苗娜 張占英 劉紀(jì)松

萬(wàn)古霉素（vancomycin）為三環(huán)糖肽類抗菌藥物，是目前治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）感染的一線用藥[1-2]。Ye等[3]采用系統(tǒng)評(píng)價(jià)和Meta分析的方法評(píng)價(jià)了萬(wàn)古霉素治療藥物監(jiān)測(cè)（therapeutic drug monitoring，TDM）的必要性。結(jié)果顯示，萬(wàn)古霉素TDM能顯著增加臨床有效率〔優(yōu)勢(shì)比（odds ratio，OR）＝2.62，95% 可信區(qū)間（95%confidence interval，95%CI）＝1.34～5.11〕和降低腎毒性發(fā)生率（OR＝0.25，95%CI＝0.13～0.48）。因此，有必要開展萬(wàn)古霉素TDM。本實(shí)驗(yàn)旨在建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrum，HPLC-MS/MS）測(cè)定人血清中萬(wàn)古霉素的濃度。

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器 萬(wàn)古霉素標(biāo)準(zhǔn)品（純度：98%，批號(hào)：130360-201302，中國(guó)食品藥品檢定研究院提供）；萬(wàn)古霉素雜質(zhì)C標(biāo)準(zhǔn)品（純度：95%，美國(guó)Standardpharm Chemical Technology公司提供；質(zhì)控品，杭州佰勤醫(yī)療器械有限公司提供）。Waters Xevo TQ-S質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司產(chǎn)品）；Waters Acquity UPLCI -Class液相系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司產(chǎn)品）；MassLynx V4.1數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)；MS3旋渦混勻器（德國(guó)IKA公司產(chǎn)品）；TGL-16離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品）；BY-320A離心機(jī)（北京白洋醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品）。

1.2 測(cè)定條件

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Acquity UPLC-C18 1.7 μm IVD 2.1 mm×50.0 mm，流動(dòng)相A：含0.1%甲酸的水溶液，流動(dòng)相B：含0.1%甲酸的甲醇溶液，流速0.5 mL/min，柱溫為 45 ℃，進(jìn)樣量 2 μL。梯度洗脫程序（A：B）：95：5（0～0.6 min），50：50（0.6～1.5 min），5：95（1.6～2.1 min），95：5（2.1～2.5 min）。

1.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI），正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple-reaction monitoring，MRM）模式；毛細(xì)管電壓：3 kV；錐孔電壓：35 V；偏轉(zhuǎn)電壓：30 V；霧化氣溫度：500 ℃；霧化氣流量：1 000 L/Hr；反吹氣：150 L/Hr；碰撞氣流量：0.15 mL/min；各化合物監(jiān)測(cè)條件：m/z 725.6→144.1（萬(wàn)古霉素）和m/z 1 145.0→100.2（萬(wàn)古霉素雜質(zhì)C）；碰撞能量：12 V（萬(wàn)古霉素）和43 V（萬(wàn)古霉素雜質(zhì)C）。

1.3 溶液配制與樣品處理

1.3.1 萬(wàn)古霉素溶液配制 取50 mg萬(wàn)古霉素標(biāo)準(zhǔn)品于5 mL容量瓶，用50%甲醇水溶液溶解并定容，配置成濃度為10 g/L的萬(wàn)古霉素儲(chǔ)備液。用空白血清依次稀釋萬(wàn)古霉素儲(chǔ)備液，得到濃度分別為60.00、30.00、15.00、6.00、3.00和1.50 mg/L的萬(wàn)古霉素血清標(biāo)準(zhǔn)溶液。另用空白血清依次稀釋萬(wàn)古霉素儲(chǔ)備液，分裝每管100 μL，得到濃度分別為45.00、20.00和5.00 mg/L的萬(wàn)古霉素血清質(zhì)控品，置于-80 ℃冰箱保存。

1.3.2 內(nèi)標(biāo)溶液配制 取10 mg萬(wàn)古霉素雜質(zhì)C標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶，用50%甲醇水溶解并定容，配置成濃度為1.0 g/L的萬(wàn)古霉素雜質(zhì)C儲(chǔ)備液。取40 μL萬(wàn)古霉素雜質(zhì)C儲(chǔ)備液，加入20 mL乙腈，得到萬(wàn)古霉素內(nèi)標(biāo)工作液，置于-80 ℃冰箱保存。

1.3.3 血清樣品處理 血清樣本在室溫下解凍，吸取 100 μL至 1.5 mL的 EP管中，加入 300 μL內(nèi)標(biāo)工作溶液，渦旋混勻5 min，于4 ℃以11 000 r/min（離心半徑5.5 cm）離心5 min，吸取上清液50 μL至1.5 mL潔凈聚丙烯塑料管中，加入450 μL純化水，渦旋混勻5 min，于4 ℃以11 000 r/min（離心半徑5.5 cm）離心5 min，吸取上清液100 μL于96深孔板中，進(jìn)樣分析。

1.4 方法學(xué)考察

1.4.1 專屬性 分別取6份不同空白血清、萬(wàn)古霉素血清標(biāo)準(zhǔn)品和血清質(zhì)控品，按“血清樣品處理”項(xiàng)方法處理，進(jìn)樣HPLC-MS/MS分析。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限 分別取萬(wàn)古霉素血清標(biāo)準(zhǔn)品，按“血清樣品處理”項(xiàng)方法處理，最低濃度標(biāo)準(zhǔn)品平行10個(gè)樣本，其余濃度標(biāo)準(zhǔn)品各平行3個(gè)樣本，進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。以待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)（X），以待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y），用加權(quán)最小二乘法（Y＝1/X）進(jìn)行回歸計(jì)算。

1.4.3 精密度 分別取5.00、20.00和45.00 mg/L的萬(wàn)古霉素血清質(zhì)控品，按“血清樣品處理”項(xiàng)方法處理，每種濃度設(shè)6個(gè)平行樣本，在不同天數(shù)內(nèi)連續(xù)制備并測(cè)定3批標(biāo)本，進(jìn)行HPLC-MS/MS分析，計(jì)算日內(nèi)精密度和日間精密度。

1.4.4 回收率 同時(shí)分別取萬(wàn)古霉素血清質(zhì)控品，按“血清樣品處理”項(xiàng)方法處理，每種濃度平行6個(gè)樣本，進(jìn)行HPLC-MS/MS分析，樣品實(shí)測(cè)濃度與理論濃度的比值即為回收率。

1.4.5 攜帶污染 分別取60 mg/L的萬(wàn)古霉素血清標(biāo)準(zhǔn)品和空白血清各6個(gè)樣本，按“血清樣品處理”項(xiàng)方法處理，最高濃度萬(wàn)古霉素血清標(biāo)準(zhǔn)品與空白血清間隔進(jìn)樣，進(jìn)行HPLC-MS/MS分析?？瞻籽逯写郎y(cè)物峰面積與定量下限待測(cè)物峰面積相比計(jì)算待測(cè)物攜帶污染率，空白血清中內(nèi)標(biāo)峰面積與定量下限內(nèi)標(biāo)峰面積相比計(jì)算內(nèi)標(biāo)攜帶污染率。

圖1 人血清中萬(wàn)古霉素的色譜圖

表1 人血清中萬(wàn)古霉素的精密度及回收率

1.4.6 穩(wěn)定性 分別取20.00 mg/L和45.00 mg/L的萬(wàn)古霉素血清質(zhì)控品各5份，分別考察血清樣本在室溫下放置12 h和24 h、經(jīng)3次反復(fù)凍融、-80 ℃冰箱保存30 d的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.1.1 專屬性 萬(wàn)古霉素及內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間為1.47 min和1.73 min。見圖1。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限 求得直線回歸方程A＝2.12×10-1C+2.29×10-3（r＝0.999 2）。萬(wàn)古霉素的血清濃度在1.5～60.0 mg/L內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為1.5 mg/L。

2.1.3 精密度與回收率 萬(wàn)古霉素高、中、低3個(gè)濃度的日內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差和日間標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，回收率均達(dá)到80%以上。見表1。

2.1.4 攜帶污染 空白樣本萬(wàn)古霉素峰面積殘留小于定量下限萬(wàn)古霉素峰面積的20%，每個(gè)空白樣本萬(wàn)古霉素雜質(zhì)C內(nèi)標(biāo)峰面積殘留小于定量下限內(nèi)標(biāo)峰面積的5%。

2.1.5 穩(wěn)定性 萬(wàn)古霉素在室溫放置12 h和24 h、經(jīng)3次反復(fù)凍融、-80 ℃冰箱保存30 d的穩(wěn)定性良好，精密度均小于15%。

2.2 方法學(xué)應(yīng)用 測(cè)定本院住院接受萬(wàn)古霉素治療至少4個(gè)劑量以上的5例患者穩(wěn)態(tài)血藥谷濃度（下一劑量前0.5 h非輸液側(cè)采靜脈血2 mL）。萬(wàn)古霉素血藥谷濃度應(yīng)控制在10～20 mg/L，對(duì)復(fù)雜性感染（包括由MRSA引起的心內(nèi)膜炎、骨髓炎、腦膜炎、醫(yī)院獲得性肺炎等），萬(wàn)古霉素血藥谷濃度應(yīng)達(dá)到15～20 mg/L，以保證達(dá)到治療目標(biāo)和提高臨床有效率[4]。5例患者萬(wàn)古霉素血藥谷濃度分別為 10.98、10.07、4.16、14.43和13.62 mg/L。

3 討論

本試驗(yàn)在血清蛋白沉淀劑方面比較了乙腈和甲醇沉淀蛋白對(duì)萬(wàn)古霉素峰形和響應(yīng)的影響，結(jié)果顯示，甲醇沉淀蛋白后采用等比純水稀釋會(huì)發(fā)生高濃度離子抑制現(xiàn)象，故選定乙腈作為蛋白沉淀劑用純水稀釋后進(jìn)樣，這與胡偉等[5]研究結(jié)果較為一致。萬(wàn)古霉素的內(nèi)標(biāo)選擇萬(wàn)古霉素醫(yī)藥中間體雜質(zhì)C，內(nèi)標(biāo)專屬性強(qiáng)于用其他抗菌藥物作為內(nèi)標(biāo)，大大降低了檢測(cè)的假陽(yáng)性率[6]。本研究建立了一種靈敏度高、簡(jiǎn)便快速和選擇性好的HPLC-MS/MS分析方法，極大簡(jiǎn)化了操作流程，適用于萬(wàn)古霉素的大批量血藥濃度監(jiān)測(cè)。從臨床樣本萬(wàn)古霉素血藥濃度監(jiān)測(cè)的結(jié)果看，萬(wàn)古霉素的谷濃度存在顯著的個(gè)體差異，因此基于谷濃度調(diào)整萬(wàn)古霉素給藥方案具有顯著的臨床意義。