甄娟 劉玉東 宋春紅 宋敏 朱曉艷石家莊市第四醫(yī)院（婦產(chǎn)醫(yī)院）病理科（石家莊0500）；河北省人民醫(yī)院耳鼻喉科（石家莊05005）；中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室（沈陽000）

卵巢癌是我國女性常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，上皮性癌是最常見的病理類型，其惡性程度高，易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，病死率較高，嚴(yán)重威脅著婦女的健康和生命安全。同時由于卵巢深居于盆腔內(nèi)，病變早期不易被發(fā)現(xiàn)，患者就醫(yī)時大部分已經(jīng)發(fā)展到中、晚期，有的患者手術(shù)已經(jīng)不能將病灶完全切除，直接影響到患者的術(shù)后生存率和生存質(zhì)量［1-2］。因此，尋求有效的腫瘤標(biāo)志物對卵巢上皮性癌的早期診斷、靶向治療及預(yù)后評估具有非常重要的意義。最新研究報道E3 泛素連接酶SIAH2 參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移，然而在卵巢上皮性癌中的研究和作用仍然不明，本研究旨在探討SIAH2 在卵巢上皮性癌中的表達(dá)及臨床意義，以及對評估卵巢上皮性癌患者預(yù)后的作用。

1 材料與方法

1.1 材料收集石家莊市第四醫(yī)院（婦產(chǎn)醫(yī)院）病理科2010-2017年婦科手術(shù)切除卵巢標(biāo)本存檔蠟塊165 例，卵巢上皮性癌55 例，卵巢交界性腫瘤36 例，卵巢良性囊腫39 例，正常卵巢組織35 例，所有患者術(shù)前均未接受放、化療。年齡29～74 歲（中位年齡55歲）。按WHO組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)：漿液性癌35 例，黏液性癌9 例，透明細(xì)胞癌11 例。低級別癌19 例，高級別癌36 例。按FIGO 分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ+Ⅱ期18 例，Ⅲ+Ⅳ期37 例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22 例。標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟包埋，HE 常規(guī)染色后明確診斷。部分標(biāo)本離體后取少量立即放入液氮后于-70 ℃冰箱保存，以備Western blot 檢測。所有標(biāo)本的使用均通過了本院倫理委員會審核且患者本人知情同意。

1.2 主要試劑免疫組織化學(xué)S-P 檢測試劑盒、DAB 酶底物顯色試劑盒（DAB-0031，福州邁新生物技術(shù)公司）；鼠抗人SIAH2 抗體（美國Santa Cruz公司），β-actin 抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判定組織經(jīng)中性福爾馬林固定、石蠟包埋，制成4 μm 連續(xù)切片。按照免疫組織化學(xué)S-P 檢測試劑盒說明書步驟進(jìn)行SIAH2（1：200）免疫組織化學(xué)染色。PBS 代替一抗作陰性對照，用已知陽性片作陽性對照。SIAH2 判定標(biāo)準(zhǔn)：SIAH2 以細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性顯色，每張切片隨機(jī)選取5 個高倍視野（× 400），每個高倍視野計數(shù)200 個目的細(xì)胞。將表達(dá)陽性率分為以下4個等級：≤25%為0分，26%～50%為1 分，51%～75%為2 分，＞75%為3 分。根據(jù)免疫組織化學(xué)染色強(qiáng)度分為4 個等級：無著色計為0 分，淺黃色顆粒計為1 分，棕黃色顆粒計為2 分，黃褐色計為3 分。以SIAH2 表達(dá)陽性率和染色強(qiáng)度的分值乘積作為總積分，積分≥4 分者判定為陽性，積分＜4 分者判定為陰性。

1.3.2 Western blot收集新鮮卵巢組織，加入裂解液充分裂解，粉碎勻漿后，低溫高速離心（4 ℃，12 000 r/min，40 min），提取上清即為總蛋白。經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)印，5%正常小牛血清封閉，抗SIAH2（1∶150）、抗β-actin（1∶200）室溫下孵育2 h，ECL發(fā)光；拍照及進(jìn)行計算機(jī)圖像分析，Image J 軟件用于半定量分析特異性條帶的光密度值，將目的蛋白與β-actin 光密度值作為相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次，取平均值。

1.3.3 隨訪卵巢癌患者術(shù)后進(jìn)行5年定期隨訪，開始時間為接受手術(shù)的時間，截止日期為2017年10月31 日，滿足5年隨訪時間的患者有35 例（注：包括滿5年隨訪時間和6 例刪失患者）。采用門診隨訪及電話隨訪，平均每6 個月1 次，規(guī)定死亡患者死亡時間為終止時間，中途失訪者的終止時間為最后1 次隨訪時間，亦納入生存分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 13.0 統(tǒng)計學(xué)軟件，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)分析SIAH2 與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線及Log-rank 檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析，Cox 回歸分析卵巢上皮性癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因素。定量資料采用F檢驗(yàn)（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）進(jìn)行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SIAH2 蛋白在卵巢組織中的表達(dá)免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，在165 例卵巢石蠟標(biāo)本中，SIAH2呈核表達(dá)陽性（圖1），陽性表達(dá)率在正常卵巢組織與卵巢良性囊腫分別為2.86%（1/35）和5.13%（2/39），表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；從正常組織和良性囊腫到交界性腫瘤（41.7%，15/36）再到上皮性癌（76.4%，42/55）中SIAH2 的陽性率逐漸升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。SIAH2與卵巢上皮性癌的高級別、高FIGO 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（均P＜0.05）。見表1。

圖1 SIAH2 在卵巢組織中的表達(dá)（SP×200）Fig.1 Expression of SIAH2 in ovarian tissues

表1 55 例卵巢上皮性癌組織中SIAH2 的表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系Tab.1 Associations between expression of SIAH2 and clinicopathologic parameters 例

2.2 生存分析35 例患者（滿5年隨訪時間的卵巢癌患者包括6 例刪失患者）術(shù)后開始隨訪60 個月，刪失6 例，刪失患者亦納入生存分析。SIAH2陽性表達(dá)患者平均生存時間為20 個月，中位生存時間為17 個月；SIAH2 陰性表達(dá)患者平均生存時間為41 個月，中位生存時間為45 個月。SIAH2 陽性表達(dá)患者中位生存時間及總生存率顯著低于陰性表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Log-rank 檢驗(yàn)Wald=7.443，P=0.006，圖2、表2）。對卵巢上皮性癌患者生存時間的單因素和多因素分析結(jié)果表明，SIAH2 的表達(dá)、腫瘤組織學(xué)分級、FIGO 分期與卵巢上皮性癌的生存時間相關(guān)（均P＜0.05，表2），SIAH2是卵巢上皮性癌預(yù)后的獨(dú)立影響因素（表3）。

圖2 SIAH2 的表達(dá)與卵巢癌患者總生存率的關(guān)系Fig.2 Association between expression of SIAH2 and overall survival（cum survival）

2.3 SIAH2在卵巢上皮性癌組織中高表達(dá)Western blot 結(jié)果顯示，在正常卵巢組織、卵巢良性囊腫、卵巢交界性腫瘤及卵巢上皮性癌中SIAH2 的相對表達(dá)量分別是0.12 ± 0.05、0.11 ± 0.04、0.57 ±0.08、1.05 ± 0.10；正常卵巢組織和卵巢良性囊腫SIAH2 的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，從卵巢組織（卵巢良性囊腫）到卵巢交界性腫瘤再到卵巢上皮性癌組織中SIAH2 的表達(dá)依次升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05，圖3）。

表2 卵巢上皮性癌患者總生存率的單因素分析Tab.2 Univariate survival analysis of overall survival（OS）in 35 patients月

表3 卵巢上皮性癌患者總生存率的多因素分析Tab.3 Multivariate survival analysis of overall survival（OS）in 35 patients

圖3 SIAH2 卵巢組織中的表達(dá)Fig.3 Expression of SIAH2 in ovarian tissues

3 討論

卵巢上皮性癌是病死率最高的婦科惡性腫瘤，極易發(fā)生擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，又由于早期缺乏典型的臨床癥狀，導(dǎo)致多數(shù)患者就診時已發(fā)生腫瘤播散和（或）轉(zhuǎn)移。盡管隨著臨床診斷手段和治療技術(shù)的日益發(fā)展，卵巢上皮性癌的5年生存率也僅從1975年的36%提高到2011年的46%［3］。目前，生物學(xué)治療作為腫瘤治療的新模式日益受到重視，越來越多的研究以關(guān)鍵性因子作為切入點(diǎn)，尋求早期診斷卵巢上皮性癌的生物學(xué)指標(biāo)和新的與預(yù)后相關(guān)的生物學(xué)因子，在早期診治和評估患者預(yù)后的同時有助于制定更科學(xué)合理的綜合治療方案。

真核細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)主要通過兩種不同的蛋白酶解系統(tǒng)降解：溶酶體途徑和泛素-蛋白酶途徑，其中80%通過后者降解，E3 泛素連接酶是該系統(tǒng)的重要成分，在細(xì)胞凋亡的每個時期都有泛素-蛋白酶體降解途徑參與。SIAH2 為高度保守的泛素連接酶，定位于3Q25 號染色體，編碼了324 個氨基酸，有2 個外顯子被1 個9.8 kb 內(nèi)含子隔開，起始甲硫氨酸位于外顯子1，與siah1 有85%的同一性，與果蠅屬sina 有68%的同一性。SIAH2 蛋白經(jīng)由RING FINGER 區(qū)域參與一些蛋白的泛素化和水解作用，通過作用不同的底物從而影響細(xì)胞的功能如低氧反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞生存、線粒體生物合成、脂肪生成、神經(jīng)中樞調(diào)節(jié)等［4-6］。近來研究發(fā)現(xiàn)，SIAH2 可作為癌基因在多種惡性腫瘤中發(fā)揮生物學(xué)作用，SIAH2 在前列腺癌［7］、肺癌［8］、乳腺癌［9］、急性T 淋巴細(xì)胞白血?。?0］等組織中均高表達(dá)，并且隨著肺癌及乳腺癌惡性程度的增高其蛋白表達(dá)水平也逐漸增高，抑制SIAH2 的表達(dá)后乳腺癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞的增殖遷移能力下降［11-12］。本次Western blot 結(jié)果顯示，SIAH2 在正常卵巢組織和卵巢良性囊腫組織中表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，從正常卵巢組織和卵巢良性囊腫組織到交界性腫瘤再到卵巢癌組織中的蛋白表達(dá)量逐漸增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，與此一致的是免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)SIAH2 蛋白的陽性表達(dá)率也逐漸升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，可借此推測SIAH2 在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著促進(jìn)作用。同時統(tǒng)計學(xué)分析顯示卵巢上皮性癌組織中SIAH2 的陽性表達(dá)隨著FIGO 分期和病理學(xué)分級的增高而增加，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，這與國外文獻(xiàn)的研究結(jié)果基本一致［13］。說明了SIAH2 與卵巢上皮性癌的生物學(xué)行為密切相關(guān)。

最近研究報道SIAH2 能夠改變抗癌藥物的反應(yīng)，過表達(dá)的SIAH2 能夠增強(qiáng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞MALME 3m 對抗癌藥物的抵抗，下調(diào)SIAH2的表達(dá)后可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對抗癌藥物的敏感性［14］。由此可見SIAH2 可以用于腫瘤的治療。WONG 等［15］發(fā)現(xiàn)在SIAH2 表達(dá)缺失的腫瘤中，可以提高化療反應(yīng)和延長生存率。本研究通過生存分析發(fā)現(xiàn)，SIAH2 蛋白表達(dá)與患者5年總生存率密切相關(guān)，SIAH2 表達(dá)陽性的患者5年生存率及中位生存時間低于陰性表達(dá)的患者，兩組生存曲線的分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義；COX 多因素回歸分析結(jié)果也表明，SIAH2 蛋白陽性表達(dá)是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素之一。說明SIAH2 對卵巢上皮性癌具有一定的預(yù)后評價作用。

綜上，筆者推測SIAH2 可以作為卵巢上皮性癌診斷的生物學(xué)標(biāo)志物和治療的藥物靶點(diǎn)，SIAH2作為一種促癌因子，應(yīng)用有效的刺激誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中SIAH2 表達(dá)水平下調(diào)可作為治療卵巢上皮性癌的新靶點(diǎn)，為卵巢上皮性癌的治療提供了一個新思路，同時SIAH2 可以作為患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因素，為臨床預(yù)后評估提供理論依據(jù)。