郭有新，陳寶剛，劉建偉，李 立，張 紅，馬志紅

喉癌(laryngeal carcinoma, LC)作為常見的頭頸部惡性腫瘤，其主要病理類型為鱗狀細(xì)胞癌，目前認(rèn)為其發(fā)病與吸煙、飲酒、環(huán)境因素、放射線、病毒感染及微量元素的缺乏相關(guān)[1-2]。根據(jù)我國2015年全國腫瘤登記中心(NCCR)最新公布的中國癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示：2015年新發(fā)惡性腫瘤約429萬例，死亡人數(shù)約281萬；其中喉癌新發(fā)病例約2.64萬，死亡人數(shù)約1.45萬例[3]，嚴(yán)重威脅人類的生命與健康。miRNA作為一類高度保守的非編碼單鏈小RNA，已證實(shí)其通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控參與影響幾乎所有的生理、病理進(jìn)程，在多個(gè)物種中發(fā)揮重要作用[4-5]。不少miRNA被發(fā)現(xiàn)在喉癌發(fā)生過程中發(fā)揮著促進(jìn)或者抑制的調(diào)節(jié)功能[6-7]，但大部分miRNA在喉癌轉(zhuǎn)移過程中的調(diào)控機(jī)制目前尚不明確。該研究探討miR-133b對喉癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及主要試劑總RNA抽提試劑TRIzol購自美國Invitrogen公司；hsa-miR-133b mimics/NC、轉(zhuǎn)染試劑riboFECTTM CP Reagent、hsa-miR-133b real-time PCR引物購自廣州市銳博生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Reverse Transcription System、SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR Kit試劑盒、mRNA SYBR Green熒光定量PCR試劑購自日本TaKaRa公司；Propidium Iodide/碘化丙啶、RNase A、MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；喉癌Hep-2細(xì)胞購自北京協(xié)和基礎(chǔ)研究所細(xì)胞中心。

1.2方法

1.2.1胃癌差異表達(dá)miRNA篩選 本研究基于GEO數(shù)據(jù)庫下載并獲取喉癌組織miRNA芯片高通量數(shù)據(jù)集GSE47610(GSM1153144- GSM1153148)，其中包括3例喉癌組織樣本與2例正常喉組織。本研究主要采用的生物信息學(xué)分析工具為Qlucore Omics Explorer (QOE)3.2，由瑞典隆德大學(xué)研制，一種新型的生物信息學(xué)分析軟件，可用于分析基因芯片、基因表達(dá)、實(shí)時(shí)PCR以及DNA甲基化等多種生物學(xué)數(shù)據(jù)。

1.2.2實(shí)時(shí)定量PCR檢測喉癌組織miR-133b表達(dá)量 選取河北省承德市醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院2015年6月～2017年6月收治的46例喉癌患者為研究對象，手術(shù)切除的喉癌組織標(biāo)本為喉癌組，遠(yuǎn)離腫瘤的正常喉組織標(biāo)本為對照組。TRIzol法提取組織總RNA，取10 μl RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用U6作為內(nèi)參進(jìn)行相對定量分析，定量反應(yīng)體系按照12.5 μl SYBR Premix Ex Taq，1 μl PCR Forward Primer, 1 μl Uni-miR qPCR Primer，2 μl cDNA模板，8.5 μl ddH2O，總體積為25 μl，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行孔。擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性95 ℃、30 s；95 ℃、5 s，60 ℃、20 s，40個(gè)循環(huán)；采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-133b的相對表達(dá)量。

1.2.3轉(zhuǎn)染hsa-miR-133b至Hep-2細(xì)胞及轉(zhuǎn)染效率檢測 培養(yǎng)并接種1×105個(gè)Hep-2細(xì)胞至含有適量完全培養(yǎng)基的24孔培養(yǎng)板中，使轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度達(dá)到30%～50%。用 30 μl 1× riboFECTTMCP Buffer稀釋1.25 μl 20 μmol/L hsa-miR-133b mimic，輕輕混勻。加入3 μl riboFECTTM轉(zhuǎn)染試劑，輕輕吹打混勻，室溫孵育15 min。將培養(yǎng)板置于 37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。熒光顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染效率。其中，轉(zhuǎn)染hsa-miR-133b NC設(shè)為對照組。

1.2.4MTT法檢測細(xì)胞增殖 將過表達(dá)miR-133b組及NC組Hep-2細(xì)胞穩(wěn)定培養(yǎng)后傳代于96孔板，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別于24、36、48、72 h進(jìn)行MTT檢測。每組4個(gè)重復(fù)。96孔板每孔加入20 μl MTT (5 mg/ml PBS溶解)，孵育4 h然后棄除上清液。每孔里面再加入150 μl Formazan溶解液，振蕩10 min，充分溶解結(jié)晶物。酶標(biāo)儀(490 nm)測定光吸收值。

1.2.5流式檢測細(xì)胞周期 將過表達(dá)miR-133b組及NC組Hep-2細(xì)胞穩(wěn)定培養(yǎng)后傳代，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至24 h，用胰酶消化收集細(xì)胞，加入1 ml 75%預(yù)冷乙醇中，吹打均勻，4 ℃固定12 h以上，再加入PBS洗滌，離心1 000 r/min，5 min，清洗兩次。重懸細(xì)胞用0.5 ml PBS，每孔加入PI和 RNaseA至終濃度50 μg/ml，37 ℃溫浴30 min。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.2.6流式檢測細(xì)胞凋亡 懸浮兩組細(xì)胞離心(2 000 r/min離心5 min)收集，貼壁細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化收集，用PBS洗滌細(xì)胞兩次(2 000 r/min離心5 min)收集5×105細(xì)胞，，加入500 μl的緩沖液懸浮細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-EGFP混勻后，加入5 μl碘化丙啶，混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.2.7細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將凍存于-80 ℃冰箱的BD matrigel 4 ℃過夜(24 h)，變成液態(tài)，取300 μl無血清培養(yǎng)基，加入60 μl Matrigel，混勻，加入上室各100 μl，放入37 ℃培養(yǎng)箱中，孵育4～5 h，此間經(jīng)常觀察，當(dāng)出現(xiàn)“白色層”時(shí)，說明已經(jīng)變?yōu)楣虘B(tài)。用無血清培養(yǎng)基洗Matrigel 1次，每孔加入100 μl兩組細(xì)胞懸液，下腔室中加入500 μl含有20%FBS條件培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h，取出Transwell用PBS洗2遍，5%戊二醛固定(4 ℃)，加入結(jié)晶紫(0.1%)染色10 min，室溫0.5 h，PBS洗2次，用棉球擦去上表面細(xì)胞，顯微鏡下觀察。

1.2.8雙熒光素酶載體法驗(yàn)證miR-133b靶基因 通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)，分別構(gòu)建帶有野生型和突變型GSTP1-3’UTR的報(bào)告載體pLUC；將hsa-miR-133b mimic、NC分別與pLUC- GSTP1-Mut、pLUC- GSTP1-WT共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，測定螢火蟲熒光素酶相對活性。

1.2.9Western blot檢測GSTP1蛋白 將過表達(dá)miR-133b組及NC組Hep-2細(xì)胞穩(wěn)定培養(yǎng)后傳代，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至24 h，提取兩組細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，沸水變性，配制10%的分離膠及5%的濃縮膠，SDS-PAGE電泳；轉(zhuǎn)膜后，加入用封閉液稀釋的相應(yīng)一抗，室溫?fù)u床孵育2 h，并用TBS洗膜3次，每次15 min；再加入用封閉液稀釋的相應(yīng)二抗室溫?fù)u床孵育1 h，并用TBS洗膜3次，每次15 min；ECL顯色檢測。

2 結(jié)果

2.1喉癌表達(dá)miRNAs的篩選基于GEO獲取的喉癌組織miRNA芯片高通量數(shù)據(jù)，根據(jù)設(shè)定的數(shù)值過濾標(biāo)準(zhǔn)和中位值標(biāo)準(zhǔn)化處理，對表達(dá)差異miRNAs進(jìn)行分層聚類分析，獲得5個(gè)表達(dá)上調(diào)miRNA，8個(gè)表達(dá)下調(diào)miRNA，見圖1。通過數(shù)據(jù)分析及前期實(shí)驗(yàn)室研究成果，選擇miR-133b進(jìn)行功能研究。

2.2miR-133b在喉癌中差異表達(dá)及臨床特征關(guān)系采用Real-time PCR法檢測miR-133b在23例喉癌組織和對應(yīng)23例癌旁正常喉黏膜組織的表達(dá)，結(jié)果表明喉癌組織標(biāo)本中miR-133b表達(dá)顯著下調(diào)約4.1倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)，見圖2。此外，針對23例喉癌組織臨床特征分析，表明miR-133b的表達(dá)水平與腫瘤局部浸潤深度、是否存在區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、患者臨床分期以及組織學(xué)分級(jí)呈負(fù)相關(guān)，不同期別之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。以上結(jié)果提示miR-133在喉癌的發(fā)生發(fā)展中可能具有關(guān)鍵的生物學(xué)作用。

圖1 喉癌表達(dá)miRNAs的篩選

圖2 hsa-miR-133b在喉癌組織中差異表達(dá)

2.3過表達(dá)miR-133b抑制喉癌細(xì)胞的增殖采用帶有Cy3熒光蛋白的hsa-miR-133b mimic轉(zhuǎn)染喉癌Hep-2細(xì)胞24 h后，熒光顯微鏡觀察大致轉(zhuǎn)染效率超過80%，見圖3A。同時(shí)，Real-time PCR法檢測miR-133b表達(dá)情況，結(jié)果表明相對于對照組，轉(zhuǎn)染組miR-133b表達(dá)升高至30倍(P<0.0001)，見圖3B，表明轉(zhuǎn)染成功。MTT法檢測過表達(dá)miR-133b喉癌Hep-2細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示隨著培養(yǎng)時(shí)間增加至72 h，miR-133b表現(xiàn)出顯著性抑制喉癌增殖效果，尤其在48 h和72 h，抑制率達(dá)到(29.32±2.04)%和(34.81±2.76)%，見圖3C。

表1 miR-133b表達(dá)與喉癌患者臨床特征的關(guān)系

圖3 過表達(dá)miR-133b抑制喉癌細(xì)胞的增殖

A：熒光顯微鏡觀察采用帶有Cy3熒光蛋白的hsa-miR-133b mimic轉(zhuǎn)染效率；B：Real-time PCR法檢測轉(zhuǎn)染hsa-miR-133b 24 h后miR-133b表達(dá)情況；C：MTT法檢測過表達(dá)miR-133b、NC喉癌Hep-2細(xì)胞增殖；與NC組比較：****P<0.000 1

2.4過表達(dá)miR-133b影響喉癌細(xì)胞周期通過流式技術(shù)PI單染法檢測過表達(dá)miR-133b組及NC組細(xì)胞周期，結(jié)果顯示相對于對照組，miR-133b過表達(dá)組S期細(xì)胞數(shù)量明顯增多，說明細(xì)胞發(fā)生S阻滯，DNA合成受阻，細(xì)胞生長停滯，數(shù)量減少，見圖4。

圖4 過表達(dá)miR-133b影響喉癌細(xì)胞周期A:NC組;B:hsa-miR-133b mimic組

2.5過表達(dá)miR-133b促進(jìn)喉癌細(xì)胞凋亡通過流式技術(shù)檢測過表達(dá)miR-133b組及NC組細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示對照組細(xì)胞凋亡率為(6.82±0.65)%，miR-133b過表達(dá)組凋亡率為(16.47±1.92)%，表明過表達(dá)miR-133b促進(jìn)喉癌Hep-2細(xì)胞凋亡，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001 2)，見圖5。

2.6過表達(dá)miR-133b抑制喉癌細(xì)胞侵襲通過Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)來檢測細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，結(jié)果顯示對照組細(xì)胞侵襲數(shù)目為(452±36)，miR-133b過表達(dá)組細(xì)胞侵襲數(shù)目為(116±13)，表明過表達(dá)miR-133b顯著抑制喉癌Hep-2細(xì)胞侵襲，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000 1)，見圖6。

2.7miR-133b靶基因GSTP1的預(yù)測與驗(yàn)證使用TargetScan數(shù)據(jù)庫對miR-32進(jìn)行靶基因預(yù)測，從預(yù)測結(jié)果中挑選GSTP1等候選基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)，分別構(gòu)建帶有野生型和突變型GSTP1-3’UTR的報(bào)告載體pLUC；將hsa-miR-133b mimic及NC分別與pLUC-GSTP1-Mut、pLUC-GSTP1-WT共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，通過測定螢火蟲熒光素酶相對活性，結(jié)果表明hsa-miR-133b可以顯著降低pLUC-GSTP1-WT中hRluc表達(dá)(P=0.043)，并且針對pLUC-GSTP1-Mut沒有作用，見圖7。說明miR-133b可以通過GSTP1-3’UTR結(jié)合位點(diǎn)調(diào)控hRluc的表達(dá)，進(jìn)而表明其存在靶向調(diào)控的關(guān)系。

圖5 過表達(dá)miR-133b促進(jìn)喉癌細(xì)胞凋亡A:NC組;B:hsa-miR-133b mimic組

圖6 過表達(dá)miR-133b抑制喉癌細(xì)胞遷移 ×200A:NC組;B:hsa-miR-133b mimic組

2.8過表達(dá)miR-133b降低靶基因GSTP1表達(dá)Western blot檢測過表達(dá)miR-133b組及NC組GSTP1蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示過表達(dá)hsa-miR-133b可以明顯下調(diào)GSTP1蛋白表達(dá)量(P=0.013)，見圖8。

圖7miR-133b靶基因GSTP1的預(yù)測與雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證

與NC組比較：*P<0.05

圖8 過表達(dá)miR-133b降低靶基因GSTP1表達(dá)與NC組比較：*P<0.05

3 討論

隨著以miRNA為代表非編碼RNA在腫瘤領(lǐng)域研究的不斷深入，越來越多的喉癌相關(guān)miRNA被發(fā)現(xiàn)深度參與其發(fā)生發(fā)展治療過程中。Shen et al[8]用亞硫酸氫鹽測序技術(shù)針對104個(gè)喉癌組織及對應(yīng)癌旁組織進(jìn)行miR-34a啟動(dòng)子區(qū)域CpG6位點(diǎn)DNA甲基化水平測序，結(jié)果表明喉癌組織中miR-34a啟動(dòng)子甲基化程度顯著高于對照組，此外，通過Kaplan-Meier存活曲線分析表明miR-34a啟動(dòng)子高甲基化與總生存率差相關(guān)(Log-Rank檢驗(yàn)，P<0.05)。Liu et al[9]研究發(fā)現(xiàn)miRNA-125a在喉癌組織和喉癌干細(xì)胞Hep-2-CSCs中低表達(dá)，且miRNA-125a可以通過靶向調(diào)控造血細(xì)胞特異性相關(guān)X-1逆轉(zhuǎn)喉癌干細(xì)胞的順鉑抗性，過表達(dá)miRNA-125a后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對多柔比星、依托泊苷、長春新堿的耐藥性大大提升。Zhou et al[10]研究表明miR-632在喉癌組織和喉癌細(xì)胞系中均表現(xiàn)為明顯上調(diào)表達(dá)，且其促進(jìn)細(xì)胞增殖和克隆形成，促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲，增強(qiáng)細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白、cyclinD1和c-myc表達(dá)，且Pearson相關(guān)分析顯示miR-632表達(dá)與喉癌組織中GSK3 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。這些異常表達(dá)miRNA發(fā)揮喉癌癌基因或抑癌基因作用，有望作為喉癌的早期診斷的新標(biāo)志物，某些miRNA更有望可以作為喉癌的新治療靶點(diǎn)。

本研究前期基于GEO獲取的喉癌組織miRNA芯片高通量數(shù)據(jù)，分析差異表達(dá)miRNA并選擇miR-133b進(jìn)行功能研究。首先，收集喉癌組織樣本，檢測表明喉癌中miR-133b表達(dá)顯著下調(diào)約4.1倍，且miR-133b的表達(dá)水平與腫瘤局部浸潤深度、是否存在區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、患者臨床分期以及組織學(xué)分級(jí)呈負(fù)相關(guān)，提示miR-133b在喉癌的發(fā)生發(fā)展中可能具有關(guān)鍵的生物學(xué)作用。其次，轉(zhuǎn)染hsa-miR-133b mimic轉(zhuǎn)染喉癌Hep-2細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞水平過表達(dá)miR-133b。本研究通過細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞侵襲等實(shí)驗(yàn)表明過表達(dá)miR-133b可以顯著抑制喉癌細(xì)胞的增殖、影響喉癌細(xì)胞周期、促進(jìn)喉癌細(xì)胞凋亡以及抑制喉癌細(xì)胞遷移，提示miR-133b在喉癌發(fā)展中扮演了抑癌基因的角色。最后，考慮到miRNA作為一種內(nèi)源性非編碼RNA，其發(fā)揮功能方式主要通過完全或者部分互補(bǔ)結(jié)合靶基因3’非翻譯區(qū)影響靶mRNA穩(wěn)定性，甚至降解mRNA，從而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。通過生物信息學(xué)預(yù)測，筆者發(fā)現(xiàn)GSTP1是miR-133b潛在靶基因之一，通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)明確其之間確實(shí)存在關(guān)系，且過表達(dá)hsa-miR-133b可以明顯下調(diào)GSTP1蛋白表達(dá)量，意味著miR-133b可能是通過調(diào)控GSTP1來發(fā)揮其在喉癌中的作用。

谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶Pl(glutathione S-transferase pi, GSTP1)，基因定位于染色體的1lql3，該基因全長約3 bp，包括6個(gè)內(nèi)含子和7個(gè)外顯子，編碼210個(gè)氨基酸，屬于谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferases, GSTs)。GSTs能催化谷胱甘肽與親電子物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，對芳香族化合物具有較高降解性[11]。諸多研究[12]表明GSTP1在預(yù)防腫瘤發(fā)生的過程中起重要作用，但同時(shí)也是腫瘤細(xì)胞對化療藥物耐受的原因，并與許多耐藥相關(guān)基因在腫瘤中共表達(dá)。在膀胱癌研究中，唐榮金 等[13]通過慢病毒表達(dá)系統(tǒng)，建立穩(wěn)定低表達(dá)GSTPl基因的膀胱癌細(xì)胞T24細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)GSTPl表達(dá)下調(diào)抑制T24細(xì)胞增殖，并其機(jī)制可能與促進(jìn)T24細(xì)胞凋亡相關(guān)。在喉癌研究中，周建榮[14]通過建立人喉鱗癌組織及其癌旁正常黏膜組織的雙向凝膠電泳圖譜，識(shí)別鑒定其差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，結(jié)果表明GSTP1在喉癌中表達(dá)上調(diào)，這與本研究中miR-133b在喉癌中表達(dá)下調(diào)，且通過靶向結(jié)合GSTP1發(fā)揮作用一致。近年來發(fā)現(xiàn)GSTP1多態(tài)性與腫瘤的易感性關(guān)系密切，有研究通過meta分析GSTP1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測在前列腺癌臨床診斷中的意義，發(fā)現(xiàn)前列腺癌GSTP1基因啟動(dòng)子區(qū)相比正常對照組呈現(xiàn)顯著高甲基化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=17.98, 95%CI:12.16～26.58,P<0.000 1)，不同亞組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[15]。Matthias et al[16]發(fā)現(xiàn)GSTP1基因型頻率在喉癌與對照中的分布情況差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該基因多態(tài)性可能與喉癌的遺傳易感性存在關(guān)聯(lián)。

綜上所述，本研究表明miR-133b通過GSTP1對喉癌Hep-2細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲行為的影響及其對腫瘤局部浸潤深度、是否存在區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、患者臨床分期以及組織學(xué)分級(jí)呈負(fù)相關(guān)等臨床意義，為將來基于miR-133b進(jìn)行喉癌臨床診斷、預(yù)后判斷及分子靶向治療提供新的思路和理論依據(jù)。