)的影響Fig.5 Effect of exogenous GABA on the expression level of SS genes in leaves of perennial ryegrass under heat stress

圖6 外源GABA對(duì)高溫脅迫下黑麥草葉片轉(zhuǎn)化酶基因表達(dá)的影響Fig.6 Effect of exogenous GABA on the expression level of INV gene in leaves of perennial ryegrass under heat stress

由圖6可以看出，高溫脅迫誘導(dǎo)了黑麥草葉片轉(zhuǎn)化酶基因(INV)的上調(diào)表達(dá)，且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量上升，在處理24 h到達(dá)頂峰，隨后下降，在處理5 d以后則降至對(duì)照水平。在正常生長(zhǎng)條件下，外源施用GABA對(duì)INV基因的表達(dá)水平?jīng)]有顯著影響；在高溫脅迫條件下，與未施用GABA的處理相比，外源施用GABA則更顯著地提高了黑麥草葉片INV基因的表達(dá)水平，除了在處理4 h以外，在15 d的處理時(shí)間內(nèi)均顯著高于正常對(duì)照和高溫下未施用GABA的處理。

3 討論

3.1 外源GABA緩解了高溫脅迫對(duì)黑麥草的傷害

高溫常造成冷季型草坪草生長(zhǎng)發(fā)育受阻、草坪質(zhì)量下降、細(xì)胞膜受傷害、葉片枯黃衰老等變化，而植物的生長(zhǎng)速率和電導(dǎo)率常作為衡量植物受高溫脅迫損害程度和抗逆性大小的重要指標(biāo)[24]。GABA可以作為外源物質(zhì)參與到植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及逆境調(diào)控等一系列的生理過(guò)程和抗逆能力[25]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，高溫脅迫下黑麥草的生長(zhǎng)顯著受到抑制，葉片電導(dǎo)率升高，但是施用外源GABA后黑麥草的冠層高度增加、細(xì)胞膜透性下降，這表明外源GABA對(duì)黑麥草在高溫脅迫下的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，施用外源GABA可以顯著提高黑麥草的耐高溫能力，這與在冷季型草坪草匍匐剪股穎中的研究結(jié)果相一致[17]。

3.2 外源GABA減輕了高溫對(duì)黑麥草光合器官的損傷和光抑制，提高了光合碳同化能力

光合作用是植物對(duì)外界環(huán)境因子最敏感的生理過(guò)程之一，在一定程度上可反映植株對(duì)逆境脅迫的抗性[3]。高溫脅迫下植物葉片光合作用的降低既受氣孔因素的限制，同時(shí)也受非氣孔因素的影響[4]。根據(jù)Farquhar等[26]觀點(diǎn)，氣孔因素引起的Pn降低表現(xiàn)為Gs和Ci都降低，而非氣孔因素引起Pn降低則伴隨著Gs的下降而Ci升高。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在高溫脅迫5 d時(shí)，黑麥草葉片的Pn隨著Gs和Ci下降而降低，且CE、Vcmax和Jmax無(wú)顯著性變化，但在高溫脅迫15 d時(shí)Pn和Gs顯著下降，而Ci則沒(méi)有下降甚至升高，并且CE、Vcmax和Jmax均顯著降低，表明在短時(shí)間高溫或輕度高溫脅迫時(shí)，Pn的下降主要受氣孔導(dǎo)度的下降等氣孔因素的影響，而在較長(zhǎng)時(shí)間的高溫脅迫或重度高溫脅迫下光合作用的下降主要是受CE、Vcmax和Jmax等非氣孔因素的限制，這與前人的研究結(jié)果基本一致[27-28]。已有研究證明外源噴施GABA能調(diào)節(jié)鹽堿等逆境條件下植物葉片的光合性能[29]。本研究結(jié)果顯示，高溫脅迫下施用外源GABA后黑麥草葉片的Pn顯著提高，緩解了高溫對(duì)Gs和Tr的抑制，減少了Ci的積累，此外還顯著提高了Amax、CE、Vcmax和Jmax，表明外源GABA可通過(guò)緩解高溫對(duì)葉片氣孔和非氣孔因素的限制，從而改善了黑麥草葉片的光合特性，提高了植株的耐熱性，這與黃娟等[30]在黃瓜上的研究結(jié)果一致。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)對(duì)環(huán)境逆境脅迫反應(yīng)敏感，可反映環(huán)境因子對(duì)植物光合生理狀況的影響[31]。因此，對(duì)葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)量成為評(píng)價(jià)逆境脅迫對(duì)植物光合器官損傷的重要指標(biāo)[32]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，高溫脅迫下黑麥草葉片的Fv/Fm、qP、ETR和ΦPSⅡ顯著下降，而NPQ顯著升高，表明在高溫脅迫下黑麥草葉片的光系統(tǒng)Ⅱ活性中心受到了傷害，光能轉(zhuǎn)換效率和電子傳遞能力下降，光能利用率降低，光能過(guò)剩加劇了對(duì)葉片光合的抑制和光合器官的破壞，從而造成了葉綠素?zé)晒鈪?shù)的下降，這與在冷季型草坪草高羊茅(Testucaarundinacea)中的研究相一致[27]。維持植物光合器官結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，提高葉片光合能力對(duì)抵抗逆境脅迫至關(guān)重要。前人研究表明[11]，施用GABA可提高低氧脅迫下甜瓜葉片和鹽脅迫下番茄葉片的光合能力。在本研究中，外源施用GABA顯著提高了高溫脅迫下黑麥草葉片的Fv/Fm、qP、ETR和ΦPSⅡ，降低了NPQ，表明外源GABA可提高光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心的光能轉(zhuǎn)換效率、潛在活性和開(kāi)放比例，同時(shí)還增強(qiáng)了過(guò)剩光能的耗散，有利于減輕高溫脅迫對(duì)光合的抑制，增強(qiáng)光合系統(tǒng)反應(yīng)中心的穩(wěn)定性，從而減輕高溫脅迫對(duì)黑麥草葉片光合器官造成的損傷，提高了高溫脅迫下黑麥草的光合能力和耐熱性。

3.3 外源GABA提高了高溫脅迫下黑麥草葉片碳水化合物代謝水平

不同的植物種類對(duì)溫度的敏感性和耐受性不同，一定范圍內(nèi)的高溫可以促進(jìn)植物體內(nèi)的生理生化反應(yīng)，從而促進(jìn)光合和碳水化合物代謝，而過(guò)高的溫度便可降低光合作用，增強(qiáng)了呼吸作用而消耗了更多的碳水化合物等能量物質(zhì)使其含量顯著降低[33]。逆境條件下可溶性糖(包括蔗糖、果糖、葡萄糖等)的增加能夠增加細(xì)胞汁液濃度，有利于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，從而能夠維持逆境下細(xì)胞內(nèi)正常的生理代謝而提高抗逆性[34]。前期的研究結(jié)果表明[18]，高溫脅迫下可溶性糖和淀粉含量顯著下降，并且其含量的高低與黑麥草的耐熱能力密切相關(guān)。在馬鈴薯(Solanumtuberosum)中發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫下其葉片蔗糖含量升高，淀粉含量減少，而葡萄糖含量無(wú)顯著變化，這可能與蔗糖合成酶(SS)和轉(zhuǎn)化酶(INV)酶活性的提高有關(guān)[7, 35]，而在甘蔗(Saccharumofficinarum)中卻發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫下其葉片的糖代謝關(guān)鍵酶(SS、SPS、INV)活性都降低，蔗糖和淀粉含量減少[35]。本研究結(jié)果顯示，短期的高溫脅迫下(5 d)黑麥草葉片的SPS、SS和INV酶基因的表達(dá)量顯著升高，而在較長(zhǎng)時(shí)間(15 d)的高溫脅迫下表達(dá)水平顯著下降，同時(shí)葉片的葡萄糖、果糖、蔗糖和淀粉等碳水化合物含量也顯著下降，表明高溫對(duì)黑麥草的碳水化合物代謝造成了影響，致使光合產(chǎn)物減少，代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)量降低，促進(jìn)了呼吸作用使淀粉分解而含量下降。但是，高溫脅迫下施用外源GABA，顯著提高了黑麥草葉片SPS、SS和INV酶基因的表達(dá)水平和碳水化合物(蔗糖、果糖、葡萄糖、淀粉)含量，表明外源GABA可通過(guò)緩解高溫脅迫下光合作用的下降和提高碳水化合物代謝關(guān)鍵酶基因的表達(dá)水平和光合產(chǎn)物，從而提高了碳水化合物代謝水平和增強(qiáng)了黑麥草的耐高溫能力。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)高溫條件下施用外源GABA對(duì)多年生黑麥草的生長(zhǎng)、細(xì)胞膜透性、光合色素含量、光合及葉綠素?zé)晒鈪?shù)、碳水化合物含量及其代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)的分析表明，高溫脅迫下施用外源GABA，F(xiàn)v/Fm、ETR、qP和ΦPSⅡ提高了13%～50%，而NPQ則降低了25%～32%，CE、Vcmax和Jmax分別提高了70%，31%和23%，降低了葉片氣孔和非氣孔限制值，增強(qiáng)了糖代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)，碳水合化合物含量提高了17%～40%，緩解了高溫對(duì)葉片PSⅡ反應(yīng)中心的抑制，增強(qiáng)了光合能力，提高了碳水化合物含量，因而有效地提高了黑麥草的耐高溫能力。