李 超，馬 帥，徐守振

（1. 中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2. 青島市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山東青島 266100；3. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東青島 266109）

犬副流感病毒感染（Canine parainfluenza virus infection）是由犬副流感病毒（Canine parainfluenza virus，CPIV）引起的，以卡他性鼻炎和急性支氣管炎為病理特征的一種犬接觸性病毒性傳染病，主要表現(xiàn)為噴嚏、咳嗽以及流黏液性鼻涕等急性呼吸道炎癥[1]。根據(jù)國際病毒分類委員會(huì)最新分類標(biāo)準(zhǔn)，CPIV為副黏病毒亞科茹布拉病毒屬成員[2]。CPIV首先由Binn從患呼吸道病的犬中分離獲得。目前，CPIV感染在世界各國普遍存在，是危害犬業(yè)的重要傳染病之一[3]。

CPIV基因組主要編碼6種蛋白：大蛋白（ L）、血凝素神經(jīng)氨酸酶（HN）、核衣殼蛋白（NP）、融合蛋白（F）、磷蛋白（P） 和基質(zhì)蛋白（M），其中HN和F 蛋白突出于囊膜形成纖突，分別介導(dǎo)病毒吸附和穿入細(xì)胞[4]，而F蛋白是產(chǎn)生中和抗體的主要保護(hù)性抗原，在病毒免疫中占有重要地位，由其誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)能夠阻止病毒感染[5]，故分離鑒定CPIV流行毒株，分析F蛋白基因序列的遺傳變異情況，對(duì)于CPIV感染的綜合防控具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病料樣品 樣品來自2015年江蘇省射陽縣某規(guī)?；雀袢B(yǎng)殖場(chǎng)送檢的，臨床表現(xiàn)呼吸道癥狀的病死比格犬，經(jīng)膠體金試紙檢測(cè)鼻腔拭子為CPIV陽性。無菌采集病死犬腦、肺臟等組織樣品，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 瓊脂糖、氯仿、無水乙醇、EDTA、溴酚蘭：購自天津化學(xué)試劑三廠；RNA酶抑制劑、Taq DNA聚合酶、dNTP、2 000 bp DNA Marker、PMD19-T載體試劑盒：購自大連寶生物工程有限公司；DMEM、胎牛血清：購自GIBCO公司；反轉(zhuǎn)錄酶、EasyPure Viral DNA/RNA提取試劑盒：購自北京全式金生物技術(shù)有限公司公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒：購自O(shè)MEGA公司。

1.1.3 細(xì)胞 0.5%雞紅細(xì)胞懸液、Marc-145細(xì)胞：本實(shí)驗(yàn)室制備和保存。

1.1.4 儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、紫外凝膠成像系統(tǒng)、組織勻漿機(jī)、B2型生物安全柜、高速冷凍離心機(jī)、PCR擴(kuò)增儀、低速離心機(jī)、掌上離心機(jī)、37 ℃恒溫水浴鍋、微波爐、冰箱、超低溫冰柜（-80 ℃）、萬分位分析天平、核酸電泳擴(kuò)增儀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病料處理準(zhǔn)備 將無菌采集的病死犬腦和肺臟樣品，加入DMEM溶液后充分研磨，再加入1%雙抗，制成10%的懸液；將病料研磨液反復(fù)凍融3次，5 000 r/min 4 ℃離心20 min，取上清液，過濾除菌后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病毒分離 將Marc-145細(xì)胞復(fù)蘇、傳代，在細(xì)胞傳代后約22 h進(jìn)行病毒分離。分離方式：采用5%比例吸附接種，置37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中吸附2 h，棄掉病料上清液，換含2%胎牛血清的維持液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)胞病變情況，盲傳3代；將每代的細(xì)胞培養(yǎng)液均保存于-80 ℃。設(shè)未接種病料組織研磨液上清的Marc-145細(xì)胞作為對(duì)照，采用第3代盲傳的細(xì)胞培養(yǎng)液上清進(jìn)行病毒鑒定。

1.2.3 雞紅細(xì)胞凝集特性試驗(yàn)鑒定 取SPF雞血液，制備0.5%的新鮮雞紅細(xì)胞懸液；將細(xì)胞培養(yǎng)物（F3）反復(fù)凍融3次后，離心取上清液，參考文獻(xiàn)[6]，采用微量法，4 ℃條件下，在96孔V型板上對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物上清進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（HA），測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)雞紅細(xì)胞的血凝特性及病毒血凝效價(jià)，同時(shí)以正常細(xì)胞液作對(duì)照。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)物RT-PCR鑒定 參照文獻(xiàn)[3-8]建立的CPIV RT-PCR鑒定方法，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成可擴(kuò)增NP蛋白的基因引物CPIV-1/CPIV-2；取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用EasyPure Viral DNA/RNA提取試劑盒提取病毒RNA，并進(jìn)行RT-PCR鑒定。同時(shí)設(shè)陽性對(duì)照組（梅里亞犬副流感病毒活疫苗株）及陰性對(duì)照組。

1.2.5 F蛋白全基因RT-PCR擴(kuò)增及測(cè)序 參照文獻(xiàn)[5]合成CPIV F蛋白全基因擴(kuò)增引物CPIV-P/CPIV-F（表1），采用RT-PCR方法進(jìn)行F蛋白全基因擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物連接載體后送至北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

表1 本試驗(yàn)應(yīng)用的引物序列

1.2.6 F蛋白全基因核苷酸同源性分析 從GeneBank下載CPIV參比序列（表2），采用MegAlign軟件，將參比毒株與分離株的F蛋白全基因序列進(jìn)行核苷酸的同源性分析。

表2 CPIV參比毒株詳情

1.2.7 F蛋白全基因遺傳進(jìn)化分析 將參比序列與分離株序列導(dǎo)入MEGA5.1軟件，采用最大擬然法繪制遺傳發(fā)育進(jìn)化樹，進(jìn)行F蛋白全基因遺傳進(jìn)化分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞病變觀察

病料上清采用單層吸附接種于猴腎Marc-145細(xì)胞后，在盲傳至第3代時(shí)，出現(xiàn)較為明顯的細(xì)胞病變（CPE），具體表現(xiàn)為細(xì)胞邊緣不清晰、拉網(wǎng)、聚堆等，而未接種病料上清的Marc-145細(xì)胞，培養(yǎng)96 h后仍生長良好，邊緣清晰，形狀統(tǒng)一（圖1）。將第3代細(xì)胞培養(yǎng)物上清置于-80 ℃冰箱凍存，做病毒鑒定。

圖1 Marc-145細(xì)胞的細(xì)胞病變效應(yīng)

2.2 雞紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)鑒定

雞紅細(xì)胞凝集鑒定結(jié)果顯示：4 ℃條件下，Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)物液上清可對(duì)0.5%的新鮮雞紅細(xì)胞懸液產(chǎn)生顯著的凝集作用，病毒血凝（HA）效價(jià)為26，未接種病料上清液的正常細(xì)胞液不產(chǎn)生雞紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。

2.3 RT-PCR鑒定

細(xì)胞培養(yǎng)物上清液經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，取 PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，可見細(xì)胞培養(yǎng)上清液與陽性對(duì)照在約667 bp處出現(xiàn)明亮條帶，而陰性對(duì)照無明顯條帶（圖2），表明成功分離到1株CPIV，將其命名為CPIV-D121004。

圖2 細(xì)胞培養(yǎng)上清液RT-PCR鑒定

2.4 F蛋白全基因擴(kuò)增

對(duì)CPIV F蛋白全基因測(cè)序引物進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增，取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，可見在約1 825 bp處出現(xiàn)明亮單一條帶（圖3），顯示成功擴(kuò)增出CPIV-D121004 株的 F蛋白全基因。

2.5 F基因核苷酸同源性分析

圖3 F蛋白全基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖4 CPIV-D121004與參比毒株的F基因核苷酸同源性分析結(jié)果

F基因同源性分析結(jié)果顯示，分離株CPIV-D121004F基 因 與FC毒 株（2007年，登錄號(hào)EF546392.1）核苷酸同源性最高，為99.5%，與我國的FA毒株（2007年，登錄號(hào)EF487542.1）核苷酸同源性為99.3%，與韓國的毒（CDV）、犬細(xì)小病毒（CPV）、CPIV的多重PCR方法。這些方法的特異性、靈敏性和重復(fù)性均較好，為CPIV的分離鑒定及流行病學(xué)調(diào)查奠定了基礎(chǔ)。CPIV具有凝集雞紅細(xì)胞的能力，與其他具有血凝性的病毒不同，它需要在4 ℃條件下進(jìn)行。閆喜軍等[10]采用HA/HI試驗(yàn)進(jìn)行CPIV血清抗體流行病學(xué)調(diào)查，證明4 ℃條件下可以進(jìn)行CPIV的快速鑒定試驗(yàn)。CPIV可在Vero、Marc-145等細(xì)胞中良好生長，相對(duì)于CDV而言，CPIV較容易通過細(xì)胞接種分離獲得，方便進(jìn)一步研究。

F蛋白是CPIV的主要保護(hù)性抗原，其基因的遺傳變異對(duì)于CPIV 預(yù)防有著重要影響，特別是重要抗原位點(diǎn)的變化可能會(huì)導(dǎo)致疫苗免疫保護(hù)1168-1毒株（2009年，登錄號(hào)AF014953）核苷酸同源性為99.0%；與韓國的D277毒株（2008年，登錄號(hào)KC237065.1）同源性最低，為96.0%。總體來說，該分離毒株的F基因相對(duì)保守，與其他參考毒株的核苷酸同源性普遍較高。詳細(xì)分析結(jié)果見圖4。

2.6 F基因遺傳進(jìn)化分析

遺傳進(jìn)化分析顯示，CPIV-D121004與2007年的FC毒株（登錄號(hào)EF546392.1）遺傳關(guān)系最近。兩毒株與2007年分離自我國的FA毒株（登錄號(hào)EF487542.1），與1980年分離自美國的CPIV+（登錄號(hào)JQ743320.1）、CPIV-（登錄號(hào)JQ743320.1）毒株，以及與2009年分離自韓國的1168-1毒株（登錄號(hào)AF014953）共同組成一小分支，在進(jìn)化樹上形成一簇（圖5）。

3 討論

圖5 分離毒株與參比毒株F基因序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

劉騰飛[3]、趙國清等[6]、王鳳雪等[7]、康泰等[8]、簡子健等[9]先后建立了針對(duì)CPIV的特異性RT-PCR檢測(cè)方法，以及針對(duì)犬瘟熱病不全面[4]。本試驗(yàn)對(duì)CPIV-D121004株F基因與參考毒株進(jìn)行了同源性分析，并基于F基因繪制了遺傳進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)CPIV-D121004的F基因相對(duì)保守，與其他參考毒株的核苷酸同源性普遍較高，這與孫明等[4]、閆喜軍[5]等研究結(jié)果一致。遺傳進(jìn)化分析顯示，CPIV-D121004與分離自我國的CPIV-FA毒株（2007年，登錄號(hào)為EF487542.1）和疫苗毒株CPIV-FC（2007年，登錄號(hào)為EF546392.1）處于同一個(gè)進(jìn)化分支，說明該分離株未出現(xiàn)大的遺傳變異。下一步需要對(duì)分離株的免疫原性進(jìn)行研究，探究其是否具有作為候選疫苗株的潛力。

近年來，隨著生物醫(yī)藥的蓬勃發(fā)展，比格犬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在醫(yī)藥評(píng)價(jià)中的作用日益顯著。CPIV對(duì)比格犬的危害程度雖不如CDV和CPV嚴(yán)重，但是該病毒感染犬后，可使機(jī)體抵抗力顯著降低，出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、流涕等臨床癥狀，繼而容易導(dǎo)致巴氏桿菌、大腸桿菌等其他病原菌侵入而發(fā)生感染[11]。CPIV是秋冬季節(jié)誘發(fā)比格犬呼吸道癥狀的主要病原體，但抵抗力不強(qiáng)，在酸堿環(huán)境中易被破壞而失活，一般的常見消毒藥均可將其殺死，因此當(dāng)暴發(fā)CPIV誘發(fā)的犬呼吸道傳染病時(shí)，應(yīng)及時(shí)做好環(huán)境消毒工作，防止細(xì)菌繼發(fā)感染。