孫艷芬 張星瑩 李甜甜 李連芹

在我國，由于婚育年齡推遲、生活方式改變、環(huán)境污染加劇等因素，早期自然流產(chǎn)（發(fā)生于妊娠12周之前的流產(chǎn)）發(fā)生率呈上升趨勢(shì)。發(fā)生早期自然流產(chǎn)的原因很多，包括胚胎因素、母體因素、父方因素、環(huán)境因素（包括局部環(huán)境如子宮）[1]等。無論是母體因素、父方因素，還是環(huán)境因素所導(dǎo)致的自然流產(chǎn)，其中有一個(gè)環(huán)節(jié)與氧化應(yīng)激狀態(tài)有關(guān)。研究表明自然流產(chǎn)患者的絨毛或血清均呈氧化應(yīng)激狀態(tài)[2-3]。而生物體內(nèi)存在多種抗氧化系統(tǒng)，以應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激狀態(tài)。其中過氧化物還原酶（peroxiredoxin，PRX）利用其自身的半胱氨酸殘基，將過氧化氫還原成水。PRX3作為該家族的成員之一，主要存在于線粒體中[4]，與硫氧還蛋白2、硫氧還蛋白還原酶2構(gòu)成線粒體內(nèi)的第一道抗氧化防線[5]。筆者團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，早孕婦女絨毛組織和血清中PRX3表達(dá)水平均隨著孕周的增加而不斷升高，說明PRX3在孕早期即開始發(fā)揮抗氧化作用[6]。但是，目前尚不清楚PRX3與妊娠早期自然流產(chǎn)發(fā)生的關(guān)系。本研究通過比較胚胎停育患者與非胚胎停育患者絨毛及蛻膜組織中PRX3的表達(dá)變化，進(jìn)一步探索PRX3在妊娠中的抗氧化功能，并從新的角度探討胚胎停育的發(fā)病機(jī)制。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2017年12月至2018年5月因胚胎停育實(shí)施人工流產(chǎn)的患者60例作為胚胎停育組，同期因意外懷孕要求終止妊娠的非胚胎停育患者60例作為對(duì)照組。人工流產(chǎn)術(shù)后，均無菌操作留取兩組患者的絨毛及蛻膜組織。兩組患者年齡、BMI、孕周、胎芽大小比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。本研究經(jīng)濱州醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和患者知情同意。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 主要試劑和儀器 實(shí)時(shí)定量PCR SYB Green試劑盒購自日本TaKaRa公司，第一抗體兔抗PRX3多克隆抗體、兔抗β-actin多克隆抗體、第二抗體生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG購自英國Abcam公司，硝酸纖維素膜購自美國Millipore Corporation公司，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自英國Amersham公司。Gel-Pro Analyzer購自美國Media Cybernetics公司，提取RNA用Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，蛋白測(cè)定試劑盒、PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad iCycler）購自美國 Bio-Rad公司，TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 絨毛及蛻膜組織中PRX3 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)采用實(shí)時(shí)定量PCR法。將絨毛及蛻膜組織洗凈后剪碎，采用Trizol法提取絨毛及蛻膜組織總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)條件：95℃ 3min，（95℃ 15s，60℃ 60s）×40 個(gè)循環(huán)；反應(yīng)體積為 50μl。以β-actin為內(nèi)參。PRX3上游引物：5′-CAGCCGTTGTCAATGGAGAG-3′， 下 游 引 物 ：5′-TCACATCGTGAAATTCGTTAGC-3′；β -actin 上 游 引 物 ：5′-CGGCCAGGTCATCACCATTG-3′，下游引物：5′-CCGCCAGACAGCACTGTGTTG-3′。相對(duì)表達(dá)量以公式 2-ΔCt×106計(jì)算，其中 Ct=（CtPRX3-Ctβ-actin）。

1.3.2 絨毛及蛻膜組織中PRX3蛋白表達(dá)水平檢測(cè)采用Western blot法。將絨毛及蛻膜組織剪碎，勻漿器勻漿后加入適量裂解液裂解約30min，在4℃條件下以12 000rpm離心5min，吸取上清液分裝于0.5ml離心管中。利用蛋白測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度后，取等量的上清液樣品用15%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上。第一抗體稀釋濃度為1∶2 000，第二抗體稀釋濃度為1∶1 000，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色。將膠片放入機(jī)器進(jìn)行掃描，利用Gel-Pro Analyzer分析判讀目標(biāo)帶的分子量和積分光密度值（integrated optical density，IOD），通過比較目標(biāo)蛋白PRX3與內(nèi)參蛋白β-actin的IOD值，獲知PRX3的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者絨毛及蛻膜組織中PRX3 mRNA表達(dá)水平比較 胚胎停育組患者絨毛及蛻膜組織中PRX3 mRNA表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表 2。

表2 兩組患者絨毛及蛻膜組織中PRX3 mRNA表達(dá)水平比較

2.2 兩組患者絨毛及蛻膜組織中PRX3蛋白表達(dá)水平比較 胚胎停育組患者絨毛及蛻膜組織中PRX3蛋白表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表 3。

表3 兩組患者絨毛及蛻膜組織中PRX3蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

本研究結(jié)果表明，胚胎停育患者絨毛及蛻膜組織中PRX3 mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高，說明在胚胎停育患者絨毛及蛻膜組織中存在氧化應(yīng)激狀態(tài)，同時(shí)也說明PRX3在應(yīng)對(duì)胚胎停育患者的氧化應(yīng)激狀態(tài)方面，發(fā)揮積極作用。

PRX3作為線粒體內(nèi)的抗氧化蛋白，可以清除線粒體內(nèi)90%的過氧化氫，在維持線粒體的功能穩(wěn)定方面發(fā)揮重要作用[5]。本研究發(fā)現(xiàn)胚胎停育患者絨毛組織中PRX3 mRNA和蛋白表達(dá)水平均高于同期正常妊娠的絨毛組織。推測(cè)胚胎停育患者絨毛組織所產(chǎn)生的活性氧自由基過多，超出了機(jī)體清除氧化物的能力，因而PRX3的表達(dá)反應(yīng)性上調(diào)，以緩解氧化應(yīng)激狀態(tài)。這一結(jié)果表明在應(yīng)對(duì)胚胎停育患者的氧化應(yīng)激狀態(tài)方面，PRX3的作用同樣重要。如前所述，引起自然流產(chǎn)的因素包括胚胎因素、母體因素、父方因素、環(huán)境因素等。在發(fā)病機(jī)制方面，其中的作用環(huán)節(jié)與氧化應(yīng)激狀態(tài)有關(guān)[7-8]。氧化應(yīng)激狀態(tài)通過影響孕囊著床、胚胎和胎盤發(fā)育、胎盤血管生成與血流分布等，成為自然流產(chǎn)的發(fā)病機(jī)制之一[9-10]。關(guān)于氧化應(yīng)激發(fā)生的原因，日本學(xué)者Ishii等[11]利用轉(zhuǎn)基因小鼠所做的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)線粒體的呼吸鏈發(fā)生異常時(shí)，會(huì)出現(xiàn)一種慢性的氧化應(yīng)激狀態(tài)，進(jìn)而影響小鼠的生殖功能和妊娠結(jié)局，包括不孕不育、自然流產(chǎn)、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、甚至母體死亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這種轉(zhuǎn)基因小鼠的胎盤血管發(fā)育不良，導(dǎo)致胎盤的炎癥反應(yīng)和胚胎的血管生成異常。伊朗學(xué)者Gharesi-Fard等[12-13]報(bào)道，在患有自身免疫性疾病的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者中，其胎盤和血清中均檢測(cè)到抗PRX3自身抗體，說明PRX3參與胚胎著床和胎盤形成。本研究中，胚胎停育患者蛻膜組織中PRX3的表達(dá)同樣升高，說明該類患者的宮腔內(nèi)也存在氧化應(yīng)激狀態(tài)。伊朗學(xué)者Rahiminejad等[14]對(duì)100例接受體外受精-胚胎移植的患者進(jìn)行了研究，在胚胎移植前吸取子宮內(nèi)膜分泌物（宮腔液）1～2ml，檢測(cè)其中的氧化應(yīng)激狀態(tài)，包括超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性、脂質(zhì)過氧化物水平、硫醇基化合物水平以及總的抗氧化能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)28例臨床妊娠患者宮腔液中抗氧化酶水平或者總的抗氧化能力明顯高于移植失敗或早期流產(chǎn)患者，說明子宮內(nèi)膜的抗氧化酶活性對(duì)于維持妊娠非常重要。Liu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在早期自然流產(chǎn)的蛻膜細(xì)胞中，存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)急和氧化應(yīng)激狀態(tài)，并出現(xiàn)細(xì)胞凋亡征象，表現(xiàn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹，Caspase-4和Caspase-12激活等，說明宮腔內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)與自然流產(chǎn)的發(fā)生密切相關(guān)。

綜上所述，胚胎停育患者存在氧化應(yīng)激狀態(tài)，PRX3作為線粒體內(nèi)重要的抗氧化蛋白，在絨毛及蛻膜組織中的表達(dá)反應(yīng)性升高，對(duì)于維持妊娠具有重要作用。換而言之，PRX3可能不是自然流產(chǎn)的致病因素，而是抑制自然流產(chǎn)進(jìn)展的利好因素。對(duì)先兆流產(chǎn)患者補(bǔ)充抗氧化劑，可能有利于改善妊娠結(jié)局。關(guān)于PRX3在自然流產(chǎn)中的作用機(jī)制，尚需要進(jìn)一步研究。