楊 婧，高 勁，肖 亮，王 芬，金問森，熊 那,4

放射治療(radiotherapy，RT)是治療中晚期腫瘤的重要方法，也是早期腫瘤手術(shù)后的補(bǔ)充手段，能夠明顯提高患者的生存時間。但是，RT在殺傷腫瘤細(xì)胞的時候，也會對機(jī)體的正常組織及細(xì)胞產(chǎn)生影響。一般來說，人體淋巴細(xì)胞對放射線有著較高的敏感性，而RT可引起部分淋巴細(xì)胞的再分布甚至死亡，從而導(dǎo)致人體免疫系統(tǒng)的改變[1]。隨著RT技術(shù)的日新月異，調(diào)強(qiáng)放療(intensity-modulated radiotherapy，IMRT)已被廣泛地應(yīng)用于頭頸胸腹等全身各部位惡性腫瘤的治療，它具有靶區(qū)劑量高，而對正常組織損傷卻較小的特點[2]。該研究對183例常見腫瘤(肺癌、食管癌、鼻咽癌和直腸癌)患者IMRT前后的外周血淋巴細(xì)胞亞群的變化進(jìn)行綜合分析，為今后在IMRT中更為有效地保護(hù)免疫系統(tǒng)，以及免疫調(diào)節(jié)方面的治療提供一定的研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1病例資料選取2015年10月～2017年11月安徽省立醫(yī)院西區(qū)放療科收治的食管癌、肺癌、鼻咽癌及直腸癌患者183例，其中男145例，女38例，年齡13～89歲，中位年齡58歲。入組標(biāo)準(zhǔn)：患者無免疫系統(tǒng)疾病，且入院前未接受其他免疫方面治療。患者IMRT前后行外周血淋巴細(xì)胞及其亞群檢測，其中66例行免疫功能測定，117例行調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)檢測?；颊咭话阗Y料見表1。

表1 患者的一般資料

1.2研究方法和試劑

1.2.1主要試劑 CD3、CD8、CD45、CD4、CD16、CD56、CD19、CD127鼠抗人單克隆熒光抗體均購自美國BD公司，紅細(xì)胞裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)公司，其他均為國產(chǎn)市售常用試劑。

1.2.2放療方法 采用GE Discovery CT模擬定位機(jī)增強(qiáng)掃描后，掃描圖像傳輸至Pinnacle放療計劃系統(tǒng)，勾畫大體腫瘤體積(gross tumor volume，GTV)、大體腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)體積(gross tumor volume lymph gland，GTVnd)和相應(yīng)淋巴引流區(qū)，即臨床靶體積(clinical targer volume，CTV)，通過3D外擴(kuò)獲得計劃靶體積(planning targer volume，PTV)。依據(jù)GTV、GTVnd和CTV外擴(kuò)的PTV，給予不同的放療劑量，周圍正常組織給予合理劑量限值，制定放療計劃進(jìn)行照射。食管癌、肺癌、直腸癌放療劑量均在50～60 Gy，鼻咽癌為68～70 Gy。采用Varian trilogy 5339直線加速器，6 MV-X線照射，常規(guī)分割為1.8～2.2 Gy/次，1次/d，5 d/周，每周行kV級錐形束CT圖像引導(dǎo)，檢測和校正患者的放療體位。

1.2.3流式細(xì)胞儀(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測 患者分別于IMRT開始時和結(jié)束后1個月時抽取空腹靜脈血2 ml，乙二胺四乙酸鹽(EDTA)抗凝。取100 μl全血加入不同抗體的混合液20 μl，4 ℃避光孵育30 min。加入1 ml紅細(xì)胞裂解液，吹打混勻，裂解5 min，離心后棄上清液。PBS清洗細(xì)胞，重復(fù)2次，加入250 μl染色緩沖液重懸細(xì)胞后，采用FCM進(jìn)行檢測，以FlowJo分析軟件進(jìn)行淋巴細(xì)胞及亞群分析。

2 結(jié)果

2.1IMRT前后淋巴細(xì)胞總數(shù)的變化治療前淋巴細(xì)胞總數(shù)均值為(1.592±0.491)×109個/L，治療后的淋巴細(xì)胞總數(shù)均值為(0.739±0.342)×109個/L，以配對設(shè)計t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果顯示IMRT前后患者血液中的淋巴細(xì)胞總數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=15.12，P<0.01)，表明IMRT可以導(dǎo)致腫瘤患者外周血中的淋巴細(xì)胞總數(shù)顯著降低。見圖1。

2.2IMRT前后總T(T)細(xì)胞、輔助性T(helperTcell,Th)細(xì)胞和抑制性/細(xì)胞毒性T(suppressorTcell/cytotoxicTcell,Ts/Tc)細(xì)胞的水平變化治療后的CD3+T細(xì)胞和CD3+CD4+Th細(xì)胞占淋巴細(xì)胞百分比(均值分別為68.200%±13.902%、27.871%±9.167%)明顯降低，與治療前(均值分別為71.251%±9.475%、40.739%±9.68%)相比較，T細(xì)胞平均下降3.05%(t=2.189，P<0.05)，Th細(xì)胞平均下降12.87% (t=9.962，P<0.01)，然而，治療后患者血液中的CD3+CD8+Ts/Tc細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的百分比(均值37.405%±13.026%)升高，較治療前(均值28.439%±8.444%)平均增加8.96%(t=-6.403，P<0.01)。見圖2。進(jìn)一步計算患者治療前的CD4+細(xì)胞/CD8+細(xì)胞比值為1.645±0.763，而治療后的CD4+細(xì)胞/CD8+細(xì)胞比值為0.862±0.466，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (t=9.339，P<0.01)。上述結(jié)果提示，IMRT導(dǎo)致患者血液中T細(xì)胞和Th細(xì)胞的百分比降低，Ts/Tc細(xì)胞的百分比較IMRT前升高，從而造成CD4+/CD8+比值的明顯下降。

圖1 IMRT前后患者血液中淋巴細(xì)胞總數(shù)的變化

2.3IMRT前后Treg的水平變化CD4+和CD25+是Treg細(xì)胞的標(biāo)志，并且CD127低表達(dá)(CD127low/)為Treg細(xì)胞的重要標(biāo)志，因此，進(jìn)一步檢測患者治療前后血液中CD4+CD25+CD127low/-的Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比，治療前均值為6.270%±1.900%，治療后為5.802%±1.850%，如圖3所示，患者治療后血液中的Treg細(xì)胞水平下降，平均降低0.47%，與治療前比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.17，P<0.05)。

2.4IMRT前后自然殺傷細(xì)胞(naturekillercell，NK)和B細(xì)胞的水平變化與T細(xì)胞和B細(xì)胞相比，NK細(xì)胞表面標(biāo)志具有相對特異性，CD3-和CD16+、CD56+為NK細(xì)胞檢測的常用標(biāo)記。CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞的檢測結(jié)果顯示，患者IMRT前外周血NK細(xì)胞占淋巴細(xì)胞百分比均值為19.420%±9.688%，IMRT后為23.723%±11.909%，與治療前外周血NK細(xì)胞水平相比增加4.3%，結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (t=-3.697，P<0.01)。由于CD19存在于除漿細(xì)胞以外的幾乎所有B細(xì)胞表面，因此，CD3-和CD19+常作為B細(xì)胞的檢測標(biāo)記。檢測結(jié)果顯示，患者治療后CD3-CD19+B細(xì)胞水平(均值5.037%±4.106%)平均下降1.65%，與治療前(均值6.726%±3.240%)比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (t=2.973，P<0.01)。見圖4。

圖2 IMRT前后血液中T、Th和Ts細(xì)胞的水平變化

3 討論

傳統(tǒng)放療可引起腫瘤患者血液中淋巴細(xì)胞總數(shù)的下降，這種效應(yīng)的機(jī)制為放射線直接殺傷循環(huán)淋巴細(xì)胞和射線對骨髓的抑制導(dǎo)致淋巴細(xì)胞增殖和分化減少。在現(xiàn)代放療中，普遍采用IMRT治療腫瘤，其靶區(qū)精確度高，擺位誤差小，能最大限度的保護(hù)腫瘤附近的正常組織。其對骨髓的抑制作用也較小，因此，淋巴細(xì)胞數(shù)目的減少主要原因是IMRT的直接殺傷作用[3]。在本研究中觀察到IMRT引起患者外周血淋巴細(xì)胞的數(shù)量明顯下降，并且這種下降在治療結(jié)束后4周尚未完全恢復(fù)，提示盡管IMRT對機(jī)體正常組織損傷較小，但是對高度敏感性的淋巴細(xì)胞仍然具有很強(qiáng)的殺傷作用。

T淋巴細(xì)胞是形成并促進(jìn)機(jī)體免疫應(yīng)答的重要組分，其中CD3+CD4+Th細(xì)胞可通過擴(kuò)增輔助B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體，并可活化其他的T細(xì)胞亞群，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答，在抗腫瘤和炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)中具有重要作用，而CD3+CD8+Ts/Tc細(xì)胞則具有殺傷和抑制靶細(xì)胞的作用，在抗腫瘤方面能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞[4]。通常情況下，CD4+/CD8+細(xì)胞比例保持相對穩(wěn)定，以達(dá)到機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)。本研究中IMRT后患者外周血中的Th細(xì)胞百分比下降，而Ts/Tc細(xì)胞比例升高，導(dǎo)致CD4+細(xì)胞/CD8+細(xì)胞比值進(jìn)一步降低，提示IMRT誘導(dǎo)了患者外周血中T細(xì)胞亞群的再分布。Tao et al[5]在鼻咽癌患者IMRT的研究中，發(fā)現(xiàn)治療后外周血Th細(xì)胞占淋巴細(xì)胞百分比與分期呈負(fù)相關(guān)，而CD4+/CD8+細(xì)胞比值降低可明顯增加腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。Yang et al[6]也發(fā)現(xiàn)前列腺癌放療有效的患者外周血中CD4+細(xì)胞/CD8+細(xì)胞比值明顯高于無顯著療效的患者。

CD4+CD25+Treg細(xì)胞是CD4+T淋巴細(xì)胞的一個亞群，能夠通過抑制T細(xì)胞的活化和增殖、下調(diào)白細(xì)胞介素-2(interleukin-2，IL-2)的分泌，以抑制抗腫瘤的免疫反應(yīng)，同時在腫瘤治療中也起到維持免疫平衡、防止過度炎性反應(yīng)和損傷的作用[7]。Foxp3+是CD4+CD25+Treg細(xì)胞的標(biāo)志分子，而Foxp3+具有良好的相關(guān)性，CD4+CD25+CD127low/-細(xì)胞包含了絕大多數(shù)的Foxp3+細(xì)胞，通常情況下，以CD4+CD25+CD127low/-進(jìn)行Treg細(xì)胞分選[8]。部分臨床研究[9-10]表明，放療可導(dǎo)致患者血液中Treg細(xì)胞的增加，與其他T淋巴細(xì)胞亞群CD127low/-與相比，Treg細(xì)胞的放射敏感性相對較低。而本項研究結(jié)果提示，腫瘤患者在IMRT結(jié)束后4周，外周血中Treg細(xì)胞的比例并未升高，反而出現(xiàn)降低，可能與檢測時間的差異和樣本數(shù)量有關(guān)。Cao et al[11]研究顯示，CD4+CD25+Treg細(xì)胞受到電離輻射后，其凋亡相關(guān)蛋白(caspase-3、Bax和CD95)都高于CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞，從而導(dǎo)致CD4+CD25+Treg細(xì)胞具有高放射敏感性，與本項研究結(jié)果相似。

圖4 IMRT前后血液中NK和B細(xì)胞的水平變化

NK細(xì)胞屬于固有免疫細(xì)胞，在機(jī)體受到抗原和外界刺激時，首先快速啟動固有免疫應(yīng)答，其中NK細(xì)胞表面高表達(dá)Fcγ受體(CD16)，與配體結(jié)合后，分泌腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)和干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)，發(fā)揮炎性反應(yīng)和抗腫瘤作用，B細(xì)胞可分化為漿細(xì)胞，合成和分泌免疫球蛋白[12]。本研究結(jié)果顯示，IMRT患者外周血中的NK細(xì)胞百分比升高，而B細(xì)胞的百分比降低。此現(xiàn)象是由于NK細(xì)胞中含有大量還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)，能夠有效清除由電離輻射激發(fā)水分子所形成的活性氧和自由基，具有很強(qiáng)的抗氧化能力，所以對電離輻射的耐受性高[3]，而Sage et al[3]和Jiang et al[13]則在腫瘤放療的研究中發(fā)現(xiàn)，B細(xì)胞與其他淋巴細(xì)胞亞群相比較，具有更高的放射敏感性。

綜上所述，IMRT可以導(dǎo)致腫瘤患者外周血淋巴細(xì)胞及其亞群的變化，從而對免疫功能產(chǎn)生影響，并且在治療后的短時間內(nèi)不能恢復(fù)正常。因此，需要及早給予免疫調(diào)節(jié)治療，如IMRT過程中和結(jié)束的早期，以促進(jìn)免疫平衡的恢復(fù)，預(yù)防輻射導(dǎo)致的過度炎性反應(yīng)及誘發(fā)的二次致癌效應(yīng)。