譚艷芳 黃小平 姜濤 歐陽文獻 唐蓮 李雙杰

病毒感染后免疫異常是EB病毒（EB virus，EBV）相關(guān)感染性疾病的重要發(fā)病機制，免疫細胞表面表達的多種免疫抑制因子可抑制免疫細胞的增殖及活化、下調(diào)免疫反應(yīng)從而達到免疫抑制的作用[1]。本項目以健康兒童和傳染性單核細胞增多癥（infectious mononucleosis，IM）患兒為研究對象，動態(tài)監(jiān)測免疫抑制檢測點〔如程序性死亡受體-1（programmed death 1，PD-1）及其配體（PD-L1）、細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原-4（cytotoxic T lymphocyte antigen 4，CTLA-4）、含T細胞免疫球蛋白和ITIM結(jié)構(gòu)域蛋白（T cell Ig and ITIM domain，TIGIT）〕在IM發(fā)病機制中的作用，為臨床治療提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2017年4月—9月湖南省兒童醫(yī)院59例IM住院患者，分別于急性期和恢復(fù)期抽血，并簽署知情同意書。另選本院20例健康體檢兒童作為正常對照組，無EBV感染癥狀和體征，肝臟生化指標正常，按性別、年齡匹配。

1.1.1 IM診斷標準 IM診斷符合《兒童主要非腫瘤性EB病毒感染相關(guān)疾病的診斷和治療原則建議》[2]，既往無 EBV 感染史。

1.1.2 排除標準 合并其他器官基礎(chǔ)疾病者及不合作者。

1.1.3 實驗室確診病例 符合下列臨床指標中任意3項及實驗室指標中第1～3項中任意一項。

1.1.3.1 臨床指標 ① 發(fā)熱；② 咽峽炎；③ 頸部淋巴結(jié)腫大；④ 脾臟腫大；⑤ 肝臟腫大；⑥ 眼瞼水腫。

1.1.3.2 實驗室指標 ① 抗EBV-衣殼蛋白（viral capsid antigen，VCA）-免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）和抗EBV-VCA-IgG抗體陽性，且抗EBV核心抗原（EB nuclear antigen，EBNA）-免疫球蛋白G（IgG）陰性；② 抗EBV-VCA-IgM抗體陰性，但抗EBV-VCA-IgG抗體陽性，且為低親和力抗體；③ 雙份血清抗EBV-VCA-IgG抗體滴度升高4倍以上；④ 外周血異型淋巴細胞比例≥0.10和（或）淋巴細胞計數(shù)（lymphocyte，Lym）升高（≥5.0×109/L）。

1.1.4 IM表現(xiàn)

1.1.4.1 急性期 有發(fā)熱、咽峽炎、頸部淋巴結(jié)腫大、肝脾腫大，白細胞計數(shù)升高（＞10×109/L）。

1.1.4.2 恢復(fù)期 體溫正常持續(xù)1周以上和（或）發(fā)病2周以上、無咽峽炎、肝臟縮小等臨床癥狀緩解。

1.2 實驗方法

1.2.1 臨床資料收集 詳細記錄臨床各項資料，包括基線資料，如姓名、性別、年齡、熱程（患者發(fā)熱以腋溫≥37.5 ℃為標準，從第1天開始計算，到體溫恢復(fù)正常并穩(wěn)定48 h為止；第2天08：00有發(fā)熱則記為發(fā)熱1 d，無發(fā)熱則不計入內(nèi)）以及肝臟腫大（4歲以下為2 cm以上、4歲以上為可觸及）、脾臟腫大（肋下1 cm以上）、轉(zhuǎn)氨酶升高〔丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶＞40 U/L和（或）天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶＞40 U/L〕、EBV-DNA定量（＞400拷貝/mL為升高）等臨床癥狀、體征和實驗數(shù)據(jù)。

1.2.2 EBV抗體檢測 抽取靜脈血2 mL，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測定EBV的4種抗體，包括早期抗原（early antigen，EA）-IgG、VCA-IgM、VCA-IgG和EBNA-IgG。

1.2.3 EBV-DNA含量 標本為血漿或血清，采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)進行檢測（正常參考范圍：＜400拷貝/mL）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）〔M（QR）〕表示；兩變量間相關(guān)性分析，符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用Pearson相關(guān)分析，符合非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用Spearman相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 59例IM患者中男性35例（59.3%）、女性24例（40.7%）；年齡1歲1個月～10歲10個月；平均熱程（6.02±3.40）d；59例中有34例于恢復(fù)期抽血復(fù)查（其余25例患兒因檢測血標本不合格或出院時未抽血），故IM恢復(fù)期組共納入34例。各組年齡、性別比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），說明有可比性。

2.2 3組免疫抑制因子表達水平比較 與正常對照組比較，IM患者急性期組PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIGIT在B淋巴細胞上表達水平均明顯升高（P＜0.05）；在IM恢復(fù)期組上述各指標均有所恢復(fù)，其中PD-L1、TIGIT與正常對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.05）。且恢復(fù)期組 PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIGIT與急性期組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見表1。

表1 各組免疫抑制因子在外周血B淋巴細胞上表達水平的比較〔M（QR）〕

2.3 免疫抑制因子在IM患者外周血B細胞上的表達水平與EBV-DNA定量的相關(guān)性 共59例急性期患兒查EBV-DNA，平均為（8.44±2.04）×105拷貝/mL。相關(guān)性分析顯示，EBV-DNA定量與PD-1、PD-L1和CTLA-4表達無相關(guān)性，但與TIGIT表達呈明顯正相關(guān)。相關(guān)性分析公式如下：Y＝-235 242.276+45 480.922X（r＝0.371，P＝0.006）。見表 2，圖 1。

表2 免疫抑制因子在IM患者外周血B細胞上表達水平與EBV-DNA定量的相關(guān)性

圖1 TIGIT在IM患者B細胞上的表達水平與EBV-DNA定量的相關(guān)性

3 討論

IM是由EBV原發(fā)感染引起的急性感染性疾病，臨床上以發(fā)熱、咽喉痛、眼瞼浮腫、肝脾和淋巴結(jié)腫大及外周血出現(xiàn)異型淋巴細胞等為特征，臨床不典型病例逐漸增多，給診斷和治療帶來一定的困難。EBV主要累及B淋巴細胞和T淋巴細胞，受感染的B淋巴細胞表明抗原發(fā)生變化，生成EBV特異性抗原，引起T淋巴細胞免疫應(yīng)答而轉(zhuǎn)化為CD8+T細胞，CD8+T細胞能殺傷感染的B細胞，有效清除EBV，從而導(dǎo)致IM一系列臨床癥狀呈自限性[3]。

以往研究顯示，免疫細胞表面存在正性刺激因子和免疫抑制因子表達，其相互維持免疫應(yīng)答和免疫耐受，如果免疫抑制因子過表達，與相應(yīng)受體結(jié)合后，就會產(chǎn)生抑制性信號，從而下調(diào)免疫應(yīng)答[4]。另外，嬰幼兒時期IM典型病例很少，主要原因是嬰幼兒不能對EBV產(chǎn)生充分免疫應(yīng)答，因此，宿主的免疫應(yīng)答在病毒清除過程中起著非常重要的作用。

PD-1主要在激活的T淋巴細胞和B淋巴細胞中表達，功能是抑制細胞的激活，從而使細胞呈無反應(yīng)性。PD-L1是其配體，在病毒感染、腫瘤及某些免疫系統(tǒng)疾病患者中表達上調(diào)，形成免疫紊亂[5]。研究表明，PD-1與PD-L1結(jié)合在慢性乙型肝炎病毒感染中可以抑制效應(yīng)T細胞的增殖和活化，同時抑制細胞因子分泌，為HBV逃避免疫應(yīng)答發(fā)揮重要作用[6]。本研究還顯示，PD-1/PD-L1在IM急性期表達上調(diào)，形成免疫抑制，而在恢復(fù)期較之前下降，為細胞免疫功能的恢復(fù)發(fā)揮正向作用，進一步造成病毒清除，這與IM的發(fā)病進程相符，由此推測PD-1/PD-L1可能在EBV復(fù)制和清除中發(fā)揮作用。

CTLA-4是T細胞上的一種跨膜受體，與B7分子結(jié)合后，能誘導(dǎo)T細胞無反應(yīng)性，參與免疫反應(yīng)的負調(diào)節(jié)，抑制細胞免疫和體液免疫反應(yīng)[7]。Kared等[8]報道CTLA-4在慢性丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）患者外周血特異性CD4+T淋巴細胞上顯著表達，從而抑制其活化，在使用相關(guān)阻斷劑后特異性CD4+T淋巴細胞功能得以恢復(fù)，證實CTLA-4高表達參與HCV持續(xù)感染。本研究表明，CTLA-4在IM急性期表達上調(diào)，推測其與配體結(jié)合后產(chǎn)生抑制性信號，誘導(dǎo)機體免疫耐受，從而促進EBV清除。

TIGIT是一種新發(fā)現(xiàn)的免疫球蛋白超家族成員，主要表達于活化的免疫細胞表面，包括B淋巴細胞、T淋巴細胞、輔助性T細胞和NK細胞等。有研究顯示，TIGIT可直接作用于T細胞，抑制T細胞活化，也可與抗原提呈細胞上的PVR結(jié)合，增強其分泌抗炎因子白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10），從而抑制 T 細胞應(yīng)答[9]。Fromentin 等[10]的研究表明，CD4+T細胞單個或聯(lián)合表達PD-1、TIGIT、LAG-3在抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療中導(dǎo)致人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染持續(xù)加重。本研究顯示，IM患者急性期有TIGIT表達，通過與恢復(fù)期34例IM患者自身對照比較發(fā)現(xiàn)，急性期TIGIT在B細胞上的表達水平高于恢復(fù)期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，這與前面的研究結(jié)果相符。推測TIGIT在病毒的急性感染狀態(tài)下過表達，造成免疫失調(diào)，隨著疾病恢復(fù)和病毒逐漸被清除，機體免疫功能趨于正常，其表達量也隨之下降，以上研究表明免疫細胞表面的TIGIT表達可能與IM疾病進展相關(guān)。

歐陽文獻等[11]報道全血EBV-DNA拷貝數(shù)在疾病恢復(fù)后會持續(xù)很長一段時間，故不建議判斷IM病情時檢測全血標本，宜使用血清或血漿標本，故本研究亦如此。已有研究顯示，EBV-DNA定量與IM病情的嚴重程度有一定的相關(guān)性，有助于該病的診斷[12]。免疫反應(yīng)失調(diào)可能造成EBV免于被自動清除，從而導(dǎo)致該病毒不斷復(fù)制，甚至出現(xiàn)慢性感染的狀態(tài)，由此估計細胞表面的免疫抑制因子過表達使其免疫應(yīng)答下調(diào)，與EBV-DNA定量升高有關(guān)。因此本研究檢測TIGIT在B淋巴細胞上的表達率并分析其與EBV-DNA定量的相關(guān)性，結(jié)果顯示TIGIT在B細胞上的表達水平與EBV-DNA定量呈正相關(guān)，同時還顯示，TIGIT在IM急性期表達明顯上調(diào)，形成免疫失調(diào)，最終導(dǎo)致EBV不能被有效清除，使EBV-DNA定量升高。當然，由于樣本量有限，仍需進一步擴大樣本量驗證該結(jié)果。本研究也顯示，IM患者EBV-DNA定量越高，其臨床癥狀越重，與以往研究結(jié)果一致。TIGIT是否可以作為重癥IM的預(yù)測指標，后續(xù)實驗還將進一步深入研究探索。