馮永海 李宏云 苗少一 施小山 趙文飛

鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科（鄭州450052）

腫瘤進(jìn)展過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞迅速增殖，血管網(wǎng)絡(luò)建立緩慢，導(dǎo)致局部缺氧微環(huán)境形成，腫瘤內(nèi)部細(xì)胞普遍存在缺氧情況［1］，因此對(duì)缺氧的適應(yīng)在乏氧腫瘤形成過(guò)程中至關(guān)重要，這主要依靠多血管體系形成及糖酵解速率提高實(shí)現(xiàn)［2］。探索腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧的機(jī)制可能有助于發(fā)現(xiàn)新的靶向治療方法。

缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor，HIF）是氧信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)中的一類(lèi)重要中介因子，在低氧應(yīng)答中起關(guān)鍵作用。HIF 是由α和β亞基組成的異二聚體，目前發(fā)現(xiàn)序列同源的α亞基有3 種：HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α，其中HIF-1α和HIF-2α是腫瘤細(xì)胞在低氧狀態(tài)下最主要的調(diào)節(jié)因子，也是目前研究的熱點(diǎn)［3］。然而，既往研究［4］表明HIF-1α和HIF-2α在腫瘤增殖過(guò)程中的作用具有明顯的差異［4］。為此筆者采用Western blot 對(duì)不同缺氧濃度和不同缺氧時(shí)間條件下培養(yǎng)的肺癌A549 進(jìn)行研究，初步探討兩者的生物學(xué)特性。

1 材料與方法

1.1 材料人肺癌A-549 細(xì)胞株引自中國(guó)科學(xué)院上海生物細(xì)胞研究所。特級(jí)血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。兔抗人HIF-1α、HIF-2α和堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 購(gòu)自Sigma 公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)人肺腺癌細(xì)胞株A549 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，在37 ℃、5%CO2條件下，培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%新生胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基。

1.3 細(xì)胞分組A549 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以0.25%胰蛋白酶消化，傳代接種于100 mL 的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，后置于缺氧培養(yǎng)箱中，分別在1%O2濃度下培養(yǎng)2、4、8、16、32 h 和1%、3%、5%、10%、21% O2濃度下培養(yǎng)8 h。在指定時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，提取總蛋白，并于-80 ℃下保存。

1.4 Western blot 法檢測(cè)HIF-1α 和HIF-2α 蛋白表達(dá)各組細(xì)胞在指定的條件下培養(yǎng)，在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，用4 ℃預(yù)冷PBS 漂洗2 遍，吸去PBS，采用加入PMSF 的裂解液于冰上裂解30 min，裂解完后，將細(xì)胞碎片和裂解液離心5 min，收集上清液即為總蛋白。Bradford 法測(cè)定細(xì)胞提取物蛋白質(zhì)含量。取等量蛋白加熱變性后進(jìn)行SDSPHAGE 電泳分離（10%的分離膠和4%的濃縮膠），分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。膜在TBS 中室溫孵育1 h，分別加入兔抗人HIF-1α（1∶300）、兔抗人HIF-2α（1∶300）以及兔抗人GAPDH（1∶800），4 ℃孵育過(guò)夜，抗原抗體結(jié)合。洗膜后，加入羊抗兔IgG（1∶1 000）室溫孵育1 h。洗膜后ECL 化學(xué)發(fā)光顯影，以β-Actin 為內(nèi)參照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有研究均設(shè)3 份平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)量數(shù)據(jù)以表示，采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩間比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌A-549 細(xì)胞中HIF-1α、HIF-2α 在常氧狀態(tài)下弱表達(dá)常氧狀態(tài)下，肺癌A-549 細(xì)胞和HeLa 細(xì)胞總蛋白中HIF-1α、HIF-2α 的表達(dá)均很微量；而在缺氧狀態(tài)下，HIF-1α、HIF-2α 蛋白表達(dá)水平在肺癌A-549 細(xì)胞和Hela 細(xì)胞總蛋白中均有顯著的提高（圖1）。

圖1 常氧、低氧狀態(tài)對(duì)HIF-1α、HIF-2α 表達(dá)的影響Fig.1 Effect of normoxia and hypoxia on the expression of HIF-1α and HIF-2α

2.2 短期缺氧條件下A-549細(xì)胞中HIF-1α、HIF-2α蛋白表達(dá)水平隨著氧濃度的降低而增強(qiáng)通過(guò)控制氧濃度分別在21%、10%、5%、3%、1%條件下培養(yǎng)A-549 細(xì)胞8 h，然后提取總蛋白進(jìn)行HIF-1α、HIF-2α蛋白的檢測(cè)。結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)條件下氧濃度的降低，HIF-1α、HIF-2α的表達(dá)水平逐漸升高（表1 和圖2）。

表1 不同氧濃度狀態(tài)下HIF-1α、HIF-2α的表達(dá)Tab.1 Expression of HIF-1α and HIF-2α at different oxygen concentrations±s

表1 不同氧濃度狀態(tài)下HIF-1α、HIF-2α的表達(dá)Tab.1 Expression of HIF-1α and HIF-2α at different oxygen concentrations±s

注：不同氧濃度間比較，P ＜0.05

HIF-1α HIF-2α 21%0.45±0.05 0.20±0.01 10%0.58±0.06 0.33±0.04 5%0.69±0.03 0.48±0.08 3%0.78±0.04 0.62±0.01 1%0.85±0.01 0.71±0.05

圖2 不同氧濃度對(duì)HIF-1α、HIF-2α 表達(dá)的影響Fig.2 Effect of different oxygen concentrations on the expression of HIF-1α and HIF-2α

2.3 缺氧狀態(tài)下肺癌A-549 細(xì)胞中HIF-1α、HIF-2α 蛋白表達(dá)隨時(shí)間的變化1%O2濃度下分別培養(yǎng)2、4、8、16、32 h，然后提取總蛋白進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HIF-1α 蛋白在培養(yǎng)2 ～8 h 表達(dá)水平逐漸升高，然后維持在這一較高的水平，到培養(yǎng)32 h 時(shí)HIF-1α 蛋白的表達(dá)有明顯的降低。HIF-2α 蛋白在培養(yǎng)2 ～8 h 表達(dá)水平緩慢升高，其增高幅度明顯小于HIF-1α 的表達(dá)水平。在接下來(lái)的8 ～32 h缺氧條件培養(yǎng)下HIF-2α 蛋白表達(dá)水平仍然處于逐漸升高的趨勢(shì)當(dāng)中（表2 和圖3）。

表2 不同缺氧時(shí)間HIF-1α、HIF-2α 的表達(dá)Tab.2 Expression of HIF-1α and HIF-2α in different hypoxia periods ±s

表2 不同缺氧時(shí)間HIF-1α、HIF-2α 的表達(dá)Tab.2 Expression of HIF-1α and HIF-2α in different hypoxia periods ±s

注：與2 h、8 h 組比較，#P ＜0.05；與8 h 組比較，*P ＞0.05；與16 h組比較，△P ＜0.05；不同缺氧時(shí)間HIF-2α 表達(dá)間比較，P ＜0.05

HIF-1α HIF-2α 2 h 0.71±0.02 0.54±0.02 4 h 0.78±0.04#0.61±0.04 8 h 0.85±0.01 0.71±0.05 16 h 0.87±0.03*0.79±0.01 32 h 0.60±0.06△0.86±0.04

圖3 不同缺氧時(shí)間對(duì)HIF-1α、HIF-2α 表達(dá)的影響Fig.3 Effect of different hypoxia time on the expression of HIF-1α and HIF-2α

3 討論

肺癌是我國(guó)發(fā)病率、病死率最高的惡性腫瘤［5］。目前肺癌患者5年生存率僅為18%，部分原因是肺癌早期不易診斷，大部分患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬于進(jìn)展期肺癌［6］，為降低肺癌病死率進(jìn)行的篩查因其侵襲性和異質(zhì)性而收效甚微。肺癌等實(shí)體腫瘤在生長(zhǎng)過(guò)程中，由于腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖，需要能量的高度消耗，導(dǎo)致局部組織供氧與耗氧失衡，形成腫瘤組織缺氧微環(huán)境，其微環(huán)境缺氧程度可影響腫瘤細(xì)胞異型性、侵襲性［7-8］。機(jī)體應(yīng)對(duì)低氧環(huán)境時(shí)的主要調(diào)節(jié)因子是HIF，它們通過(guò)調(diào)控諸如促紅細(xì)胞生成素、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、一氧化氮合成酶等低氧反應(yīng)基因，引起微血管形成和細(xì)胞能量代謝異常促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，其中又以HIF-1α和HIF-2α的作用最為顯著［9］。

惡性腫瘤組織在生長(zhǎng)過(guò)程中需要充足的氧以及對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行清除，以維持腫瘤的生長(zhǎng)、增殖，在此過(guò)程中，最主要的就是通過(guò)調(diào)節(jié)血管的新生與功能重塑，而腫瘤血管的生成主要由HIF 調(diào)節(jié)［10］。在常氧下，HIF-1α 與HIF-2α 很快泛素化并被降解，因此其表達(dá)難以被檢測(cè)［11］。在缺氧條件下，其轉(zhuǎn)錄因子活性增高，穩(wěn)定性增加，進(jìn)而促進(jìn)血管生成及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，參與細(xì)胞存活、凋亡、血管形成等多種生物學(xué)效應(yīng)，維持組織細(xì)胞在缺氧條件下內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，以適應(yīng)缺氧［12-13］。本研究發(fā)現(xiàn)隨著環(huán)境中氧濃度的下降，HIF-1α、HIF-2α 表達(dá)均上調(diào)（表1），且具有氧濃度依賴(lài)性的特點(diǎn)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，在低氧的不同時(shí)間點(diǎn)上HIF-1α、HIF-2α 的表達(dá)呈現(xiàn)不同的特點(diǎn)。HIF-1α 蛋白在缺氧條件培養(yǎng)2 ～8 h 表達(dá)水平逐漸升高，8 ～16 h 出現(xiàn)平臺(tái)期，此期間HIF-1α 蛋白表達(dá)維持在較高的水平，到32 h 時(shí)HIF-1α 蛋白的表達(dá)有明顯的降低。而HIF-2α 蛋白在缺氧條件培養(yǎng)2 ～8 h表達(dá)水平緩慢升高，在接下來(lái)的16 ～32 h 缺氧條件培養(yǎng)下HIF-2α蛋白表達(dá)水平仍然處于逐漸升高的趨勢(shì)當(dāng)中（表2）。綜合文獻(xiàn)及本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HIF-1α和HIF-2α在對(duì)缺氧過(guò)程的調(diào)節(jié)中可能各有側(cè)重，即HIF-1α是急性缺氧反應(yīng)的主要反應(yīng)因子，而HIF-2α則是慢性缺氧過(guò)程的主導(dǎo)因子［14］。并且基于腫瘤缺氧環(huán)境的慢性持續(xù)性，推測(cè)HIF-2α是腫瘤適應(yīng)乏氧反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子?？赡艿臋C(jī)制是，在缺氧早期，HIF-1α急速增加，通過(guò)激活糖代謝和血管生成來(lái)調(diào)節(jié)對(duì)急性缺氧的適應(yīng)性反應(yīng)［15］，繼而發(fā)展成中度缺氧微環(huán)境，該微環(huán)境能夠誘導(dǎo)HIF-1α迅速降解，同時(shí)使HIF-2α表達(dá)上調(diào)。當(dāng)HIF-2α積累到較高水平時(shí)，通過(guò)激活其下游靶基因來(lái)促使腫瘤生長(zhǎng)及生存優(yōu)勢(shì)，從而介導(dǎo)長(zhǎng)期的慢性缺氧反應(yīng)［16］。UCHIDA 等［17］提出通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染顯性突變體HIF-2α，可阻止慢性低氧下HIF-1α mRNA 和蛋白的減少，提示慢性低氧期，HIF-2α可能參與了抑制HIF-1α表達(dá)的過(guò)程。也有研究指出這可能是由于HIF-1α和HIF-2α存在不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能和基因結(jié)合位點(diǎn)所導(dǎo)致［18］，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

HIFs 對(duì)肺癌細(xì)胞在缺氧微環(huán)境的適應(yīng)性調(diào)節(jié)中起重要作用，對(duì)HIF-1α、HIF-2α 表達(dá)規(guī)律的深入研究，可以為特異性阻斷HIFs 及其靶基因的表達(dá)積累理論依據(jù)，有效地減少肺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、侵襲及減弱肺癌的耐藥性等，并為將來(lái)進(jìn)行更加準(zhǔn)確的干預(yù)治療提供理論依據(jù)。