陳瑩 薛明新 呂建軍 周帥 宋石龍

1南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院（南京210000）；2南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院（南京210000）；3南京中醫(yī)藥大學沭陽附屬醫(yī)院（江蘇沭陽223600）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種廣泛流行且進展緩慢的退行性疾病，多累及膝、髖負重活動關(guān)節(jié)，病理基礎(chǔ)以關(guān)節(jié)軟骨漸進性退化，伴有骨贅生成、漸進性關(guān)節(jié)功能喪失和軟骨下骨重塑為特征，屬于中醫(yī)“骨痹”范疇［1-2］。膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）男性發(fā)病率為13.2%，女性發(fā)病率為28.3%，已經(jīng)成為最常見和最重要的關(guān)節(jié)疾病，同時據(jù)流行病學調(diào)查統(tǒng)計，膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率隨年齡增高而增高，40歲以下人群的發(fā)病率約為5%，60～75歲人群的發(fā)病率高于50%，50 歲以上骨關(guān)節(jié)炎患者的長期致殘率名列第二［3］。有研究［4］表明我國目前癥狀性膝骨關(guān)節(jié)炎的患病率高達為8.1%。目前常見的治療藥物有非甾體抗炎藥、IL-1 抑制劑等［5］，其緩解疼痛效果好，但其副作用卻卻不可小覷，有報道［6］稱美國每年因非甾體消炎藥導致死亡和住院總?cè)藬?shù)超過16 500人。近年來機制研究表明，白介素1（IL-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）與骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨的退變關(guān)系密切。羌活桂枝膏是筆者導師多年治療膝骨關(guān)節(jié)炎的經(jīng)驗總結(jié)而成，具有祛風寒，除濕邪，溫經(jīng)脈的功效。本實驗通過免疫組化半定量分析檢測羌活桂枝膏聯(lián)合推拿手法對兔膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜IL-1 及MMP-9 的表達，進一步探討羌活桂枝膏聯(lián)合推拿手法的作用機理，為該方進行新藥開發(fā)研制、走向市場提供一定的實驗參數(shù)，同時為羌活桂枝膏聯(lián)合推拿手法治療KOA 提供實驗支持。具體報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性新西蘭大白兔（平均兔齡為8 個月，平均體質(zhì)量2 kg）40 只，南京江寧區(qū)青龍山動物繁殖廠提供，符合衛(wèi)生部一級實驗動物標準（動物許可證號scxk（蘇）2012-0008）。實驗前詞養(yǎng)1 周，觀察無明顯全身疾病及其他異常后開始實驗。大白兔均飼養(yǎng)于室溫22～25 ℃，12/12 h 晝夜節(jié)律，自由進食與飲水。

1.2 實驗藥物 羌活桂枝膏，江蘇省中醫(yī)院制劑部制備。藥物組成：羌活、桂枝。桂枝、羌活飲片均購自于江蘇省中醫(yī)院藥學部，經(jīng)檢驗符合中華人民共和國藥典2015 版一部之要求。

1.3 主要試劑及儀器設(shè)備 木瓜蛋白酶（美國SIGMA），ELISA試劑盒（美國R&D），NO測定試劑盒（中國A012），自動脫水機（中國JJ-12J），石蠟切片機（中國RM2016），攤片烤片機（中國KD-P），組織包埋中心（中國JB-P5），光學顯微鏡（日本Nikon Eclipse CI），電熱恒溫培養(yǎng)箱（中國HPX-9052MBE）圖像采集系統(tǒng)（日本Nikon DS-U3），離心機（中國京立LD25-2），酶標儀（瑞士TECAN），免疫組化試劑盒（中國MaxVisionTM），DAB顯色試劑（中國MaxVisionTM）。

1.4 研究設(shè)計

1.4.1 動物模型 40 只兔按隨機數(shù)字表法分為分為正常對照組、模型組、推拿組、羌活桂枝膏貼敷、羌活桂枝膏聯(lián)合推拿組5 組，每組8 只。分別將0.5 mL 的2%木瓜蛋白酶水溶液于實驗開始第1、4、7 天注入兔右后肢膝關(guān)節(jié)制備家兔KOA 模型。造模結(jié)束1 周后，檢驗?zāi)Ｐ徒M造模成功與否，造模成功標準：兔膝關(guān)節(jié)造模側(cè)出現(xiàn)腫脹，屈伸功能障礙為造模成功。

1.4.2 干預方法 正常對照組正常飼養(yǎng)，不做任何干預；模型組造模后正常飼養(yǎng)，固定右膝關(guān)節(jié)3 h；羌活桂枝膏貼敷組將羌活桂枝膏外敷于兔右膝關(guān)節(jié)，厚度約2 mm，面積3 cm × 5 cm，關(guān)節(jié)固定3 h，每日1 次；推拿組揉兔右膝關(guān)節(jié)髕骨周圍，點按兔右膝委中、陽陵泉、曲泉、犢鼻、足三里等穴位共約5 min，最后擦兔右膝關(guān)節(jié)，透熱為度，共計10 min，手法刺激以局部皮膚微紅為度；羌活桂枝膏聯(lián)合推拿治療組先將將羌活桂枝膏均勻涂抹于兔右膝關(guān)節(jié)周圍，使藥膏充分透皮吸收；揉兔右膝關(guān)節(jié)髕骨周圍，點按兔右膝委中、陽陵泉、曲泉、犢鼻、足三里等穴位共約5 min，最后擦兔右膝關(guān)節(jié)，透熱為度，共計10 min，手法刺激以局部皮膚微紅為度。

1.4.3 標本采集與預處理 滑膜采集實驗結(jié)束前禁食禁水12 h，于治療結(jié)束后的第2 天，大體觀察各組實驗動物的膝關(guān)節(jié)屈伸活動度及關(guān)節(jié)腫脹情況。留取的右膝關(guān)節(jié)，以內(nèi)側(cè)切口緩慢打開膝關(guān)節(jié)腔行大體觀察，切取右膝關(guān)節(jié)滑膜，通過HE 染色方法觀察病理組織；使用IHC 法測定IL-1 及MMP-9 含量。

1.4.4 指標檢測與方法 造模成功后觀察各組兔的精神狀態(tài)、體毛色澤、飲食等，對兔右膝關(guān)節(jié)屈伸功能障礙程度及腫脹程度等情況進行評估。對滑膜組織行免疫組化IL-1 及MMP-9 半定量分析。

表1 桂枝羌活膏劑的性狀檢測結(jié)果Tab.1 Characters of Qiang Huo Guizhi ointment

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。實驗結(jié)果以（）表示，符合正態(tài)性與方差齊性檢驗采用單因素方差分析，多組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 動物狀態(tài)觀察 從實驗動物膝關(guān)節(jié)屈伸功能障礙程度及腫脹程度大體觀察。膝關(guān)節(jié)屈伸功能障礙程度方面：正常對照組雙側(cè)膝關(guān)節(jié)屈伸活動度正常；羌活桂枝膏聯(lián)合推拿組右側(cè)膝關(guān)節(jié)屈伸稍受限，但活動度優(yōu)于推拿組、羌活桂枝膏貼敷組及模型組；推拿組和羌活桂枝膏貼敷組右側(cè)膝關(guān)節(jié)屈伸活動度相仿但優(yōu)于模型組。膝關(guān)節(jié)腫脹程度方面：正常對照組雙側(cè)膝關(guān)節(jié)無腫脹；羌活桂枝膏聯(lián)合推拿組右側(cè)膝關(guān)節(jié)腫脹不明顯，腫脹程度輕于推拿組、羌活桂枝膏貼敷組及模型組；推拿組和羌活桂枝膏貼敷組右側(cè)膝關(guān)節(jié)腫脹程度相仿但優(yōu)于模型組。

2.2 IL-1 半定量及免疫組化分析 見表2。IL-1在模型組、羌活桂枝膏貼敷組、推拿組的表達均較正常對照組升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），在正常對照組與羌活桂枝膏聯(lián)合推拿組表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。IL-1 在羌活桂枝膏貼敷組、推拿組、羌活桂枝膏聯(lián)合推拿組表達較模型組均有所下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。IL-1 在羌活桂枝膏聯(lián)合推拿組相較羌活桂枝膏貼敷表達低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；在羌活桂枝膏貼敷組和推拿組表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。IL-1 在羌活桂枝膏聯(lián)合推拿組治療后的膝OA 兔滑膜與正常對照組兔滑膜表達水平相似，提示羌活桂枝膏聯(lián)合推拿治療膝OA兔療效顯著，對比單一推拿組及羌活桂枝膏貼敷療效更佳。見圖1。

2.3 MMP-9 半定量及免疫組化分析 見表3。MMP-9 在模型組、羌活桂枝膏貼敷組、推拿組、羌活桂枝膏聯(lián)合推拿組的表達均較正常對照組升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；MMP-9 在羌活桂枝膏貼敷組、推拿組、羌活桂枝膏聯(lián)合推拿組表達較模型組均有所下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。MMP-9 在羌活桂枝膏聯(lián)合推拿組與推拿組表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；在羌活桂枝膏聯(lián)合推拿組表達較羌活桂枝膏貼敷組低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。綜上可見，MMP-9 在羌活桂枝膏聯(lián)合推拿治療后的膝OA 兔滑膜與模型組差異顯著，提示羌活桂枝膏聯(lián)合推拿治療兔膝OA 有效，同時羌活桂枝膏貼敷組與推拿療效相似。見圖2。

表2 膝OA 兔免疫組化IL-1 半定量分析Tab.2 Semi-quantitative analysis of IL-1 in knee OA rabbits by immunohistochemistry ±s

表2 膝OA 兔免疫組化IL-1 半定量分析Tab.2 Semi-quantitative analysis of IL-1 in knee OA rabbits by immunohistochemistry ±s

注：與模型組相比，aP ＜0.05；與羌活桂膏貼敷組相比，bP ＜0.05

組別正常組模型組羌活桂枝膏聯(lián)合推拿組羌活桂枝膏貼敷組推拿組例數(shù)8 8 8 8 8 IL-1 平均光密度43.985 1±9.927 9 122.132 5±10.081 7 52.468 7±4.142ab 77.170 1±11.407 3a 69.428 4±10.703 8a

3 討論

3.1 祖國醫(yī)學 骨痹之名始見于《內(nèi)經(jīng)》，《素問·痹論》有云：“風寒濕三氣雜至，合而為痹。……以冬遇此者為骨痹?！保鹅`樞·氣穴論》記載：“積寒留舍，榮衛(wèi)不居，卷肉縮筋，肋肘不得伸，內(nèi)為骨痹。”，《濟生方》曰：“骨痹之為病，應(yīng)乎腎，其狀骨重不可舉，不遂而痛且脹?！笨梢姽潜圆C為風、寒、濕邪困阻肌肉關(guān)節(jié)經(jīng)脈，同時腎主骨，骨痹的發(fā)生，與腎關(guān)系密切。羌活桂枝膏是筆者導師憑借多年治療KOA 的經(jīng)驗總結(jié)而成，組成為羌活及桂枝，羌活為傘形科植物羌活（Notopterygium incisum Ting ex H. T. Chang）的干燥根莖及根，歸腎、膀胱經(jīng)的功效，桂枝辛甘溫，有溫通經(jīng)脈，助陽化氣之功效。桂枝來源于樟科植物肉桂（Cinnamomun cassia Presl）的干燥嫩枝。其辛、溫、甘，歸心、肺、膀胱經(jīng)，具有發(fā)汗解肌、溫通經(jīng)脈、助陽化氣、平?jīng)_降氣之功效?，F(xiàn)代藥理研究表明它有抑菌、抗炎、抗過敏、抗腫瘤、抗病毒、利尿、解熱、鎮(zhèn)痛、擴張血管等多種藥理活性。桂枝是《傷寒論》中繼甘草臨床應(yīng)用第二多的藥物。兩藥相合，祛風寒，除濕邪，溫經(jīng)脈以治療膝骨關(guān)節(jié)炎。

3.2 現(xiàn)代醫(yī)學 現(xiàn)代研究表明骨關(guān)節(jié)炎中重要的病理學特征為——膝關(guān)節(jié)軟骨細胞功能減退和數(shù)量減少、軟骨基質(zhì)減少。保持軟骨細胞的健康狀態(tài)是防止關(guān)節(jié)軟骨退化的重要因素［7］。骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨的退變主要通過兩條途徑而發(fā)揮作用［8］：一是通過各種因素導致的細胞外基質(zhì)的破壞；二是軟骨細胞自身的退變，軟骨細胞的凋亡。

圖1 各組膝OA 兔滑膜IL-1 免疫組化Fig.1 Immunohistochemistry of IL-1 in synovium of knee OA rabbits

圖2 各組膝OA 兔滑膜MMP-9 免疫組化Fig.2 Immunohistochemistry of MMP-9 in synovium of knee OA rabbits

本研究中，MMP-9 在羌活桂枝膏聯(lián)合推拿治療后的膝OA 兔滑膜與模型組差異顯著，提示羌活桂枝膏聯(lián)合推拿治療兔膝OA 有效，同時羌活桂枝膏貼敷組與推拿組療效相似。作為MMPs 家族的一員，有研究表明MMP-9 與的細胞外基質(zhì)降解過程有關(guān)，并在病理過程為纖維化的疾病中起重要作用。細胞因子IL-1β通過刺激軟骨細胞退變，引起基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族的產(chǎn)生，抑制Ⅱ型膠原的合成［9-10］。

表3 膝OA 兔免疫組化MMP-9 半定量分析Tab.3 Semi-quantitative analysis of MMP-9 in knee OA rabbits by immunohistochemistry ±s

表3 膝OA 兔免疫組化MMP-9 半定量分析Tab.3 Semi-quantitative analysis of MMP-9 in knee OA rabbits by immunohistochemistry ±s

注：與模型組相比，aP ＜0.05；與羌活桂膏貼敷組相比，bP ＜0.05

組別正常組模型組羌活桂枝膏聯(lián)合推拿組羌活桂枝膏貼敷組推拿組例數(shù)8888 8 MMP-9 平均光密度30.270 8±6.780 3 134.118 1±10.464 5 51.867 7±12.264 0ab 82.479 7±15.505 8a 73.650 3±7.915 2a

有研究報道稱細胞程序性死亡——自噬，是骨關(guān)節(jié)炎中調(diào)節(jié)軟骨細胞死亡的重要機制［11-12］IL-1為骨關(guān)節(jié)炎中主要的促炎癥因子，體外研究［13］發(fā)現(xiàn)IL-1 能顯著提高人軟骨細胞其mTOR 的表達，而明顯降低細胞外基質(zhì)Ⅱ型膠原的表達，眾多證據(jù)顯示骨關(guān)節(jié)炎軟骨退化伴有不同程度血管生成，源于關(guān)節(jié)軟骨和滑膜液中VEGF 水平上升［14］，而mTOR 受體的激活可刺激血管內(nèi)皮生長因子VEGF 的表達［15］，由此推斷IL-1 可能在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞自噬過程中起到重要作用。同時IL-1β是誘導軟骨細胞降解的始動因子，可以刺激基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的產(chǎn)生，導致軟骨細胞肥大及細胞終末分化等細胞異化作用直接參與對軟骨的破壞［16］。IL-1 在羌活桂枝膏聯(lián)合推拿組治療后的膝OA 兔滑膜與正常對照組兔滑膜表達水平相似，提示羌活桂枝膏聯(lián)合推拿治療膝OA 兔療效顯著，對比單一推拿組及羌活桂枝膏貼敷療效更佳。

實驗研究表明［17］：羌活膏能夠降低局部滑膜中炎癥因子來緩解膝骨關(guān)節(jié)炎的炎癥，從而緩解膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎癥狀。同時李華南等［18］人通過臨床研究發(fā)現(xiàn)：對患膝局部膏摩，能夠促進藥物吸收，直達病所，改善局部血液循環(huán)，使炎性反應(yīng)加快消散吸收。

本研究結(jié)果初步證實了羌活桂枝膏聯(lián)合推拿手法可膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)延緩膝關(guān)節(jié)軟骨退變，降低炎性因子IL-1 及基質(zhì)金屬蛋白酶-9 的表達。而能否通過降低IL-1 水平，從而調(diào)節(jié)mTOR 受體，進一步抑制VEGF 表達，增加軟骨細胞外基質(zhì)合成、提高軟骨細胞自噬、減少血管生成，協(xié)同作用以減緩骨關(guān)節(jié)炎進展承待進一步研究。